文摘

在目前的研究中,生产潜力的伽马氨基丁酸(GABA)使用短乳PML1调查。此外,微生物生存在人检查,ROGOSA,沙普(夫人)在100年接受高的静水压力后,200年,和300 MPa 5, 10, 15分钟。响应面方法(RSM)应用于优化GABA的生产条件以及细菌生存能力。方差分析(方差分析)表示,两个独立变量(压力和时间)显著影响依赖的(GABA和细菌生存能力)( )。最大化的最佳提取条件GABA的生产包括300 MPa的压力和15分钟的时间。化合物的数量是量化使用薄层色谱法(TLC)和分光光度法。流程优化,中心复合设计(CCD)创建使用设计专家5复制中心点,即获得GABA含量最高的是397.73 ppm证实了高效液相色谱法(HPLC)。此外,扫描电子显微镜(SEM)是用来观察微生物的形态学变化。结果显示,不仅短乳PML1 GABA在常规条件下的生产潜力(控制样本)而且这种生物活性化合物的内容可以提高通过优化生产参数。

1。介绍

GABA是四碳非蛋白氨基酸中发现细菌、植物和脊椎动物(1]。广泛分布在自然界,起着关键作用作为一种抑制性神经递质在中枢神经系统的脊椎动物(2]。这种生物活性化合物,许多生理活动,结合其特定受体位于神经元的突触后膜。通过阻止一些神经信息的透光率,GABA是有效抑制压力,治疗失眠(3),抑制抑郁(4,5),改善长期记忆(6),调节血压(7大脑中,加速蛋白质合成(8]。可以使用此非蛋白氨基酸在一定剂量在不同的产品,如药物、口香糖、糖果和饮料(没有任何副作用9,10]。直接添加化学食品GABA是不利的,因为被合成和不安全,费用高,能耗高,在产品和生产的副作用。因此,GABA的自然生产可以介绍另一种方法。同时,GABA的数量实在是太微不足道了,植物,动物,和自然产品,如奶酪、绿茶、水稻芽,和糙米。因此,研究人员正在寻找新方法GABA的大规模生产。合理的生产氨基酸的生物合成方法吸引了更多的关注比其他的11,12]。

尽管许多微生物能产生GABA,科学家们集中在GABA-producing乳酸菌(实验室)近年来,因为他们是安全的,除了他们的应用程序在食品工业中,他们有特定的生理活动,可以与环境兼容的(13,14]。此外,存在谷氨酸脱羧酶(GAD)在一些实验室已经提高了它们的重要性在GABA生产(15]。广泛性焦虑症是一种独特的酶催化分离的羧基谷氨酸并将其转换为伽马氨基丁酸。这种酶带来不可逆L-glutamate转化为GABA (16]。GABA-producing实验室中,乳酸菌可用于GABA生产,其中短乳是一个主要的。这是一个安全的革兰氏阳性物种广泛用作益生菌菌株在发酵食品的生产17,18]。

考虑到信息和生产的重要性GABA的非蛋白化合物在食品和制药行业,发现一个有效的治疗方法,可以产生这种物质的生产是非常重要的在食品行业或在医学和制药科学(19]。

如今,消费者对高质量食品的需求的上升有食品行业关注非热能的技术(19,20.]。高压处理(HPP)或高静水压力(水马力)是一个最重要的非热能的方法来延长食品的保质期,由于微生物的失活21,22]。同时,水马力并不局限于巴氏灭菌和灭菌。也应用于提取目的(特别是生物活性化合物的提取)和加速度驱逐的胞内组件(23,24]。在利用压力低于致命的限制,水马力会导致压力对微生物及其代谢产物的分泌改变,从而提高提取效率的代谢物25,26]。

RSM是一系列的数学和经验技术用于调查一些变量的影响在一个过程或产品的性能和质量与复杂过程的建模和优化的目的。RSM大大使用由于其优化精度高以及减少实验成本。这种方法主要用于检查,二次,互动的独立变量对响应的影响。

