功能性益生菌评估和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba降胆固醇的功效gydF4y2BaWeissellagydF4y2Basp。与旱地Living-HostsgydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

研究和新型益生菌菌株的选择从小说领域正在接受越来越关注他们的宣布对人类和动物健康的好处。本研究旨在评估的功能属性gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株从旱地living-hosts选择压力和降低胆固醇的财产gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,用作益生菌。他们评估了酸和胆汁宽容、抗生素敏感性,膜性能、抗菌活性,antiadhesive效应对病原体的宿主细胞,和胆固醇同化gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。我们的研究结果表明,大多数菌株显示抗胃肠条件。所有的压力都nonhemolytic和敏感的大部分测试抗生素。他们还表现出高autoaggregation和其中一些显示高coaggregation选定的病原体和高粘附能力两个不同的细胞系(Caco-2和MIM / PPk)。特别是,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99,从骆驼粪便,提供了一个广泛的对病原体的抗菌谱,减少gydF4y2Ba粪肠球菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba粘附Caco-2细胞,减少被发现,gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba,49%的胆固醇水平。此外,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99是碳水化合物的利用率以及评估血清脂类代谢影响Wistar鼠喂高胆固醇的饮食。gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99显示一个有趣的增长在不同plant-derivative低聚糖作为唯一碳源。相比之下,老鼠喂食高脂肪的饮食(高频)gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba管理、血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯水平明显(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)减少gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99-treated心衰大鼠,高密度脂蛋白胆固醇高密度脂蛋白胆固醇水平无显著变化。在这些结果的基础上,这是第一个研究报告gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99,从骆驼粪便,可以开发作为降脂益生菌菌株。进一步的研究可能揭示他们的潜力和可能的生物技术和益生菌的应用程序。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

益生菌被定义为“活的微生物,在足够的数量管理时,赋予宿主健康好处”(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。乳酸菌(实验室),尤其是乳酸杆菌,广泛应用于食品生产和代表最常见的微生物作为益生菌在功能食品gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。益生菌的概念获得了全世界的关注,由于认为有益的这些细菌对人类和动物健康的影响(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。,使用益生菌已经上升为了卵形的滥用引发的负面影响使用抗生素在人类和兽医gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。特别是,使用抗生素作为生长促进剂在动物饲料已被怀疑负责耐多药病原体的出现(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。因此,使用益生菌作为预防/治疗治疗的可能性或人类和动物健康推广者构成了一个重要的主题在应用微生物学gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。益生菌菌株的选择必须满足许多条件与安全有关,持久性和所需的功能特征(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。耐胃酸和胆汁毒性、肠道细胞粘附能力,抑制病原菌是最重要的益生菌特性考虑候选人选择胃肠道殖民(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。益生菌有其起源主要从发酵食品或人类和动物肠道微生物区系。然而,基于许多临床研究一些益生菌的功效是非常值得怀疑,等gydF4y2Ba乳杆菌gydF4y2BaGG应变导致儿童和成人患者脓毒症与他们摄入益生菌补充剂(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。因此,严格的描述和评价益生菌的益生菌候选人的能力是最重要的因素。特别是细菌物种之前没有被报告为益生菌。此外,隔离和新颖的益生菌菌株的选择从其他生态位可能的优势获得菌株与新的有益的功能性质,技术和/或益生菌可能有用的应用程序。生物生活在旱地代表前景价值的来源选择潜在的益生菌。起源的差异应该导致特定细菌的特征,这可能提供了一个新的或突出的益生菌效果病人。这种生物可以选择特定的微生物在应对特定的代谢特征适应硬条件(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。这个概念可能影响肠道微生物组的许多生物,特别是对于昆虫,在生存/适应他们的主机,变得明显和论证gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。在这工作,实验室从沙漠植物和骆驼和胃肠道微生物区系gydF4y2Ba箭蚁gydF4y2Ba蚂蚁进行了研究和评估潜在的益生菌。事实上,骆驼和gydF4y2Ba箭蚁gydF4y2Ba蚂蚁有一个高容量的适应生存在半干旱,干旱,沙漠地区,它的特点是营养差,高温、盐胁迫,干燥,紫外线辐射gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。此外,gydF4y2Ba箭蚁gydF4y2Ba蚂蚁是一种最独特的一群昆虫生活在干旱地区。它们通常被认为是生物模型研究许多先进的适应特征(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。此外,大多数蚂蚁物种及其幼虫食用在世界不同的地方,为了满足日益增长的需求可持续饲料和食物来源(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。因此,这些独特的生理特征得到这样的沙漠host-organisms可能强调特殊的肠道微生物群的存在,赋予了有趣的代谢特性导致其宿主的适应。gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba提出了作为一个相对较新的属实验室的成员之一,基于16 s rRNA发展史基因序列数据(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。这是最普遍的乳酸物种在不同的生态位gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。属的细菌gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba包括19种据报道隔绝各种发酵的植物性食物,土壤、植物、动物产品、人类的粪便,和人类或动物的胃肠道(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。他们是兼性厌氧菌,一般生长在温度15至42°C。只有少数研究报告的评估gydF4y2Baw·kimchii w . confusagydF4y2Ba,gydF4y2Baw . cibariagydF4y2Ba菌株作为潜在益生菌(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。本研究的目的是评估的益生菌的选择gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株,分离出未开发的源(细菌群落与骆驼粪便,肠道gydF4y2Ba箭蚁gydF4y2Ba蚂蚁,沙漠植物),评估,gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba的降胆固醇效果选择益生菌的潜力gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。抽样方法gydF4y2Ba

