肽提取物Olivancillaria hiatula具有广谱抗菌活性

文摘

增加报告的传染病全球近年来已成为全球各国关注的焦点。减少抗生素管道、快速和复杂的抗菌素耐药性的情况下,和传染病的出现和重新崛起需要迫切需要开发新的抗菌治疗,最好是与小说的行为模式。由于他们不同的行动模式,抗菌肽提供了一个有趣的替代传统抗生素处理枚举的问题。在这项研究中,抗菌肽提取物的潜力的海洋软体动物,Olivancillaria hiatula,是评估体外。琼脂扩散和肉汤稀释技术被用来评估微生物的易感性肽提取。Microplate-based化验也被用于调查时间增长抑制的微生物的肽和评估肽调节标准抗生素的活动的能力。革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都被肽提取琼脂扩散试验。肽的最低抑制浓度(MIC)与测试微生物之间的0.039和2.5毫克/毫升。麦克风,肽提取是对所有测试微生物但杀菌抑菌金黄色葡萄球菌。肽的提取,观察长期停滞阶段微生物,类似于标准的环丙沙星。当一起接种,肽提取物增强环丙沙星、头孢噻肟的活动和对甲硝哒唑对抗对红霉素但漠不关心。总的来说,这些结果显示的广谱抗菌活性肽提取物Olivancillaria hiatula和证明可以使用抗菌肽结合一些传统的抗生素改善效果。

1。介绍

刚开始的时候世纪,传染病报告是全球发病率和死亡率的主要原因。青霉素等抗生素的发现这种严峻的前景改善,增加乐观情绪,对抗传染病控制(1,2]。在1930年至2000年之间,有一个巨大的供应,抗生素和其他抗菌素临床兽医使用的军火库。抗菌素如青霉素、四环素、大环内酯类,喹诺酮类、氨基糖甙类,头孢菌素恶唑,糖肤彻底改变了医学领域和预期寿命显著增加3,4]。然而,传染病仍然是一个问题。在全球范围内,他们是死亡的第二大原因,发展中国家的死亡的第三大原因(5,6]。

不可否认在过去的几十年里,世界已经面临postantibiotic时代特点是多药耐药性,大多数微生物逃避现有抗生素的效果(7,8]。进一步加重的情况,研究和发展有一个明显下降的抗菌素(7),这是一个重大的全球卫生威胁。抗生素管道,这个下降的必然发展阻力,引入新的抗生素(9加上出现,再度出现传染病导致迫切需要发现新的抗菌药物救助这个严峻的形势。

为了克服抗菌素耐药性的威胁(AMR),提出了不同的策略。这些包括联合治疗(10与佐剂(抗生素),补充11,修改旧的抗生素以提高其抗菌活性12),和大自然寻找新的抗菌药物(7]。而联合治疗似乎在毒性和对抗的风险,修改旧的抗生素可能会扩大耐药性的频谱收购策略采用微生物,导致进一步的并发症。寻找新型抗菌药物、抗生素或铅化合物与非常规的行为模式从自然是一个潜在的有前途的途径来解决问题。

对陆地生态系统大多数抗生素欠他们的来源:真菌、土传细菌,和一些植物的例子。背后的水生生态系统(海洋)已经被陆地生态系统在寻找补救措施与小说的作用机理(13]。然而,探索如海洋环境可能导致化学和生物的发现新奇事物一样(14]。多个工作显示有趣的海洋生物提取物、抗菌、抗氧化、抗疟、抗炎、抗癌活性。事实上,一些代谢物具有这些属性特征已经被分离出来并(15]。从海洋无脊椎动物抗菌肽提供一个小说类的化合物具有显著的抗菌活动以及由细菌慢的电阻率采集(16,17),可以探索在追求新抗菌疗法。

