文摘
沙门氏菌血清Pullorum是家禽死亡的主要原因之一。理解分子反应在应对感染鸡美国血清在揭示发病和疾病的机制很重要的进步。已经有研究识别相关的基因沙门氏菌感染通过微分表达式的分析,但调控基因之间的关系还没有被调查。在这项研究中,我们采用加权基因coexpression网络分析(WGCNA)和微分coexpression分析(DCEA)来识别coexpression模块通过探索微阵列数据来源于鸡脾组织的响应美国血清感染。共有19个模块与Jak-STAT相关的13538个基因的信号通路、细胞外基质、细胞骨架组织、肌动蛋白细胞骨架的规定,g蛋白耦合受体活动,toll样受体信号通路,免疫系统和流程;其中,14个不同coexpressed模块(DCMs)和2856年(DCGs系统)的差异coexpressed基因被确定。全球模块之间基因的表达受感染和未感染鸡略有差异对全球coexpression但相当大的变化。此外,DCGs系统都与中心的模块。这些结果为未来的研究将有助于优化候选基因沙门氏菌感染。
1。介绍
鸡在全球农业经济的重要组成部分,作为对人类蛋白质的主要来源之一。然而,家禽行业一直受到各种疾病的威胁,包括那些由病毒引起,细菌,寄生虫感染。沙门氏菌血清型Pullorum (年代。Pullorum)是其中最重要的病原体家禽造成严重系统性疾病(1,2]。预防和控制。Pullorum鸡、主机响应对这种病原体研究了几十年。虽然取得了重大进展,尤其是在识别分子和基因在宿主免疫反应(3,4和粘膜炎症5,6),以及他们的微分表达式在感染(7- - - - - -10),精确的通路调节免疫沙门氏菌感染使用系统生物学方法还没有被调查。虽然基因差异表达分析(DEA)提供了重要的信息,如识别的基因表达在不同时期感染,这告诉我们对发病机制的理解,确定基因交互使用系统生物学方法大大提高了我们的知识在机械和监管水平。大量的信息基因相互作用可以在微阵列数据集和运用网络方法单个基因和系统之间的差距可以桥接11- - - - - -13]。生物系统中的模块化允许独立的组件的研究和识别模块内部的基因关系。现代的方法,如加权基因coexpression网络分析(WGCNA) [14),可以识别模块与高度相关的表达水平在样品和被用来确定新的候选人监管分子和网络沙门氏菌来华的猪(15]。不同coexpressed模块(DCMs)也可以被识别(16]。模块的整体变化会反映在转录和coexpression改变单个基因。一般来说,基因表达水平变化在疾病或感染,但也有一些报道,看似无意义的度也扮演着一个关键角色,一种疾病,因为他们的交互与其他基因变化显著(17]。这些基因可以通过微分coexpression识别分析(DCEA),我可以使用整体分析单个基因(17- - - - - -19]。因此,结合WGCNA和DCEA方法可以识别交互模块和不同coexpressed基因(常规心电图)感染,而控制。这里,我们开采的分子网络关系的微分coexpression模块和基因使用微阵列数据的脾脏。Pullorum- - - - - -感染和未感染鸡使用WGCNA和DCEA(图1)。结果补传统DEA和增加我们的理解发生在监管机制沙门氏菌感染。
2。材料和方法
2.1。微阵列数据采集和处理
一个全面的转录组数据集来自微阵列分析脾脏从鸡挑战108CFU的沙门氏菌血清型Pullorum或mock-challenged同样体积的蒸馏水(控制)从基因表达获得综合(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/加入)(数量:GSE59663)。安捷伦低聚糖微阵列芯片的数据集生成包含43663个探针集。在这项研究中,我们首先简化数据集通过扣除14920探针集unmappable任何基因id或映射到多个id。对于多个探针集映射到一个相同的基因,探测器,这是最常与表达水平最高,是维护,以确保只有一个探针集被调查一个基因。如果多个探针集了上述步骤后,他们的平均场强。最后,13538探针之间的一对一匹配集和13538个基因。
三个生物复制(芯片)为每个时间点是在挑战群对这些数据集。然而,在每个时间点在对照组,与同样只有一个芯片用于杂交混合mRNA示例包含三个控制样本。我们平均每个时间点复制,除了在21天,包含两个复制的,形成的数据集的挑战与10个样本组;这个数据集相当于对照组的数据集。数据集的分位数函数归一化的normalizeQuantiles R包limma [20.]。
2.2。加权基因Coexpression网络建设和识别模块
加权基因coexpression网络分析(WGCNA)是用于检测coexpression模块挑战样本数据集的(14,21]。块的R功能模块实现了如下参数:功率= 12,minModuleSize = 100, networkType = "签署。“微阵列数据处理如下所述。