沙漠植物的样本(gydF4y2Ba大戟属植物guyonianagydF4y2Ba)(13),骆驼粪便(49),和蚂蚁(15)收集从突尼斯南部旱地2010年3月和2011年。不同样本中收集的无菌袋热压处理过的或者猎鹰管(热科学Nunc 50毫升),保持低于10°C, 7天内接受治疗。实验室从植物样本分离富集方法描述Fhoula et algydF4y2Ba。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。实验室隔绝粪便被Foo等进行描述gydF4y2Ba。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。的gydF4y2Ba箭蚁gydF4y2Ba蚂蚁在无菌的容器转移器官解剖前微生物隔离。蚂蚁和70%乙醇和surface-disinfected解剖前用无菌水冲洗两次。每个成年人ant使用消毒无菌切割精细探针钳和整个身体肠道被撤。内脏被放置在与500年1.5毫升管gydF4y2BaμgydF4y2Bal(生理盐水(0.85%氯化钠)。之后,他们用一个塑料浸渍杵,用于细菌培养。gydF4y2Ba

2.2。细菌菌株培养条件和细胞系gydF4y2Ba

从69环境实验室的隔离gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba属,9株保留了本研究基于初步选择耐低pH值(见下文),一个更重要的选择标准的益生菌(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)gydF4y2Ba。肠球菌都有效gydF4y2BaMMRA [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba与本研究密切相关。实验室是培养德曼、Rogosa和夏普夫人肉汤(Biolife) 37°C。其他菌株用于抗菌活性,包括gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5gydF4y2BaαgydF4y2Ba,gydF4y2Ba单核细胞增多性李斯特氏菌gydF4y2Ba课时,gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba沙门氏菌感染IPT13,gydF4y2Ba粪肠球菌gydF4y2Ba写明ATCC 29212,gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba写明ATCC 27853,gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba写明ATCC 6538,是生长在BHI肉汤(Biolife) 37°C。描述的分离菌株进行鉴定Fhoula et algydF4y2Ba。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba使用16 s rRNA)基因序列分析。获得的DNA序列存入基因库加入数据库和相应的数字显示在表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。要长期储存,菌株被储存在−15%甘油80°C。人类的高加索结肠腺癌Caco-2细胞系是购买的gydF4y2BaσgydF4y2Ba奥尔德里奇。小鼠肠胶质MIM / PPk细胞系(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba)是提供作为礼物教授安妮·鲁尔(慕尼黑大学)。机会致病菌(gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaN176和gydF4y2Ba粪肠球菌gydF4y2BaP592)用于抑制Caco-2细胞粘附实验获得生物医学科学系从集合中,部分实验和临床微生物学,萨萨里大学、意大利。细胞培养所需的所有化学品和粘附的研究从Sigma-Aldrich购买,美国。Caco-2细胞生长在RPMI 1640中补充10% (v / v)胎牛血清(的边后卫,σ)和100 U /毫升penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich)。MIM / PPk在DMEM-F12培养基培养细胞(杜尔贝科基本媒介,GIBCO)补充的边后卫和100 U /毫升penicillin-streptomycin为10%。孵化是在37°C的5%的股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。细胞被播种的浓度1 x10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞每24-well组织培养板内盖玻片。gydF4y2Ba