抗菌肽(安培)本质上是丰富的植物和各种动物的家庭。他们大多是阳离子和两性分子的。由于他们amphipathicity,他们能够实现高浓度水环境和生物膜内。安培具有广谱抗菌活性,因为它们构成了第一道防线的动物和植物与微生物的攻击。微生物杀死通常是由于快速交互的AMP微生物外膜导致膜破坏,胞质成分的释放,停止细胞活动(18- - - - - -21]。一些工作正在进行关于肽从加纳海洋无脊椎动物,但原油的肽紧紧paradoxa和髌骨黄花已报告拥有一些抗菌活性(22]。

Olivancillaria hiatula(o . hiatula),海洋腹足类动物属于家庭榧螺科,无处不在的海岸Eikwe西部地区的加纳。o . hiatula底栖生物,其固着生命形式使它容易恶劣的环境条件和不同微生物的攻击。我们最近发现,溶剂提取的人体组织o . hiatula拥有令人印象深刻的能力减少炎症在活的有机体内(23]。我们假设它全身组织作为一个潜在的抗菌肽的来源。肽的抗菌活性和antibiotic-modulating效果从全身组织中提取的o . hiatula因此,在这项研究中调查。

肽提取物o . hiatula观察对选定的人类病原体具有广谱抗菌活性。细菌生长动力学研究表明长期滞后时间与高减少细菌生长在那个时期在subminimum抑制肽浓度的存在。一般来说,观察抑菌活性的生物。调制研究表明,肽增强环丙沙星、头孢噻肟的活动,对抗对红霉素对灭滴灵活动但漠不关心。

2。方法

2.1。样本收集和识别

样本收集通过便利抽样Eikwe (4°58“00”N 2°28”47 W),一个小镇Nzema加纳东部西部地区的直辖市。他们运冰系的实验室化学,恩克鲁玛科技大学(KNUST),库马西,储存在4°C。生物的帮助下被大学的渔业和海洋科学系加纳,Legon。全球生物多样性信息设施(GBIF)数据库(24)是用来证实分类法和样品被确认为o . hiatula。

2.2。肽提取

软体动物的壳被移除和全身组织清洗和混合。几百克的混合的身体组织均质与60毫升的10% (v / v)乙酸并保持12小时在4°C。提取了离心机在5000 rpm (SciSpin,英国)10分钟和上层的套利交易。冰冷的丙酮(25毫升)然后添加到上层清液保持在4°C 24小时沉淀肽。在5000 rpm离心法收集的沉淀是15分钟,丢弃上层清液。然后沉淀被冻结在-80°C。氮气是用来吹出溶剂在-80°C冻结后的痕迹。肽重组在25%乙腈(ACN)准备在0.1%三氟乙酸(组织)给20毫克/毫升股票的解决方案(28在4°C)和存储之前使用。

2.3。用红外光谱表征

肽的红外光谱确定了使用傅里叶变换红外(FTIR)设备(UATR 2、PerkinElmer)。该地区在4000年和400年进行扫描。这是紧随其后的是基线校正。使用干从冻干法提取获得。

2.4。抗菌检测

2.4.1。微生物培养物

在这项研究中,九个测试菌株(2 Gram-positives 7革兰氏阴性细菌的好药)被用来评估提取物的抗菌性。被使用的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923 (金黄色葡萄球菌),粪肠球菌写明ATCC 29212 (粪大肠)。革兰氏阴性菌包括大肠杆菌写明ATCC 25922 (大肠杆菌),变形杆菌写明ATCC 4175 (p .奇异君子兰),铜绿假单胞菌写明ATCC 4853 (铜绿假单胞菌),临床菌株克雷伯氏菌肺炎(k .肺炎),甲型副伤寒沙门氏菌(美国甲型副伤寒),淋病奈瑟氏菌属(n .淋病),和霍乱弧菌(诉霍乱)。所有微生物菌株获得的药品微生物学、药学和制药科学学院健康科学学院,KNUST。

