栗色和白坚木单宁的影响在牛的瘤胃微生物群

文摘

植物膳食添加剂的使用是被评估为改善动物生产力的一种手段。单宁的影响似乎不仅直接影响膳食蛋白质的消化过程绑定,也间接地影响胃肠道微生物群。16 s rRNA基因的高通量测序被用来分析膳食补充剂的影响与栗子和白坚木单宁黑白花牛瘤胃微生物群的引导。细菌丰富低单宁对待动物,而瘤胃微生物群的整体人口结构没有明显被单宁。门之比厚壁菌门和拟杆菌门,与能量收获函数相关的一个参数,是增加单宁补充动物,本质上是由于选择性增长Ruminococcaceae属的成员普氏菌。Fibrolytic、淀粉分解的ureolytic单宁瘤胃细菌群落的改变,当产甲烷古菌减少。此外,以动物补充与单宁的pH值明显高于对照组,而脲酶活性表现出相反的模式。进一步的工作需要评估之间的关系的丹宁酸对瘤胃微生物群的影响和改变瘤胃发酵参数与牛有关的性能。

1。介绍

使用生物活性的植物化学物质作为天然饲料添加剂被广泛研究策略操纵瘤胃发酵的牛的生产力,减少甲烷生成的改善和增加氮利用效率(1- - - - - -3]。然而,缺乏足够的了解瘤胃微生物被认为是主要的知识差距阻碍有效的增强瘤胃功能。

单宁是一组复杂的多酚类化合物中发现许多植物物种,通常包括在反刍动物饲料等饮食和高粱4]。单宁被列为hydrolysable或浓缩的基于他们的化学结构。hydrolysable单宁酸的分子结构包括一个核心的葡萄糖与高卢和hexahydroxydiphenic酸酯化。浓缩单宁通常称为原花青素,聚合物flavon-3-ols或flavon-3 4-diols如儿茶素和表儿茶素(5]。单宁可以复杂的蛋白质、淀粉、维生素和矿物质在温和的pH值,在瘤胃的条件,和分离低pH值,包括胃和十二指肠的初始部分6]。提高饲料的消化率和效率利用率增加单宁引起反刍动物的饮食一直归因于他们沉淀蛋白质的能力,允许绕过瘤胃消化和提高蛋白质在小肠级别的可用性。然而,以绕过不能完全解释与单宁相关联的性能改进添加饲料。

很长一段时间,人们认为单宁减少体重增加和养分的利用效率。然而,现在知道,他们可能是有益的或有害的影响取决于单宁来源、分子结构、用量,和动物物种4,7- - - - - -9]。高剂量的单宁减少自愿的采食量和养分消化率,而适度的浓度可以提高饲料利用率(4]。从白坚木中提取单宁和栗子树一直作为反刍动物的添加剂以提高性能和减少尿氮排泄10]。最近的一份报告显示,添加适量浓度的栗色和白坚木单宁奶牛并不影响动物的饮食性能,但增加牛奶蛋白产量和减少尿氮排泄(11]。其他作者观察到的栗色和白坚木单宁干物质摄入增加,平均每日增加,体重和最终的引导在完成饲养场阶段(12]。这两种单宁有不同的营养作用和毒性作用在家畜营养。

单宁修改反刍动物的消化过程不仅通过绑定膳食蛋白质,而且通过调制的瘤胃微生物群(7,13]。牛瘤胃房子一个复杂和高度密集的微生物群,负责牛消化植物质量转化为能量的能力。近年来,肠道微生物群组成和能量收获函数之间的联系已被观察到在人类和老鼠14,15]。瘤胃微生物群成分被发现强烈与每日在牛乳脂率(16,17]。瘤胃微生物种群的和与饮食相关的变化之前描述(18]。然而,尽管许多研究已经完成对单宁的影响反刍动物生理和新陈代谢的命运19],栗色和白坚木单宁的影响瘤胃微生物群的牛还没有完全描述。假设下研究在目前的工作是,单宁改变瘤胃细菌种类的,因此可以用作膳食策略来调节瘤胃功能。本研究的目的是分析在活的有机体内影响的单宁混合来自栗和白坚木荷斯坦牛的瘤胃细菌种群的大规模16 s rRNA基因测序,研究瘤胃微生物组成和生理参数之间的关系。