2.3。容忍低pH值和胆汁gydF4y2Ba

的宽容gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株低pH值进行了检测,作为描述Klayraung et al。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。耐酸性的汤夫人调整pH值2.5和1 n HCl 90分钟37°C是用作益生菌菌株初步筛选评价。的能力gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba株抵抗这种pH值是由单一夫人平皿上裸奔的厌氧培养48 h后37°C。所选菌株进行pH值2.2公差如下:在0.01细胞球洗两次磷酸缓冲盐(氯化钠PBS, 0.14米,1.5毫米KgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,6.0毫米NagydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,3.0毫米氯化钾;pH值7.4)和resuspended 10毫升(0.05米)磷酸盐缓冲剂pH值2.2(调整使用盐酸1 n)达到10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU /毫升,举行37°C 2 h。在磷酸缓冲细胞连续稀释10倍(0.1米,pH值6.2)。测试耐胆盐,gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株生长在夫人汤含0.5%和0.3 (w / v)的胆汁盐3 h孵化在37°C。可行的细菌细胞在酸性和胆汁条件下测定镀一式三份琼脂培养48 h后夫人在37°C。存活率计算殖民地日益增长的百分比在琼脂夫人,与最初的细菌浓度。gydF4y2Ba

2.4。附着力化验Caco-2和MIM / PPk行细胞gydF4y2Ba

实验室菌株的粘附能力的肠上皮细胞enterocyte-like Caco-2细胞系和MIM / PPk小鼠肠道神经胶质细胞研究。短暂,实验室菌株生长在BHI-GY介质18 h在35°C。这些细胞被收获(10000 x g, 10分钟,RT),与无菌PBS洗两次,麦克法兰在DMEM稀释,调整到0.5。细胞层与不洗DMEM和1毫升细菌悬液(大约1 x10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaCFU /毫升)被添加到每个。板块在1500 x离心机为孵化后10分钟。3 g h在37°C公司为5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,盘子洗两次与甲醇PBS和固定染色后30分钟。May-Gruenwald /染色溶液(Riedel-de-Haёn、德国),细菌粘附的细胞可视化光学显微镜(蔡司光学显微镜),在油浸,100倍的放大(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。两个独立的实验研究为每个应变和未感染的细胞包括消极的控制。附着20随机微观领域的实验室总为每个应变(40)。gydF4y2Ba

2.5。Autoaggregation和CoaggregationgydF4y2Ba

autoaggregation和coaggregation化验gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba据Malik菌株测定et al。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。的coaggregation能力gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba隔离是检查关于测试细菌的伙伴gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5gydF4y2Baα,S。gydF4y2Ba沙门氏菌感染IPT13,gydF4y2Ba圣球菌gydF4y2Ba写明ATCC 6538。autoaggregation和coaggregation百分比测定光密度(OD的百分比减少gydF4y2Ba_{660年gydF4y2Ba}上层清液)的非聚合细胞60分钟后使用以下方程:聚合% = (gydF4y2Ba x 100。gydF4y2Ba