2.4.2。剂制备

细菌分离株被飞跑到营养琼脂(英国Oxoid)板块和孵化18 - 24小时37°C。使用直接殖民地悬挂法,悬浮液的生物在营养肉汤和孵化一夜之间在37°C。这一夜之间文化被用于抗菌活性的测定使用扩散试验。对于剩余的测试,殖民地悬浮液在无菌生理盐水被调整至0.5麦克法兰标准,进一步在无菌双力量营养肉汤稀释(~ 2×10⁵CFU /毫升)[29日]。

2.5。琼脂扩散试验

25毫升的刚做好无菌营养琼脂(冷却到40 - 50°C)注入无菌培养皿中包含10μL在一夜之间的文化和旋风,确保同质有机体的传播。这是允许固化。三个等距井6毫米的直径和深度是板使用无菌软木蛀虫。One hundred.μL准备肽溶液被分发到井,允许在室温下平衡30分钟,然后孵化一夜之间在37°C。区域经济增长的抑制(mm)测量的直径周围明确区每个。独立的试验进行了一式三份,三个实验的平均值。环丙沙星(西格玛奥德里奇,密歇根州,美国)被用来作为参考抗菌剂(积极控制)的细菌菌株而ACN 25% 0.1%组织作为负控制(28]。

2.6。最低抑制浓度

最低抑制浓度(MIC)的肽提取被Wiegand描述由汤采用方法(29日]。十至二十四串行两倍稀释的肽或标准抗生素(环丙沙星)准备获得的最终浓度范围2.5 - 4.88×5.96毫克/毫升和500×μ分别g / mL肽和环丙沙星的微量滴定板。50毫升的双重力量含培养液营养肉汤~ 2.0×10的大小⁵CFU / mL被添加到每个。的总量是100μl .盘子都淹没了,在37°C孵化24小时。20毫升1.25毫克/毫升3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)被添加到每个好,孵化30分钟37°C。麦克风是确定的最低浓度肽提取测试生物或药物,抑制增长。这是由没有紫色的颜色表示MTT染色和孵化。所有的测试进行了一式三份。

2.7。最低杀菌浓度(MBC)

最低杀菌浓度(MBC)肽提取物由同一过程的MIC测定。24小时的潜伏期后,50μL整除与肽浓度大于井麦克风被镀在无菌琼脂板上。琼脂板是在37°C孵化24小时。MBC记录提取浓度最低杀死99.9%的细菌,即。,least peptide concentration that showed no visible growth of the microorganisms on the surface of the nutrient agar. Each experiment was repeated three times.

2.8。评价肽提取物的杀菌和抑菌能力

MBC /麦克风的比率是用来描述肽提取物的抗菌活性。MBC /麦克风≤2的比率时,被认为是影响杀菌和比率≥4定义为抑菌(25]。

2.9。Microplate-Based浊度的增长抑制试验

生长抑制试验生物肽的存在,研究了使用微型板块抑制试验(30.,31日用细微的修改。在这个试验,肽提取从4×麦克风浓度连续稀释到0.25×麦克风肽浓度为每一个生物之后,50μL营养肉汤含有菌剂~ 2.0×10的大小⁵CFU /毫升是补充道。微型板块在37°C和孵化光密度在600 nm (OD_600年)确定每隔2小时标(协同H1多模板读者,德国)。的OD_600年值获得绘制与时间,是用来说明肽的抑制活性o . hiatula对各种测试生物体。

2.10。调制的研究

sub-MIC肽提取物的浓度调节能力标准抗生素是评估的活动。在这个实验中,标准的抗生素对微生物的麦克风和麦克风的抗生素的存在sub-MIC肽浓度测定。微生物耐药性调制测试执行根据Wiegand修改过程描述和同事(29日]。24系列双重的稀释标准抗生素;环丙沙星(西格玛奥德里奇),甲硝哒唑(西格玛奥德里奇)、红霉素(阿尔法蛇丘)和头孢噻肟(阿尔法蛇丘)准备获得最终浓度范围5.96×500μ克/毫升。50毫升水中含有微生物的营养肉汤培养液~ 2.0×10的大小⁵CFU / mL被添加到每个。抗生素对所有测试微生物的引用。麦克风测定板材的孵化24小时后和MTT在井中。