2。材料和方法

2.1。动物处理、饮食治疗,测定瘤胃参数

这项研究是使用瘤胃fistulated荷斯坦奶牛的Holando阿根廷−品种 平均体重为584±12公斤(平均数±标准差)。为了模拟生产条件,饮食逐渐改变了从低淀粉(60%苜蓿贝尔,40%集中由80%的地面玉米谷物和大豆20%)高淀粉(20%的苜蓿贝尔,80%的精矿)改编段14天(从1 - d 14)。动物被保存在高淀粉饮食21天(从15 - 35 d d)饮食治疗开始之前,为了保证瘤胃微生物群的完全适应。36天,动物被随机分为两组,每组3引导和被分配到其中一个饮食治疗:(1)对照组没有添加剂,或(2)tannins-supplemented集团栗色和白坚木单宁是添加到饮食的浓度(表2 g每公斤饲料1)。控制和tannins-supplemented饮食管理的动物直到最后治疗期(从d 36 d 48)。twelve-day治疗期间重复了一次,在“冲刷”时间的21天期间,所有的动物都收到了控制饮食。瘤胃样本取自每只动物在每个治疗期微生物群分析。饮食提供了随意在整个实验总混合配给一旦每日在0800 h。平均干物质摄入量为12.8±0.6公斤/动物/天(平均数±标准差)。

的单宁混合得到Silvateam (Indunor SA、阿根廷)和包含栗木三分之一(齿栗叶的可能单宁提取和白坚木三分之二(Schinopsis lorentzii)单宁提取按重量。白坚木提取主要由flavan-3-ols浓缩单宁(> 84%)而栗提取包含主要digalloyl葡萄糖hydrolysable单宁(> 78%)。白坚木的详细描述和栗提取物化学成分被描述在别处(11]。

通过背瘤胃内容收集从腹侧囊的瘤胃瘘管,把一把材料从固体材料和液体之间的界面层。在无菌容器收集的样本(200毫升包括固体和液体物质),在液态氮冷冻,储存在−80°C,直到进一步的处理。样本的一部分用于测定瘤胃生理参数。以酒的酸度测定使用标准计。脲酶活性(UA)测量根据:−Knapp协会的修改方法。非蛋白氮(NPN)决心通过凯氏法(VELP Scientifica,意大利)。动物是由受过训练的人员照顾只有和实验协议和程序使用根据协议进行了27/2011的机构实验动物保健和使用委员会(CICVyA-INTA)。

2.2。DNA提取

20毫升的均质均匀瘤胃酒是冻干的DNA提取前为了最大化微生物密度(1 g干物质/样本)。DNA提取进行了使用QIAamp DNA凳子工具包(试剂盒、希尔登,德国)制造商的指示用细微的修改。简而言之,100毫克的冻干瘤胃被孵化称重和细胞溶解在95°C 5分钟。DNA洗脱于100年完成μl(缓冲AE,孵化后在室温下10分钟。DNA琼脂糖凝胶电泳和DNA浓度以评估质量决定使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德、美国)。DNA保持在−20°C,直到进一步的处理。

2.3。16 s rRNA基因的高通量测序

16 s rRNA基因V3-V4区域放大使用Illumina公司引物(转发:5′CCTACGGGNGGCWGCAG 3′,相反:5′GGACTACHVGGGTATCTAATCC 3′)附带标准适配器序列条码技术和多路复用。16 s基因库建设和高通量测序进行Macrogen Inc .(韩国首尔)Illumina公司MiSeq平台制造商的指令后20.]。为了减少不平衡和有偏见的基本成分,PhiX控制库的15%飙升到扩增子池。由于一个问题与反向读取的长度,没有足够长的时间来实现合并的paired-end序列,只有向前读覆盖V3和其侧翼地区被用于进一步的生物信息学分析。在这项研究中生成的数据集是根据请求可用。