2.6。溶血活性和抗生素耐药性gydF4y2Ba

新鲜的细菌培养有一式三份基础上血琼脂平板和5% (v / v)的马血和孵化30°C 48 h。血琼脂平板被检查gydF4y2BaβgydF4y2Ba红血球溶解,gydF4y2BaαgydF4y2Ba红血球溶解,或gydF4y2BaγgydF4y2Ba溶血(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。对抗生素的敏感性是由使用磁盘在穆勒辛顿琼脂扩散法(尼古拉斯)板补充葡萄糖和酵母提取物分别占0.2%和0.4%。使用的抗生素是氨苄青霉素(我;10gydF4y2BaμgydF4y2Bag)、氯霉素(C;30.gydF4y2BaμgydF4y2Bag)、红霉素(E;15gydF4y2BaμgydF4y2Bag),四环素(TE;30.gydF4y2BaμgydF4y2Bag)、克林霉素(CL;2gydF4y2BaμgydF4y2Bag)、利福平(类风湿性关节炎;5gydF4y2BaμgydF4y2Bag),万古霉素(范;30.gydF4y2BaμgydF4y2Bag) (Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。MH板覆盖着柔软的尼古拉斯(含0.7%琼脂)接种在0.5麦克法兰新鲜细菌培养。经过24小时的潜伏期在37°C,光盘测量周围的抑菌圈直径,和实验室分离分类,根据标准的标准(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba抗耐药(R)),中间(我),(S)或敏感。gydF4y2Ba

2.7。抑制病原菌gydF4y2Ba

的抑制活性gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株与菌株使用的指标由琼脂抽查化验所描述的书评和鲁克gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)做了一些调整。点3gydF4y2BaμgydF4y2Bal每个实验室的文化沉积到表面的枸杞多糖琼脂板(胰蛋白胨(20 g),酵母提取物(5克),乳糖(10克),明胶(2.5 g),琼脂(11 g),氯化钠(0.4 g),醋酸钠(1.5 g),和蒸馏水(1升)]。然后,他们在35°C孵化24 h允许殖民地发展。指示菌株(gydF4y2Ba圣球菌gydF4y2Ba,gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba,gydF4y2BaEn。粪gydF4y2Ba,gydF4y2Ba年代。gydF4y2Ba沙门氏菌感染,gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba)被接种到5毫升的软琼脂的浓度(0.7%琼脂)10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^6gydF4y2BaCFU /毫升,在板的实验室隔离种植。在35°C孵化后24 h,面前的板块进行明确的抑制区。抑制被认为是积极的,当周围明确区现场的直径的实验室分离超过5毫米。所有的抗菌测试进行了一式三份。gydF4y2Ba

2.8。抑制病原菌粘附Caco-2上皮细胞gydF4y2Ba

为排除化验坚持Caco-2病原细菌的细胞,100gydF4y2BaμgydF4y2Bal (gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba细菌悬液(ca。1×10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU)添加到Caco-2每个细胞,如上所述,孵化90分钟37°C。层的Caco-2细胞被洗两次1毫升无菌PBS释放游离细菌,然后接种100gydF4y2BaμgydF4y2Bal (10gydF4y2Ba^8gydF4y2BaCFU /毫升)的下列投机取巧的胃肠道和泌尿生殖病原体之一:gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaN176和gydF4y2BaEn。粪gydF4y2BaP592(耐Beta-lactamin糖肤、青霉素和万古霉素)。孵化后,游离细菌细胞从井,Caco-2细胞1毫升无菌PBS洗两次,其次是1毫升的0.5% (v / v)特里同x - 100释放粘细菌细胞。连续稀释镀在琼脂(Biolife)夫人,MacConkey琼脂(MCA, Biolife)和胆汁七叶灵琼脂(BEA Biolife)媒体列举gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba物种,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2BaEn。粪,gydF4y2Ba分别。竞争分析,竞争性抑制病原体的检测gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba确定菌株如前所述,除了实验室应变和病原体之一(gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2BaEn。粪gydF4y2Ba)同时添加到Caco-2文化和孵化3 h在37°C。井含有病原菌单独作为控制。选择的能力gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株排除或抑制粘附Caco-2细胞潜在胃肠道病原体被表示为一个百分比之间的附着力的病原体的存在和没有测试gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba压力。gydF4y2Ba

2.9。表现型微阵列gydF4y2Ba

生长在不同碳源(93)两种gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株是评估使用表现型阵列(PM)技术(生物测井,海沃德,CA)。细菌细胞从一个殖民地,生长在BHI琼脂48 h,暂停在特定的生物测井中(调整到65%的透光率)和用于接种表现型阵列96 -孔板(PM1和PM2),根据制造商的指示。点板被孵化72 h在37°C。数据从一个实验与Omnilog-PM软件进行了分析。对于每个碳源,代谢活动基于曲线下的面积的定量测量。每个点的两个独立的复制板显示相同的结果。gydF4y2Ba