Subinhibitory浓度为20μg / mL肽的解决方案和各种稀释的标准抗生素+相同培养液大小不一,然后孵化一夜之间在37°C。中等收入国家的抗生素肽测定如前所述的存在。所有的测试进行了一式三份。

调制因子(MF)计算,用来评估抗菌肽提取物对各种抗生素使用的麦克风。 调制系数> 2是生物重要的截止调制(32]。

麦克风是计算使用的变化33]

2.11。数据分析

GraphPad Prism 6.0版本Windows (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)和微软Excel 2007被用于所有数据分析和图表。

3所示。结果

3.1。红外表征

光谱得到的红外光谱显示,著名的山峰的一个典型的肽。著名山峰符合拉伸和弯曲振动- h, C = O和碳氢键观察(图1)。

3.2。抗菌试验

肽提取物表现出广谱抗菌活性与令人印象深刻的活动对所有微生物。所有提取测试5毫克/毫升的浓度的琼脂扩散试验。最高的抑制区(子)被记录n .淋病虽然没有间隙区观察诉霍乱、美国甲型副伤寒、和粪大肠在这个浓度。当浓度增加10至50毫克/毫升,然而,明确区域的抑制观察3微生物(表1)。

3.3。提取物的最低抑制浓度(MIC)

肽提取物o . hiatula展示了很好的抗菌活性很低的麦克风记录。中等收入国家范围从2.5到0.039毫克/毫升对所有测试生物体。革兰氏阳性生物体记录相对较高的麦克风2.5毫克/毫升的革兰氏阴性细菌,尤其是,更低的中等收入国家(表记录2)。p .奇异君子兰和铜绿假单胞菌特别是有非常低的中等收入国家(39μg / mL)表中可以看到2。

3.4。最低杀菌浓度(MBC)

MBC和MBC的比率确定麦克风对所有测试生物肽提取。这一比率表明microbiostatic或肽提取物的杀微生物的性质对生物测试。MBC最低(1.25毫克/毫升)被记录铜绿假单胞菌而相对较高MBC(≥2.5毫克/毫升)的生物肽被剩下的测试。从MBC比麦克风,肽被认为对杀菌剂的效果金黄色葡萄球菌和对其余microbiostatic行动测试生物(表2)。

3.5。微型板块浊度的增长抑制试验

的生长抑制试验测试生物肽提取,测试生物体的生长曲线的4×麦克风,2×麦克风,麦克风,0.5×麦克风,0.25×麦克风的肽提取减少比较的增长曲线控制(测试生物体没有肽)。的滞后阶段测试生物长期平均为16小时,而日志阶段在肽的存在也减少了。增长曲线的测试生物被夷为平地在24小时的潜伏期的存在2×麦克风和4×麦克风肽浓度,这种影响甚至观察到环丙沙星的麦克风(数字2和3)。肽提取物抑制增长的影响测试的生物被观察到浓度依赖(图2)。

3.6。抗生素调制

肽的提取o . hiatula在sub-MIC 20的浓度μg / mL有明显影响的反应测试生物抗生素与调制系数< 0.25 ~ 524288(表3- - - - - -6)。当20μ克/毫升的肽提取物加入不同浓度的环丙沙星和测试生物体,显著降低环丙沙星的麦克风所有测试生物高达约16倍,000(表3)。Sub-MIC肽的浓度还提取调制头孢噻肟积极的行动与测试生物(表4)。有一个麦克风的头孢噻肟的存在减少肽提取的所有测试生物除外金黄色葡萄球菌和n .淋病观察增加麦克风。的麦克风n .淋病在实验条件下(表实际上增加了一倍4)。