2.4。生物信息学分析

FASTQ文件将使用Trimmomatic v0.33 [21),也删除了所有底漆和适配器序列和删除前导和尾随基地如果质量值低于9和图3,分别。滑动窗口修剪也执行,以及削减如果平均质量低于4-base窗口问15。多路分解和质量过滤是通过使用脚本split_libraries_fastq.py,这是部分QIIME v1.9.1软件包(22]。phr质量分数的阈值 基地的选择进行严格的质量控制处理。嵌合序列在使用USERCH QIIME算法过滤掉。Open-reference操作分类单位(辣子鸡)选择在QIIME使用UCLUST和USEARCH算法执行。每个序列分配分类法对绿色煤电参考OTU构建版本13.8,使用97%的序列相似性阈值。辣子鸡丰度低于0.005%的人从最终OTU表,为了避免微生物多样性高估(23]。正常化OTU计数从10.000到210.000是通过执行多个稀疏序列重复步骤10.000和10日在每一个稀疏的深度。由此产生的多个稀薄OTU表用于进一步分析。主坐标分析(PCoA)情节生成QIIME缺省选项使用一个距离矩阵计算未加权的UniFrac指标。分组的重要性在PCoA情节分析测试的相似性(ANOSIM)与999年QIIME排列。这项工作从生物信息学计算资源单位使用,Biotecnologia皇家研究院(CICVyA-INTA)。

2.5。统计分析

细菌种群的相对丰度统计分析使用邮票v2.1.3 [24]。细菌类群的相对丰度控制和丹宁治疗组相比,在每个级别的分类(门、类、秩序、家庭和属)使用白色的非参数双尾以及1.000排列。比较生理数据和多样性的使用非参数估计量计算双尾曼−惠特尼测试(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国),被认为是具有统计学意义 。

3所示。结果

3812179高通量测序后,读取得到的平均346562±42326读/样品。严格过滤基于序列的长度和质量进行分类分配之前,导致2951356年读平均长度为267±22个碱基对。

辣子鸡过滤后检测到的总数是2.263,但这个数字表现出高个人间变异(图1)。我们发现数量的辣子鸡tannins-supplemented动物往往低于对照组 (图2(一个))。香农多样性指数,估计内部样品的复杂性,没有明显受单宁的影响 (图2 (b))。PCoA基于未加权的UniFrac度量执行为了探索在瘤胃微生物组成的异同在治疗组(图3)。ANOSIM检测细菌多样性之间没有显著差异控制和单宁的饮食治疗 。

厚壁菌门和拟杆菌门牛瘤胃液体占主导地位的细菌类群,占总数近90%的微生物群。然而,大型观察个别间方差拟杆菌门和壁厚菌门的相对丰度在不同的动物。在对照组,细菌种类属于门拟杆菌是所有动物中最丰富(平均52.1%),而厚壁菌门总微生物群的占37.6%。然而,这种优势是反向的单宁对待动物,与体内壁厚菌门的微生物的比例明显高于46.2%, 在拟杆菌)和减少44.6% 。因此,引导补充单宁呈现一个趋势的高厚壁菌门和拟杆菌门比率与对照组相比(1.08和0.73, )(图4)。