2.10。胆固醇同化gydF4y2Ba

WeissellagydF4y2Ba细胞接种到无菌夫人汤含有0.3% (w / v)牛胆汁(σ)和100年gydF4y2BaμgydF4y2Bag / ml过滤消毒水溶性胆固醇(σ)和厌氧孵化24小时37°C。细胞收获和残留在上层清液胆固醇浓度确定使用o-phthalaldehyde Rudel比色法和莫里斯(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。胆固醇的比例相比被压力控制计算如下:[1 -(残余在肉汤游离胆固醇)/胆固醇控制肉汤)x 100。gydF4y2Ba

2.11。gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba胆固醇化验gydF4y2Ba

2.11.1。动物和实验设计gydF4y2Ba

成年雄性Wistar鼠是165.1±5.2克重购自巴斯德研究所的突尼斯和安置两个干净的塑料笼子和允许适应实验室环境。动物的房间通风和保持12 h光明/黑暗在24°C和50%的相对湿度。老鼠提供标准饮食和水随意。动物实验进行了严格遵守道德准则控制和动物保健和使用的监督。驯化后,共有16个动物被随机选择并分为两组(n = 8为每一个)。组I和II被喂以高脂肪高频包含饮食治疗2周,然后如下:集团我收到高频饮食与PBS(对照组)和组II高频饮食和接收gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2Ba在PBS, 9×10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba悬挂的CFU /公斤体重gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99 PBS。无菌胃饲管用于口服接种的一个两组每日1毫升gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99悬挂在8周9×10gydF4y2Ba^9gydF4y2BaCFU /公斤体重。在实验周期的结束,老鼠被斩首牺牲为了最小化处理压力,收集血液和主干。血清是由离心(2500×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟4°C),冻结,储存在−20°C直到血浆血脂分析。高频饮食含有1% wt / wt胆固醇、脂肪油10%,正常的饮食组合。gydF4y2Ba

2.11.2。血清脂质gydF4y2Ba

的浓度总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(高密度脂蛋白胆固醇)和甘油三酯(TG)血清酶比色测定方法使用商业套装(Elitech、法国),而低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)据Friedewald公式计算(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.12。统计分析gydF4y2Ba

通过SPSS 19.0统计分析软件SPSS,芝加哥,美国)。使用单向方差分析获得的数据进行分析(方差分析)和图基的测试。数据被认为是明显不同的gydF4y2BapgydF4y2Ba值小于0.05。所有数据都表示为均值±标准差。gydF4y2Ba

3所示。结果与讨论gydF4y2Ba

3.1。耐低pH值gydF4y2Ba

酸宽容构成的第一标准用于选择益生菌微生物的生存能力运输通过胃gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。实验室潜在的益生菌菌株分离出来自不同来源的首次评估生存低pH值(pH值2.5)条件。宽容,pH值(2.2)也检查所选菌株。结果显示,大多数实验室菌株可能存活大约不到68%到89.3%在低pH值(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)2小时,这是典型的通过所需的平均时间的食物在胃里gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。最宽容的菌株gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS23、FAS24 F99存活率介于72.1和89.2%。特别是,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2Ba比益生菌F99幸存下来gydF4y2BaEn。都有效gydF4y2BaMMRA从乳制品(85.4%)。除了gydF4y2Ba,w . halotoleransgydF4y2BaFAS65敏感pH值在存活率为44.5%(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这些结果表明,耐低pH值是一个应变依赖房地产和肠道起源生态系统起着关键作用的细菌能够适应压力环境。gydF4y2Ba

3.2。胆汁耐受gydF4y2Ba

公差实验室细胞不同的胆汁盐浓度(0.3%和0.5%)的夫人是评估。最紧张,除了gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS22,表现出显著的存活率3 h后生理的增长(0.3%)和高浓度(0.5%)的胆汁(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。但总的来说,存活率较低而胆汁积极控制在0.3%。考虑到酸性条件,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS3,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99,gydF4y2Baw . confusagydF4y2BaF80发现耐药菌株中0.3%的胆汁,达成可行性率高达73%。此外,我们注意到可行的细胞的数量增加一些实验室在高浓度胆汁的0.5%(表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这些结果强调的潜力gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba隔离在胃肠道的条件下生存。高耐胆汁盐确实代表了一个重要因素,可能大大影响实验室在宿主胃肠道的可行性和开发这些益生菌菌株。因此,这是一个先决条件的殖民和代谢活动的贡献的细菌平衡肠道微生物区系的主机(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。根据胃肠耐受性化验,五株(F80, F99, FAS23 FAS3, FAS24)与存活率超过68%选择其他益生菌特性的进一步评估。gydF4y2Ba