肽提取甲硝哒唑(表没有任何明显的影响6红霉素(表),但是是敌对的5)。

4所示。讨论

各种方法孤立存在的海洋无脊椎动物的肽。在这项工作中,我们利用全身组织的o . hiatula作为我们的抗菌肽的来源。冰冷的丙酮沉淀的肽全身组织匀浆提供原油肽数量可观。

提取得到的红外光谱谱与报道是一致的振动光谱的肽(26,27,34]。酰胺我乐队,这是一个直接后果的羰基(C = O)伸展振动,观察到大约有1650 。- h弯曲和碳氮伸展振动是主要贡献者酰胺二世乐队和通常观察到从1480年到1575年 。光谱中,酰胺二世乐队更突出,并有很强的吸收记录在这个地区。酰胺A和B乐队可以观察到在3200年到3500年之间 。这些通常是由于h伸展振动。峰值对应酰胺III-VI地区(500 - 1300年 )光谱中也可以看到。这些山峰表明样品主要组成的肽。红外光谱可以用来预测二级结构元素。很难让任何此类扣除从提取的光谱可能因为它是混合物,可以包含许多不同的肽。然而,缺乏强有力的酰胺我吸收是引人注目的。在此基础上观察,它可以推测,提取是丰富的α螺旋肽(26,34]。

抗菌肽(安培)通常表现出广谱抗菌活性,被认为是一种对抗抗菌素耐药性的威胁。因为安培通常膜定位、微生物耐药性可能涉及到建筑设计和/或成分变化整个细胞的脂质膜的微生物21]。这样的风险很可能是非常昂贵和难以实现的微生物。因此安培表示一个可行的治疗选择。

肽提取物o . hiatula是积极的对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。微生物的易感性是评估使用琼脂扩散和肉汤采用的方法。即使一些微生物(美国甲型副伤寒、霍乱诉和粪大肠)需要更高的肽浓度的琼脂扩散试验中观察到的活动,他们在汤采用测试显示很好的活动。肉汤采用试验被认为是更敏感的相对于琼脂扩散试验筛选抗菌天然产物(35]。天然产品的属性如pH值、溶解性、波动性和在琼脂扩散影响琼脂扩散试验的结果而不是汤采用微量测定(36,37]。低中等收入国家记录n .淋病和铜绿假单胞菌令人印象深刻,因此提取被认为是非常活跃的37]。一般来说,麦克风记录值远低于那些记录肽提取物髌骨黄花和紧紧paradoxa(22)以及甲醇和乙酸乙酯提取物Littorina littorea和紧紧paradoxa(38]。这些麦克风,然而,在这些抗菌肽pexiganan记录,一个拥有先进的最远的抗菌肽在治疗糖尿病足溃疡的临床试验。中等收入国家为pexiganan范围从16到32μ克/毫升(39,40]。之间有很强的正相关关系α螺旋内容和抗菌活性41,42]。令人印象深刻的活动记录对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌支持主要的二级结构元素的概念o . hiatula肽提取α螺旋线,推测的红外数据。

调查的抑制性影响肽提取研究,对各种细菌的最低杀菌浓度(MBC),定义为最低提取杀死99.9%的细菌接种物浓度在37°C, 24小时孵化后被记录。麦克风,所有细菌的抑菌效果观察,除了金黄色葡萄球菌杀菌效果观察。上面的麦克风,肽提取被发现具有杀菌作用。大多数安培是浓度依赖的活动。增加肽:脂质比整个膜的微生物大大增强了肽的穿透能力和破坏细胞膜的完整性。膜离子通道的形成、跨膜孔隙的形成和破裂,所有导致微生物死亡更为普遍更高肽浓度(43]。这种效应可以清楚的观察到在各种细菌的生长曲线存在不同肽浓度的长期停滞阶段记录在2×4×麦克风。的增长曲线金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒s, p .健神露,和铜绿假单胞菌并在较小程度上粪大肠在肽的存在(图2)相似形状的标准药物环丙沙星(图3)。