显著差异在某些类群的丰度检测控制和单宁之间对待动物(图5)。拟杆菌门中,最丰富的属普氏菌占40%以上的这门。的平均丰度普氏菌比对照组低tannins-supplemented动物,虽然表现出高度的方差在动物中(16.5和21.9%, )。梭状芽胞杆菌是主要的类占90%以上的总厚壁菌门,并显著提高单宁对待动物(41.5和34.6, )。在梭状芽胞杆菌,Ruminococcaceae是最丰富的家庭和显示明显高于tannins-supplemented动物丰度(17.8%比10.7%, )。在对照组中,大多数序列对应于家庭Ruminococcaceae属于非保密(7.9%)和属的成员瘤胃球菌属(2.6%)。类群都增强引导治疗的单宁,丰度为12.6% 和4.9% ,分别。内的其他nonclostridial细菌门壁厚菌门被单宁显著改变,包括Erysipelotrichi类的成员。一些Erysipelotrichi增强(属L7A-E11, ;和属p - 75 a5, ),而其他人则降低(属RFN20, 单宁)- - - - - -补充动物。类杆菌(属的成员链球菌和乳酸菌)显示只有适度增加他们的富足。与此同时,属Fibrobacter明显受单宁,占总额的0.10%微生物群在对照组中,只有0.005%单宁对待动物吗 。其他一些小fibrolytic细菌更丰富的单宁引导治疗,包括属Blautia(0.08和0.02%, )和家庭Eubacteriaceae属的成员Anaerofustis(0.06和0.02%, )。

在糖发酵细菌,属是最丰富的分类单元普氏菌,其丰度降低了5.4%的丹宁酸治疗动物,如上所述。属密螺旋体属也减少了单宁治疗引导(0.41和1.21%, )。Veillonellaceae成员之间,属Succiniclasticum,专门从事琥珀酸发酵丙酸,单宁水平翻倍,对待动物(3.99和1.99%, )。分解脂肪的属Anaerovibrio显著提高了单宁(0.11和0.05%, )。属月形单胞菌属也增加了单宁补充动物(0.11和0.05%, )。在ureolytic细菌,属丁酸弧菌属是最丰富的一个负面影响是丹宁治疗(1.80和2.36%),以及密螺旋体属和琥珀酸弧菌属(0.009和0.02%)。另一方面,产甲烷菌属于门Euryarchaeota不太丰富的单宁补充引导(1.37和2.03%),水平与瘤胃pH值呈负相关 。属Methanosphaera显著降低了单宁(0.06%和0.16%, )。

pH值的确定、脲酶活性和NPN型是所有瘤胃样品连同微生物群进行成分分析。单宁治疗引导瘤胃pH值明显高于对照组(6.30和5.88, )(图6(一))。脲酶活性表现出相反的模式,显示单宁引导治疗显著下降(图6 (b))。此外,pH值之间存在强烈的负相关和脲酶活性检测 。NPN型治疗(图没有明显改变6 (c))。

4所示。讨论

反刍动物瘤胃微生物的多样性是一个关键的特性,赋予牛的能力适应范围广泛的饮食条件(25]。近年来,主机在反刍动物微生物个性的概念获得了支持,因为许多研究发现大量的分类群的存在或丰度在瘤胃的个体之间有明显的差别26- - - - - -28]。饮食单宁减少瘤胃丰富但没有显著影响(即细菌群落的复杂性。,类群的相对丰度)之间的平衡。最近的一份报告发现增加瘤胃丰富但没有香农多样性指数的变化后补充与多酚类物质的混合精油在乳制品小母牛高谷物饮食,支持多酚类物质可以影响细菌丰富而不破坏整体瘤胃微生物群人口结构(29日]。符合这一点,β多样性分析发现无显著差异在瘤胃细菌多样性之间的控制和单宁引导治疗。低在瘤胃微生物丰富最近发现紧密与奶牛饲料效率更高(30.]。作者认为低丰富有效的动物瘤胃的结果在一个简单的代谢网络导致更高浓度的特定组件,用于支持主机的能源需求。在一起,丰富多样性分析表明,细菌减少,而整个细菌瘤胃的复杂性没有明显影响板栗和白坚木单宁的补充。

的优势类群厚壁菌门和拟杆菌门牛瘤胃液体是一种常见的胃肠道微生物特性的单胃的生物和反刍动物(15,17,28,31日]。亨德森等人还发现,增加瘤胃总厚壁菌门的丰度与减少大量的拟杆菌门都牛 和羊 (32]。其他作者发现拟杆菌门中含量最丰富的门从奶牛瘤胃样品但有些动物表现出更高比例的厚壁菌门补偿较低丰度的拟杆菌(17]。我们的结果同意这些观点,因为一个强大的逆相关性发现厚壁菌门和拟杆菌门的丰度 。这些结果表明,厚壁菌门和拟杆菌门争夺可用资源在瘤胃和丹宁酸会使局面有利于厚壁菌门。