3.3。粘附Caco-2和MIM / PPk细胞系gydF4y2Ba

的粘附能力gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株,研究了两种类型的细胞系(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba):人类结肠癌细胞系(Caco-2),作为一个优秀的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba肠上皮细胞模型和肠胶质细胞(MIM / PPk)、肠神经系统的主要组成部分,似乎对于维护肠道内稳态和粘膜完整性(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。事实上,肠胶质细胞扮演着一个复杂而重要的作用在调节许多似乎神经活动和参与免疫和肠道炎症过程gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。的粘附能力gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba向细胞系是不同的。他们能够坚持或强烈的至少一两个细胞系(表进行测试gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。特别是gydF4y2Baw . confusagydF4y2BaF80提出了强烈的特定的粘附只为MIM / PPk。变量粘附能力不同的细胞系可能反映了这些细菌的作用方式(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。因此,强大的Caco-2行细胞粘附的细菌可能促进宿主殖民和竞争排斥病原菌的上皮表面。这是压力的情况下gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99、FAS24 FAS3,可以选为潜在的益生菌的候选人。考虑到这些数据,我们可以建立一个相关非生物表面生物膜的形成和坚持之间Caco-2细胞,除了gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS23。而高粘附肠胶质细胞(EGC)可能表明这些菌株可能参与免疫系统调制(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。细菌的相互作用机制EGCs目前未知的(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。按照建议的Ortua et al。gydF4y2Ba46gydF4y2Ba),潜在的益生菌菌株组合的使用揭示不同粘附能力可能导致互补效应,可用于不同的应用程序。gydF4y2Ba

3.4。Autoaggregation和CoaggregationgydF4y2Ba

而益生菌gydF4y2BaEn。都有效gydF4y2BaMMRA应变,几乎所有菌株表现出好的autoaggregation百分比平均为64%(表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。观察autoaggregation的最高价值gydF4y2Baw . confusagydF4y2BaF80聚合百分比高达72%孵化后在室温下1 h。此外,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS23、FAS3 F99表现出一个好的autoaggregating表型的比例为66.5%,64.6%,和64.1%,分别。这些结果表明,大多数测试菌株具有高潜力坚持上皮细胞和粘膜表面的能力。事实上,这种能力autoaggregation与细胞粘附特性的gydF4y2Ba47gydF4y2Ba),这是至关重要的肠道菌群中是有效的。另一方面,coaggregationgydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株与enteropathogens三,gydF4y2Ba大肠杆菌DH5gydF4y2BaαgydF4y2Ba,年代。gydF4y2Ba沙门氏菌感染IPT13,gydF4y2Ba圣球菌gydF4y2Ba写明ATCC 6538gydF4y2Ba,gydF4y2Ba检查(表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。根据康et al。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba),coaggregation比例时显著降低致肠病的细菌聚合超过30%的水平。除了gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS24这证明coaggregation疲软gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(10.4%)和gydF4y2Ba圣球菌gydF4y2Ba(15.6%),大部分gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株显示一个有趣的coaggregation百分比与测试致肠病的细菌。这种能力尤其注册gydF4y2Ba年代。gydF4y2Ba沙门氏菌感染,其次是gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba圣球菌。gydF4y2Ba益生菌菌株与病原体的coaggregation能力发挥重要作用,使其形成一道屏障,阻止有害肠道病原体的殖民通常参与传染病(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。同样,它也显示了康et al。gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]的coaggregation能力gydF4y2Baw . cibariagydF4y2Ba隔离与口服biofilm-forming病原体gydF4y2Ba梭菌属nucleatumgydF4y2Ba扮演一个重要的宿主抗感染防御机制的干扰对生物膜的形成。gydF4y2Ba