虽然治疗药物可用于隔离引起特定效应(s),联合治疗正迅速成为常态由于与之关联的几个优点。联合治疗可能减少耐药微生物的出现随着微生物的适应与不同的两个或两个以上的药物做法。毒性与高剂量以来,联合治疗也可以消除低剂量的药物需要达到相应的水平单一药物治疗的疗效。最后,病原体,可以针对性的范围可能扩大取决于个人药物在特定组合(44]。安培的识别,可以结合传统的抗生素用于治疗感染有很好的潜力扩大可用的治疗选项。

评估可能的肽提取的效果o . hiatula在一些标准的抗生素,调制实验设置。Subinhibitory肽提取物的浓度显著降低环丙沙星对所有测试微生物的中等收入国家。当肽结合头孢噻肟,中等收入国家反对几乎所有测试微生物也减少了。对红霉素和甲硝唑治疗,观察不同的趋势,提高红霉素的麦克风被记录,没有明显的变化观察灭滴灵的情况。两组的拮抗和协同抗菌肽与抗生素的影响已报告在文献[45,46]。肽之间的协同互动和抗生素可能导致的膜透性作用肽或孔隙形成的细菌膜。这导致破坏细胞膜的完整性和容易渗透的抗生素进入细菌细胞,他们造成更大的破坏39,40,46]。抗菌肽,WR12 D-IK8,已被证明具有强有力的合作与大多数局部抗生素(梭链孢酸和莫匹罗星)和系统性抗生素(daptomycin teicoplanin,万古霉素,linezolid,环丙沙星,meropenem,和新青二)(46]。短肽链被授予对一些大环内酯物抗生素细菌耐药性,尤其是红霉素。通过修改的药物耐药发生的大环内酯物结合位点(无论是通过别构直接突变氨基酸残基的突变附近的绑定口袋)(45,47),专业的抗生素射流泵(48),和短肽的作用45,49]。短肽与大环内酯物结合,形成一个不活动的复杂或直接作用于核糖体,抑制或终止翻译(45]。

5。结论

的广谱抗菌活性肽的提取o . hiatula本研究表明。肽提取物被证明在麦克风但是杀菌抑菌、四中等收入国家的两倍。肽的提取,观察长期停滞阶段的所有测试微生物的增长模式。肽提取还发现与环丙沙星、头孢噻肟协同使用时但甲硝哒唑对抗对红霉素和漠不关心。总之,这些结果表明肽提取物的效用o . hiatula作为有效的抗菌药物的潜在来源。努力隔离和抗菌肽的提取特征组合目前在我们实验室进行。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

信息披露

这部分工作提出了“7日加纳科学协会作为一个海报。研究研讨会和海报展示”夸梅•恩克鲁玛科技大学库马西,加纳,2018年4月。

的利益冲突

所有作者声明没有金融竞争、专业或个人利益可能影响性能或演示本手稿中描述的工作。

作者的贡献

劳伦斯·谢林汉姆Borquaye构思。所有的实验都是由劳伦斯·谢林汉姆Borquaye爱德华Ntim Gasu,和休伯特Senanu Ahor。样本收集的爱德华Ntim Gasu。休伯特Senanu Ahor和爱德华Ntim Gasu进行实验。数据分析是由劳伦斯·谢林汉姆Borquaye爱德华Ntim Gasu和休伯特Senanu Ahor。手稿是由劳伦斯·谢林汉姆Borquaye休伯特Senanu Ahor,和爱德华Ntim Gasu。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

作者感谢部门的化学和制药微生物学以及中央实验室所有KNUST使用他们的设备。作者欣赏埃德蒙博士Ekuadzi系的生药学,KNUST,和纳撒尼尔·奥乌苏博士Boadi化学系,KNUST,有益的讨论。作者也承认弗朗西斯Amankwaah药品的微生物学,KNUST,技术支持。

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