克隆 ABCC6cDNA、正向引物 5 ′ -CACCATGGCCGCGCCTGCTG - 3 ′ 和反向引物 5 ′ -TCAGACCAGGC-CTGACTCCTG - 3 ′ 旨在克隆PCR钝端产品pcDNA 3.1 d / V5-His-TOPO表达载体(表达载体)。PCR进行使用人类肝cDNA和铂PCR SuperMix(表达载体)。进行PCR ptc - 100珀尔帖热循环(MJ研究),它由1周期 95年 ° C 2分钟,30个周期 94年 ° C 45秒, 62年 ° C 1分钟, 68年 ° C 5分钟和30秒 68年 ° C 10分钟。PCR产品从琼脂糖凝胶分离、纯化与MinElute凝胶萃取工具包(试剂盒)和结扎成pcDNA.3.1D / V5-His-TOPO表达载体。重组向量转化为全球大肠杆菌细胞。个人克隆培养过夜Luria Bertani与100年汤 μ g / mL氨苄青霉素,质粒是孤立使用QIAprep旋转Miniprep工具包(试剂盒)。

从使用GenElute哺乳动物培养细胞总RNA提取总RNA Miniprep工具包(σ)。逆转录之前,总RNA浓度测量与GeneQuant pro (Amersham国际,小都,英国)和RNA完整分析了紫外线照射下的可视化28 s - 18 s rrna乐队1.5%琼脂糖凝胶含有溴化乙锭。完整的RNA (1 μ g)是使用GeneAmp反向转录的RNA PCR核心装备应用生物系统公司与特定ABCC6基因引物,亲逆转录酶,根据制造商的指示。逆转录酶转录反应没有进行消极的控制在随后的PCR反应。

扩大地区从外显子18到25外显子我们使用以下引物: 5 ′ -GGCATGAATCTCTCCGGAG - 3 ′ (外显子18正向引物) 5 ′ -CTGGAGGGCAGCAGAGAC - 3 ′ (反向引物的外显子25)。PCR进行人类肝脏和肾脏cDNA和互补脱氧核糖核酸的细胞培养。PCR是1的循环 95年 ° C 2分钟;30的周期 94年 ° C 45秒, 58 ° C 1分钟, 72年 ° C 2.5分钟, 72年 ° C 10分钟。一个整除的扩增子被溴化乙锭可视化分析1.5%的琼脂糖凝胶评估片段的大小,从凝胶纯化,直接测序。

ABCC6基因重组向量序列的验证使用BigDye终结者v3.1循环测序工具包(应用生物系统公司)。3100的基因分析仪的样品进行了分析(应用生物系统公司)根据生产的建议。的互补序列ABCC6 ABCC6及其剪接变体 Δ 19 Δ 24已经沉积在IDs AM774324和AM711638基因库,分别。扩增的PCR产物序列通过exon18-exon25地区从细胞培养和人类肝脏和肾脏cDNA已经由MWG生物技术。

免疫印迹分析MRP6表达,整个细胞溶解产物是孤立的。PMSF HEK293补充了蛋白酶抑制剂(0.1毫米,5 μ g / mL抑肽酶,5 μ g / mL亮抑酶肽,1 μ g / mL抑肽素)在1200转离心5分钟。1毫升的颗粒是resuspended冰冷里帕缓冲区(PBS, Igepal ca - 630 1%,钠脱氧胆酸盐0 5%,SDS 0.1%)和孵化冰30分钟;通过声波降解法进一步破坏。声波降解法后,溶解产物是孵化冰上30分钟然后在000 xg离心10分钟 4 ° C 。蛋白质与见得的丙酮沉淀 − 20. ° C o / n, resuspended Laemmli缓冲区,通过sds - page分离(7%)。后来,electrotransfer Immobilon-P转移膜(微孔,贝德福德,质量。,证实了我们)可逆与朱红色红染色。20分钟后在孵化缓冲区(IB)(50毫米三,150毫米氯化钠,0,5% Tween-20),膜孵化了1小时多克隆人类抗体,提高对人类MRP6 amminoacids 1 - 70(圣克鲁斯生物技术有限公司),稀释1:400 IB。后三个洗液洗涤缓冲(WB)(50毫米三,150毫米氯化钠),膜被孵化的辣根过氧化物酶共轭山羊antirabbit抗体(σ免疫化学,圣路易斯,密苏里州,美国),稀释1:5000 IB。最后,这个污点洗了三次与世行和蛋白质可视化发射极耦合逻辑(Immun-Star合,Biorad,赫拉克勒斯,加利福尼亚州,美国)。