成对皮尔逊相关系数的计算挑战组的所有基因,紧随其后的是邻接矩阵的建设使用幂函数: 在哪里和是th和jth基因表达特征,分别形成一个签署了加权关联网络;和使用默认值(例如,)。拓扑重叠测量(汤姆)计算如下: 在哪里是连接强度的总和一个基因与其他基因网络。是其他网络的基因。
后来,汤姆被计算为生物网络的互联性的重要措施。基因具有类似coexpression关系组合在一起进行分层集群拓扑上重叠。随后,基因等级集群使用汤姆作为距离测量和模块是由选择一个高度截止0.995的系统树图。高度相似的模块通过聚类,并合并在一起使用一个动态伐木工具算法(14]。Eigengene指第一主成分为给定的模块,模块可以计算画出轨迹曲线(14]。
2.3。识别不同Coexpressed模块
不同coexpressed模块(DCMs)被确定使用的基因簇coexpression分析(GSCA),采用了length-normalized欧几里得距离测量coexpression区别两两之间的相关性感染和控制组织(16]。 在哪里是基因的数目对基因两两相关的所有模块。和是一个基因的相关系数对控制和感染组,分别。
零距离分布是由交换样品在10000倍的收益率基因片段的具体条件值。模块与值< 0.01被认为是显著差异coexpressed。
2.4。识别不同Coexpressed基因
微分coexpression分析(DCEA)被使用R包DCGL实现,这是一个有用的工具来识别不同coexpressed基因(DCGs系统)和不同coexpressed链接(dcl) [17- - - - - -19]。然后应用R函数DCe值调整的错误发现率(罗斯福)使用Benjamini-Hochberg方法来减少大量的假阳性结果(22]。罗斯福< 0.001的基因被选为DCGs系统。
2.5。基因本体论(去)和通路浓缩Coexpression模块
去浓缩和KEGG通路分析网络模块使用数据库进行注释,可视化和综合发现(大卫,v6.7)计划使用所有鸡基因为背景(23,24]。修改后的确切概率法对多个测试调整Benjamini-Hochberg方法被用来确定模块基因显著富集条件(22]。
2.6。网络可视化
复杂网络的生物信息学软件Cytoscape (v3.1.1)被用来可视化两两基因之间的关系(25]。
3所示。结果
3.1。加权基因Coexpression网络分析
使用blockwiseModules R函数,共有19个模块从100年到3000年的13538种不同的基因的基因恢复年代。Pullorum-infected组(表1)。每个模块被分配一个独特的颜色,包括灰色373年未赋值的基因。基因在同一模块共享相同或相似的表达模式所记录的轨迹曲线(图2)。
后续分析使用大卫生物特征识别模块,有可能与感染有关。Pullorum(图6和表1),如Jak-STAT信号通路(模块lightgreen) [26),细胞外基质(ECM)(模块grey60) [27模块),细胞骨架组织(绿色),肌动蛋白细胞骨架调节模块(蓝色)(28模块),g蛋白耦合受体活动(红色),toll样受体信号通路(紫色)模块,模块(蓝色)和免疫系统流程。ECM基因和细胞粘附基因明显丰富模块grey60和青色(罗斯福=和),分别为(表1)。grey60和青色模块也显示显著相似表达模式(eigengenes相关= 0.76;)。早些时候报道了这些观察是一致的与其他宿主细胞外基质蛋白的关键作用和细菌外膜结构在粘附和入侵沙门氏菌(27]。
3.2。模块的稳定性
测试的重现性识别模块,我们进行了抽样测试,我们随机抽取一半的样品计算新intramodule连接。采样模块重复了100次,然后稳定表达的相关性intramodule原始和采样之间的连接的(29日]。大多数模块显示稳定性好;模块鲑鱼是最不稳定的(图3)。
3.3。模块保护分析
我们调查是否年代。Pullorum-infected模块保存在相应的控制通过测试是否infection-associated coexpression对照组网络可以被复制。保存分数为所有的模块都列在表1,在这总结分数< 2,2 - 10,> 10表明没有证据,weak-to-moderate证据,分别和强有力的证据保存模块。保存分析提供了强有力的证据来支持保护模块青绿色,棕色,蓝色,黄色,绿色,红色,粉色,紫色,所有含有相当大量的基因,但没有证据支持保护模块淡青色,lightgreen,品红色,和黑色的膜,Jak-STAT信号通路,g蛋白耦合受体活动,分别和突触(表1)。
3.4。模块的基因表达和Coexpression比较
我们比较模块中基因的表达和coexpression感染和对照组之间的水平。小提琴在图4(一)显示模块的基因表达感染与对照组没有显著不同,和表达强度的分布是相似的。随后,我们比较了基因coexpression水平通过计算为每个模块连接。模块绿松石展览最大的连接性,因为它包含了最多的基因(2998个基因)。模块蓝色(2581个基因),黄色(1122个基因),布朗(1349个基因)和绿色(1056个基因),其中包括相当数量的基因,显示下一个最高的连接性。此外,coexpression水平不同模块之间的两个条件。coexpressions加强在受感染的状态(图4 (b))。