本研究的目的,作为一个小说的研究,是优化GABA的条件提取的益生菌菌株短乳PML1通过RSM和达到最高产量的GABA生产。

2。材料和方法

2.1。微生物激活

短乳PML1, Tarkhineh隔绝,从微生物提供收集部门的食品科学与技术、农业、学院·马什哈德大学。琼脂夫人和太太肉汤(德国默克有限公司)是用于激活的微生物7]。

2.2。样品制备

激活,冻干的细菌都被转移到无菌汤夫人由agar12 g / l,柠檬酸氢二铵2 g / l,酵母提取物5 g / l, 20 g / l d -葡萄糖,磷酸氢二钾2 g / l,醋酸钠5 g / l,硫酸镁0.1 g / l,肉汁5 g / l,普遍蛋白胨10 g / l,硫酸锰0.05 g / l。随后,细菌在30°C孵化24小时(7]。后来,微生物悬浮液制备的吸光度值0.08 600海里(相当于0.5麦克法兰)。

2.3。高的静水压力和GABA生产

以微生物施加压力,增加GABA的生产产量,水马力机(研究食品科学与技术研究所、马什哈德、伊朗)使用,操作压力600 MPa。初步实验后,100年的压力水平,200年和300 MPa,持续时间5、10和15分钟被选择。应该注意的是,下面的施加压力被认为是致命的微生物限度。流程优化,创建一个CCD使用设计专家(v 7.0.0)在中心点(表5复制1)。为了发挥水马力,准备微生物悬浮(相当于0.5麦克法兰)涌入1.5毫升超小型电子管和暴露在不同的治疗方法。一个非承压的样本被认为是控制。

为了探讨GABA的水马力生产的影响短乳以及验证细菌的生存能力,发挥水马力后,1毫升每个微生物悬挂被转移到包含5毫升无菌的猎鹰汤夫人和孵化30°C 72 h (11,27]。控制在不施加水马力也经历了同样的过程。

2.4。加压细胞的生存能力

为了研究水马力在细菌数的影响,微生物的总数进行使用琼脂夫人。为此,连续稀释前后从微生物悬浮液准备发挥水马力和72 h后孵化。夫人琼脂培养后,板块在37°C孵化48 h。最后,形成殖民地被数的计算使用菌落计数器(28,29日]。

2.5。评价GABA的生产

2.5.1。检查GABA生产用TLC和分光光度法

鉴于GABA代谢物是微生物细胞,分泌出上层清液是用去除细菌颗粒后确定GABA产生。为此,72 h的孵化后,微生物悬浮在861 g离心10分钟。在那之后,得到的上层清液过滤是0.22μm过滤器来消除可能的微生物。薄层色谱应用于评估GABA含量。为此,一条水平线是用铅笔在2厘米距离活性硅胶板的底部(60 F254)。点是每隔1厘米。随后,使用毛细管,2μl(每个样本(纯GABA,控制和上层清液含GABA)拍摄点,发现。点干后,板放置在溶剂(蒸馏水:丁醇乙酸(2 ml: 5毫升:2毫升))。增加溶剂后板的长度约8厘米,茚三酮溶液(茚三酮:丁醇:醋酸(0.75 g: 50毫升:1.5毫升))被喷洒到盘子里,然后放入烤箱80分钟的100°C。乐队的出现后,面临的GABA减少,分别溶解在乙醇75%,硫酸铜0.6%的解决方案(38 ml: 2毫升)。接下来,混合物被放在一个摇晃孵化器(50克)在40°C 60分钟。之后,每个样品的吸光度值为512 nm使用分光光度计(UV 1800日本岛津公司,日本)。后来,每个样本的GABA含量量化使用获得的方程。为了绘制标准曲线,实现各自的方程,纯GABA准备在不同浓度(100、200、400、800和1000 ppm),进行打点TLC板,每个点的吸光度值测量spectrophotometrically如上所述。通过应用标准曲线的吸光度值,下列方程( )获得了决定系数( )0.96 (30.]。