厚壁菌门比拟杆菌门已被证明影响能量收获和身体脂肪积累在人类和老鼠14,15]。随着脂肪酸的吸收增加,更多的能量被发现有效地从饮食中获得在肥胖老鼠,说明能源获取的厚壁菌门和提高效率之间的联系(14]。在牛、厚壁菌门拟杆菌门比被发现强烈与日常乳脂率(17]。最近的一项研究发现,大量的瘤胃壁厚菌门的积极与引导的每日平均体重增长,表明这些细菌发挥重要作用在牛的饲料效率(33]。因此,壁厚菌门的增加可能引起的拟杆菌门比单宁可以提高牛的表现,正如前面提出的其他作者(19]。

纤维降解是一个复杂的过程由一群微生物能够消化植物多糖降解纤维素的,主要通过生产hemicellulolytic, pectinolytic酶(34]。瘤胃纤维素分解活动涉及到不同细菌属于属社区的主要成员瘤胃球菌属和Fibrobacter,而主要hemicellulolytic细菌属于属瘤胃球菌属,普氏菌,和丁酸弧菌属(34- - - - - -37]。单宁的混合管理增加Ruminococcaceae和其他成员门壁厚菌门而抑制属普氏菌和Fibrobacter。普氏菌物种的记录作用的新陈代谢淀粉、半纤维素、果胶、蛋白质分解代谢(25]。属可能的丰度高的结果大代谢领域所占据的不同物种具有相似的代谢功能也可能被关联到一个高的遗传变异,使属的成员普氏菌占领不同的生态位在瘤胃内(38- - - - - -40]。例如,普氏菌大量已被证明是高等动物瘤胃的肉牛饲料效率较低(41]。以前的研究报道一个伟大的多样性的敏感性普氏菌物种单宁(42),这就可以解释这个属的低丰度检测tannins-supplemented引导。自属普氏菌具有高的遗传多样性和广泛的输出代谢物(38- - - - - -40),他们的替代瘤胃球菌属可能会导致一个更简单的产品档案专业支持主机的能源需求(30.]。我们的结果与先前的研究一致,发现显著减少Fibrobacter和普氏菌瘤胃人口与浓缩单宁和hydrolysable补充后,包括栗和白坚木单宁(43,44]。

瘤胃fibrolytic函数是由很大程度上与重叠冗余的微生物群落分布的代谢功能,这fibrolytic社区扰动后恢复其结构和功能的能力,这种现象被称为弹性(27]。在这种情况下,观察到的单宁的fibrolytic细菌多样性的变化引导治疗可能会导致物理化学和生物机制描述的文献,包括直接交互的单宁与纤维(45),这可能改变微生物攻击的可用面积,抑制某些fibrolytic类群的单宁抗菌活性(46),调制fibrolytic细菌物种由于瘤胃pH值的变化,由于瘤胃的某些fibrolytic类群是抑制在低pH值高的谷物饮食(36,47]。

瘤胃淀粉水解和saccharolytic细菌也受到饮食治疗与单宁的影响,主要是通过减少属普氏菌和密螺旋体属。其他淀粉分解的属适度增加tannins-fed引导等链球菌,双歧杆菌,和乳酸菌。淀粉分解的活动通常是提高反刍动物消耗高的谷物饮食(18,48,49]。粮食的速度退化,这些微生物群落在维持瘤胃内稳态中发挥着关键作用,因为快速淀粉发酵产生大量的有机酸,因此生产瘤胃pH值下降,可能导致代谢性酸中毒(50]。先前的研究表明,丹宁酸和单宁白坚木降低的速率在瘤胃微生物水解富含淀粉的谷物胚乳蛋白的物理改性矩阵(45]。这个物理调制淀粉降解可以解释下大量的糖发酵类群中发现单宁引导治疗,以及瘤胃pH值观察到这一群体就越高。