3.5。安全性评价的gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba压力:溶血素和抗生素敏感性gydF4y2Ba

溶血性试验和一些抗生素耐药性检查研究gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株以评估他们的安全,避免对毒性的贡献。结果表明,所选择的-gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba压力是nonhemolytic和提出了一些抗性表型(表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。事实上,所有菌株对氯霉素敏感,克林霉素、氨苄青霉素,而且他们内在抗万古霉素,不存在潜在的风险水平基因转移(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2Ba(FAS23和FAS3)gydF4y2Baw . confusagydF4y2BaF80被丢弃的基础上进一步研究其对四环素(表获得性耐药gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。事实上,耐药的使用和/或毒性细菌作为益生菌代表了潜在的健康危害。出于这个原因,益生菌的安全性评价是需要避免抗生素相关风险和毒性基因转移和传播,造成细菌毒性的发病机制(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。此外,额外的毒性测试、致病性和传染性应该执行为了建立所选菌株的“安全”状态(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。在这些结果的基础上,两个潜在的益生菌菌株gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2Ba(F99和FAS24)选择深造。gydF4y2Ba

3.6。抗菌活性对肠道病原体gydF4y2Ba

如表所示gydF4y2Ba5gydF4y2Ba的拮抗效应两个选择gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba对六个致病性菌株非常变量。相反gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS24,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99提出广泛的抗菌活性对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌致肠病的。特别是,它显示高抑制对入侵活动gydF4y2Ba年代。gydF4y2Ba沙门氏菌感染和gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba隔离,据报道,穿透上皮细胞层和引起肠道感染gydF4y2Ba53gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。的隔离gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS24显示只有一个抗菌抑制gydF4y2Ba圣球菌gydF4y2Ba。不同的抗菌反应中观察到gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株对多种致病菌表示,这些活动不能与酸性。事实上,实验室的抑制活动通常是由于它能够产生抗菌分子如乳酸、细菌素,HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和其他有机酸(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。此外,抗菌性能检测gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99导致建议它使细菌建立自己和控制他们的环境。gydF4y2Ba

3.7。抑制病原体Caco-2细胞的粘附两Weissella菌株gydF4y2Ba

我们检查了两个的效果gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba压力antiadhesion活动gydF4y2BaEn。粪gydF4y2BaP592和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaN176 Caco-2细胞在两种条件下的竞争和排斥化验(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。粘附的病原体被两个抑制gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株。竞争性抑制的附着力gydF4y2BaEn。粪gydF4y2Ba大大减少了gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99(68%)和gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS24(58%)相比gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。另一方面,这两个概念gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba压力测试的能力排除病原体。如图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaFAS24和gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99的粘附明显减少gydF4y2BaEn。粪gydF4y2Ba与高度的94%和81%,分别,而他们显示适当的抑制致肠病的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba平均为50%。令人惊讶的是,竞争抑制和排斥的gydF4y2Ba在gydF4y2Ba。gydF4y2Ba粪gydF4y2Ba由两个gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株几乎是相似的。这证实了这两个粘附的抑制机制gydF4y2BaEn。粪gydF4y2Ba通过这些实验室菌株是相似的。此外,我们的研究结果表明,能够减少病原体粘附在实验室和strain-dependent病原体检测。这一事实可能是由于不同的因素,如可用粘附的位阻网站,adhesin受体,和竞争等附件网站和其他因素coaggregation两株(gydF4y2Ba56gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。同样,特异性粘附系统Caco-2细胞系,这似乎是不同革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,以及抗菌活性的缺失gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba可以解释粘附的适度抑制活动记录gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞相比,gydF4y2BaEn。粪。gydF4y2Ba正如上面显示的,这些发现表明,抑制物质的生产可以有效地参与病原体的antiadhesive影响上皮细胞(gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