2.5.2。确认GABA含量的高效液相色谱法

在分析获得的数据通过RSM和优化过程,最优样本量化的GABA含量用高效液相色谱法验证结果TLC和分光光度法1]。最优样本离心机在861克15分钟,和上层清液通过0.22μm过滤器。滤液与碳酸氢钠混合比率的0.2毫米9:1, 。后添加的derivatizer丹磺酰氯浓度的8 g / l,样品一直在黑暗中在30°C。准备和衍生化后的GABA水平在150年,350年和750 mg / l,高效液相色谱法进行了使用列18和紫外探测器在254 nm (8]。为了完成标准曲线的线性回归方程,GABA的三个内部标准(150、350和750 ppm)注入到列,和下面的方程( )实现了一个0.99 (9]。

2.6。调查的结构变化后的细菌,使用SEM水马力

为了验证水马力的影响细菌细胞的结构,观察形态变化的控制和最优样本,他们首先离心机。获得的颗粒干燥后,他们用2.5%戊二醛固定化(美国Sigma-Aldrich)磷酸盐缓冲剂0.1米( )在室温下1 h。接下来,样本冲洗两次磷酸盐缓冲剂。二次固定,它们将和四氧化锇2% (Proxytech、澳大利亚)相同的缓冲和温度为30分钟。三次洗涤后的缓冲区,样本与乙醇浓度的30日干50、70年、80年和100年( )和涂上一层黄金。最后,他们用扫描电子显微镜观察(LEO-Germany vp - 1450) [31日]。

3所示。结果与讨论

3.1。评估GABA生产(TLC)

有许多GABA的主要检测方法;然而,他们并不认为是可取的,因为是昂贵和费时的。薄层色谱适用于大量样品的同时检查。同时,它不需要昂贵的设备,因此建议GABA含量的测定。许多研究人员采用TLC GABA生产的主要筛选(图1)。

3.2。优化

为了确定的趋势变化GABA生产,应该选择一个模型,其中最适合实验数据和正确解释对GABA生产独立变量的影响。缺乏合适的概率等于0.07二次模型的研究。因此,这个模型可以适当分析和实证数据和选择适合描述的变化(表的响应2)。为了确定模型的准确性,和缺乏合适的测试了。等于0.92;因此,这个模型有良好的预测能力调查GABA的生产(32]。

方差分析是必要的对GABA精确地研究每个因素的影响生产和验证获得的数据。根据方差分析, 显示二次模型适合的解释的影响因素对GABA生产(表3)[32]。

3.3。压力和时间对GABA的影响生产

水马力是一种非热能的技术目前应用于通过破坏细菌(提高食品安全33,34)和扩展的质量和保质期食品没有令人不快地影响他们的气味,味道和质地。在目前的研究中,使用水马力提升GABA的生产产量短乳。文献的基础上,施加高水马力可以产生破坏性的(致命)对微生物的影响包括实验室。例如,马龙et al。35验证不同的压力的影响Lactococcus lactis ssp。lactis在25°C 5分钟。结果表明,细菌完全灭活在400 - 800 MPa。根据初步实验,压力低于致命的限制被考虑在目前的研究。初步测试结果(数据未显示)表示短乳被超过400 MPa压力或持续时间超过15分钟。因此,压力低于致命的限制被选择,在不同的时间检查。这个过程时间是另一个关键因素显著影响GABA含量。它可以观察到在图1GABA含量增加过程时间是5到15分钟。这可能是由于在发酵过程中细菌的数量上升除了压缩引起的细菌水马力。结果还表明,最大GABA含量被发现397.73 ppm的最佳条件下获得了300 MPa和15分钟(图2)。

与水马力从100年到300 MPa, GABA含量不断增加的趋势,符合先前获得的结果(3,36]。这也适用于这个过程的时间。与条件相关的GABA含量最高是300 MPa, 15分钟。