瘤胃微生物发酵产品的活动,主要是短链挥发性脂肪酸,作为反刍动物能量的主要来源,直接影响动物的生理参数和饲料利用效率(16]。一些家庭Veillonellaceae产生丙酸作为主要发酵产品,降低甲烷排放(51),增强在单宁对待动物。有趣的是,一些月形单胞菌属物种可以打破tannin-protein复合物和使用单宁作为能量来源52,53]。因此,大量的高月形单胞菌属引导治疗的单宁可以一定程度上是由于单宁的可用性为直接的能量来源。同时,成员的类Erysipelotrichi与肉牛饲料效率(33,51,54),也由单宁调制治疗。

在发酵过程中甲烷生产饲料的瘤胃代表的损失2 - 12%的总能量(1),它是由一群古细菌统称为产甲烷菌属于门Euryarchaeota。微生物产生甲烷,第二大的人为温室气体,全球变暖的可能性是二氧化碳的25倍(55]。在目前的研究中,减少产甲烷古菌的单宁补充引导以及逆相关性检测门Euryarchaeota的丰度和瘤胃的pH值 。单宁被认为直接抑制产甲烷菌,以及间接限制通过减少甲烷生成的氢可用性(1,55]。属Saminathan等人发现了一个显著的下降Methanobrevibacter治疗后的瘤胃样品浓缩单宁在体外(56]。其他作者所描述的线性减少属Methanobrevibacter从松树皮膳食补充后浓缩单宁山羊(31日]。

瘤胃单宁引导治疗的pH值明显高于对照组,而脲酶活性表现出相反的模式。这些结果同意先前的报告,发现增加瘤胃pH值后补充栗色和白坚木单宁(57,58]。其他作者观察到喂养栗色和白坚木单宁脲酶活性降低奶牛的粪便(10,11]。

饲料尿素是一种有效的氮在肉牛常用的饮食来源。Ureolytic瘤胃细菌生产脲酶水解尿素氨,随后被用于合成微生物的蛋白质和氨基酸。通常情况下,尿素水解的速度超过了氨利用率,导致低效率的尿素利用率和增加血液中有毒的氨浓度(59]。Ureolytic瘤胃细菌组成一个高度多样化的组织的主要物种属于属琥珀酸弧菌属,密螺旋体属,拟杆菌,丁酸弧菌属,链球菌,和双歧杆菌属(60,61年]。我们发现最丰富ureolytic属丁酸弧菌属和密螺旋体属单宁,负面影响治疗。因此,观察到的瘤胃脲酶活性下降可能与这些urease-producing类群的减少有关。先前的研究还观察到以脲酶活性下降后添加单宁饮食但之间的直接交互的单宁和脲酶酶被假定为负责这抑制[62年]。

5。结论

当前的研究表明,板栗和白坚木单宁添加到饮食的黑白花牛引导修改瘤胃微生物群组成,特别是纤维和淀粉降解细菌,主要是通过减少大量的普氏菌和Fibrobacter而支持Ruminococcaceae和门壁厚菌门的其他成员。单宁处理显著提高瘤胃酒pH值和脲酶活性下降。进一步的工作是必要的,以评估可能的关系单宁能够修改瘤胃微生物群组成和瘤胃发酵参数的变化与能源和肉牛饲料效率有关,如这个概要文件的短链脂肪酸和氨和甲烷的排放。

的利益冲突

作者声明没有已知的利益冲突与此相关刊物和没有金融支持这项工作,可能会影响其结果。

确认

作者感谢阿尔弗雷多·伊万·马丁内斯卡塞雷斯在安装和启动期间的技术援助的生物信息学工具用于这项研究。这项工作是支持由INTA (PNSA 1115052和PNBIO 1115052)。由国家提供了额外的支持。

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