3.8。碳源利用表型微阵列gydF4y2Ba

两个所选菌株的碳水化合物利用配置文件(gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99和FAS24)研究使用表现型阵列(生物测井)为了确定益生菌的代谢功能(表感兴趣gydF4y2BaS1gydF4y2Ba在文件gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。碳源利用率测试菌株(表之间的不同gydF4y2BaS1gydF4y2Ba在文件gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。这些菌株被通常能够使用氨基葡萄糖,葡糖酸、核糖、肌苷、氨基乙醇、葡聚糖、阿拉伯糖和熊果苷。gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99能够代谢甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、核糖、麦芽糖、龙胆二糖,葡萄糖苷和渐变。特别是,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99显示一个重要增长率plant-derivative复杂碳水化合物如木糖、纤维二糖、海藻糖、龙胆二糖和半乳糖gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。大多数的代谢低聚糖取代基,尤其是那些含有阿拉伯糖和木糖(通常称为阿糖基木聚糖寡糖或AXOS)不能由人类退化GIT的酶。益生菌粪便微生物的降解这些分子是不可或缺的。这个活动负责部分碳水化合物分解产物的形成和短链脂肪酸,导致肠道内稳态平衡的维护gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba]。此外,诸如生命起源以前的低聚糖是常用的,刺激特定的益生菌的活性,结肠癌和增加他们的丰富。gydF4y2Ba

3.9。胆固醇在体外和体内试验gydF4y2Ba

血清胆固醇水平升高是心血管疾病的危险因素(gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba]。因此,胆固醇同化已经成为一个重要的功能属性的益生菌菌株的选择,以防止疾病。实验室菌株的降胆固醇能力评估gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba胆汁的0.3%。结果表明,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99和FAS24菌株有能力把胆固醇从媒介;然而,他们表现出不同比例的降胆固醇能力49.04±0.04%和19.63±0.10%,分别。同化率gydF4y2Ba展出的w . halotoleransgydF4y2BaF99与益生菌gydF4y2Ba磅喂食gydF4y2BaGG和gydF4y2Ba磅杆菌gydF4y2BaNR74显示平均48%gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),高于一些益生菌参考gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba种虫害在先前的研究报告(gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

由于其高胆固醇同化能力,gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99评估了gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2BaWistar鼠。的管理gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba应变与高脂肪饮食喂养的老鼠被发现影响其血清血脂(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。与对照组相比,的值大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白在美联储组明显降低(p < 0.001)gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99。然而,对于高密度脂蛋白这种差异没有统计学意义(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。类似的结果也报道了Nocianitri [gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba]和Bendali [gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba]显示益生菌改善血脂的有效性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。这些数据提供了第一次筛选gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba压力的降低胆固醇的能力。这些结果代表的承诺作用的初步依据gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99 probiotic-based疗法,也可用于治疗和预防胆固醇代谢和代谢疾病,如功能性食品的发展与补充益生菌。gydF4y2Ba

4所示。结论gydF4y2Ba

在我们的数据视图,gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba益生菌特性的评估gydF4y2BaWeissellagydF4y2Ba菌株从旱地living-hosts具体表现的压力。大多数测试菌株显示拥有有趣的益生菌特性,包括抗胃肠条件下,细胞表面属性,和Caco-2粘附能力和MIM / PPk细胞,以及抑制和竞争排除有害的病原体。目前的研究导致了一线的选择gydF4y2Baw . halotoleransgydF4y2BaF99,从骆驼粪便,作为未来的研究,因为它假定应变几乎被发现符合需要的益生菌特性,包括上皮细胞粘附,碳水化合物的利用率和降低胆固醇的作用。它可以作为潜在的益生菌改善血脂兼职在动物和人类健康。然而,调节血清胆固醇的机制(s)需要进一步调查这样一个有前景的候选益生菌。基于本研究的发现肠道微生物区系的骆驼作为一个特殊的菌株来源模型。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

核苷酸序列数据用于支持本研究的发现在基因库中公开库在国家生物技术信息中心(NCBIgydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/gydF4y2Ba)。提供所有数据全部在结果与讨论。Biolog表型微阵列数据分析的结果用于支持本研究的结果中包括补充信息文件。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突有关的出版。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者承认欧盟的财政支持的范围BIODESERT项目(欧盟FP7-CSA-SA regpot - 2008 - 2,没有授予协议。245746)和突尼斯的高等教育和科学研究的范围LR03ES03实验室项目。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

补充表S1:碳水化合物利用两个积极的反应gydF4y2BaWeissella halotoleransgydF4y2Ba使用生物测井表型微阵列菌株。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba

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