费雷拉et al。37)在三个层次上学习压力的影响酿酒酵母提高生物乙醇生产效率。他们对15、25和35 MPa酵母在30°C 72 h和观察到乙醇生产最多25 MPa。因此,可以推断,低压力在短时间不能有效,和压力和时间高度依赖于另一个。柯拉勒斯et al。(2009)调查的影响水马力的数量从葡萄皮中提取的花青素。他们适用于200、400和600 MPa。使用高效液相色谱时,花青素含量最高决心600 MPa。这些研究人员还指出,水马力并不局限于巴氏灭菌和消毒,也可以用于提取(特别是生物活性化合物的提取)。

3.4。压力和时间对细菌细胞生存能力的影响

微生物的总数是使用琼脂夫人来验证水马力的影响细菌数的控制和治疗前后样品施加水马力,以及72 h后孵化。结果表明,生长的短乳等于8.2 cfu /毫升后在控制培养72 h琼脂夫人和孵化。后施加水马力,增长变化从7.09到8.07对数周期。图3说明了时间的交互作用和细菌生存的压力。随着压力的增加,从100年到300年MPa和时间从5到15分钟,细菌细胞的数量显著降低( );然而,只有减少一个对数周期观察,与获得的结果在协议Mok et al。(2006)研究了水马力对实验室的影响存在于红酒。他们利用水马力100 - 150 MPa 0 30分钟和储存葡萄酒样品后14天治疗。这些研究人员宣布,细菌种群下降超出了允许的极限后的葡萄酒在300 MPa 20分钟或350 MPa 5分钟。

根据获得的结果,与水马力和流程时间,可以增加GABA生产提供合适的条件短乳。因此,水马力可以作为非热能的应用技术和提高细菌产生更多的GABA的能力。然而,高压力能破坏微生物。此外,水马力发挥GABA生产时间是另一个主要的因素,随着细菌人口减少与增加低于允许的水平水马力发挥时间38,39]。

3.5。使用高效液相色谱优化和模型验证

优化结果表明,控制的GABA含量等于37.11 ppm的吸光度值0.0085。另一方面,最多的GABA (397.73 ppm)生产条件下的300 MPa和15分钟RSM优化算法确定最优条件的愿望为0.91,考虑到最大化的GABA含量和细菌细胞的生存能力在范围内。

确认测试是考虑验证模型。在该测试中,GABA含量又测量了在实验室条件下并与GABA含量用高效液相色谱法的预测模型。鉴于注射GABA的内部标准,平均滞留时间等于12 s GABA和曲线下的面积最优样本报告192.67。使用方程,获得最优的GABA含量样本估计为388.15 ppm。据透露,结果预测的模型高度符合实证的。应该提到未知峰的色谱最佳样本相关的化合物用于样品衍生化(图4)。

Chunlong et al。(2013)研究了两种不同条件的影响( 在35°C和 在40°C)产生的GABA的内容短乳CGMCC 1306。他们通过高效液相色谱和报告量化GABA含量474.79更易/ l 和40°C。公园和哦(2007)同样的条件进行了优化短乳OPY-1隔绝酸奶,测量了GABA含量2.5 g / l,高效液相色谱法。

3.6。调查微生物形态的扫描电镜

为了研究水马力在细菌细胞形态学的影响,控制和优化(15分钟300 MPa)样本通过SEM观察。

我们可以看到在图5的杆状细胞短乳被压在300 MPa 15分钟压缩比控制细胞。这种变形可以归因于细胞保护剂的作用对水马力。它可以推断水马力,在压力低于致命的限制,可以提高GABA生产产量没有破坏细菌细胞和杀死微生物40]。

4所示。结论

目前的研究表明,水马力带来大约百分之一千增加GABA含量最优样本,而控制。因此,生物合成GABA可以增强在这项技术的帮助下,施加的压力低于致命的限制(压力水平的100、200和300 MPa,持续时间5、10和15分钟。应该注意的是,下面的施加压力被认为是致命的微生物的限制),因此发展食品和制药行业。此外,调查水马力的影响在其他生物活性化合物的提取效率建议进行进一步的研究。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢食品科学与技术大学·马什哈德(马什哈德、伊朗)。