(一)
(b)
3.5。识别不同Coexpressed模块
基因簇coexpression分析(GSCA)显示模块14的19显著差异coexpressed (通过引导抽样测试)(表2)。其中,模块黑色,洋红色、鲑鱼,淡青色显著差异coexpressed。这些观察与模块保存在协议分析的显著差异coexpressed模块(DCM)只有弱保存在对照组。
3.6。识别不同Coexpressed基因
共有2856名不同coexpressed基因(常规心电图)选择了一个错误发现率(罗斯福)小于0.001使用DCe方法DCGL包。和284213不同coexpressed链接相同(dcl)签署,签署了82619年不同,272491人交换链接。
此外,我们绘制了DCGs系统的每个模块,发现DCMs充实DCGs系统。例如,152 DCGs系统出现在模块洋红色总结1.82黑色,231 DCGs系统模块总结1.97,147 DCGs系统模块鲑鱼总结2.14。在网络生物学中心的基因是一个很好的代表一个模块。我们确定了中心基因的所有模块。表2给的基因名称不仅中心基因还DCGs系统每个模块。
4所示。讨论
我们建造了一个基因网络的。使用加权Pullorum-infected鸡基因coexpression网络分析(WGCNA)时间序列数据的微阵列。这个模块检测策略利用固有的生物差异前瞻性群组研究揭示转录系统的模块化的组织和功能。时间序列表达谱允许这些基因的转录调控研究coexpression网络中感染。基于网络分析提供了一个系统性的理解网络成员之间的关系通过关注全基因组基因模块而不是单个基因(30.]。微分表达式分析(DEA)的目的是识别基因表达显著更高或更低一组与另一个。相比之下,WGCNA不是偏向基因表达显著变化。此外,微阵列数据的维数在本研究从13538年开始减少基因19模块,大大增加了识别能力整合多种基因的表达变化。
模块表达分析显示模块鲑鱼最丰富,但表现出最大的基因表达的变化导致不稳定模块建设。基因表达是最稳定的内部模块midnightblue(图4(一))。模块中基因的表达分布在不同条件(感染与控制)是一样的。coexpression水平进一步比较。不同条件下的coexpression比较显示,重大的改变。我们调查的关键模块和基因导致的差异。GSCA分析确定十显著差异coexpressed模块(DCMs),这是按照模块保存结果显著coexpression差异很少的证据保全。调控基因之间的关系可以解析为两两基因表达水平之间的相关性,所以两个条件之间的coexpression模式的变化可能表明功能失调的疾病[监管系统31日]。相关模块lightgreen Jak-STAT信号通路和淡青色膜锚定功能这两个弱(表保存模块1和图5)。因此,这些模块可能是相关的年代。Pullorum感染鸡。
(一)
(b)
此外,我们研究了驱动基因导致coexpression的区别。微分coexpression分析(DCEA)方法应用,和2856年不同coexpressed基因(DCGs系统)被确定。微分表达式分析(DEA)相比,发现与234度(DCGs系统重叠的t以及值小于0.01)是重要的(超几何测试=),这表明微分表达式和微分coexpression有些关联,这是符合一个以前的报告17]。然而,有很多沙门氏菌DCEA感染相关性基因识别的方法。一个常规心电图识别是顶部WASF1,这是一个重要的基因沙门氏菌感染途径和不确定度(表达褶皱变化:1.08;t以及0.34)的价值。编码的蛋白质,WASF1Wiskott-Aldrich综合症蛋白家族中的一员,下游扮演着关键的角色Rac小gtpaseρ的家庭,在调节所需的肌动蛋白细胞骨架膜弄皱。这个基因关联与肌动蛋白成核核心Arp2/3复杂而增强肌动蛋白聚合体外(32]。另一个基因,CDC42(褶皱变化= 1.02;),ρ亚科的一员actin-organizing小GTP-binding蛋白质相互作用WASF1和是至关重要的。沙门氏菌感染进入宿主细胞(33,34]。CDC42没有选为常规心电图与错误发现率(罗斯福),但它与基因相互作用PAK7(褶皱变化= 1.95;)[35,36],CDC42EP3(褶皱变化= 1.05;)[37,38],PAK1(褶皱变化= 0.97;)[39],PARD6B(褶皱变化= 0.76;)[40,41],PARD6A(褶皱变化= 1.75;)[29日,40),而IQGAP2(褶皱变化= 1.58;)[42),这些都是确定为DCGs系统。Carow和次报告基因SOCS3,也被确认为一种常规心电图(褶皱改变= 1.54;),是一个主要的监管机构和控制感染和炎症免疫内稳态在生理和病理条件下,如感染和自身免疫43]。SOCS3是一个中心基因相关的模块lightgreen Jak-STAT信号通路,一个重要的途径沙门氏菌感染(44]。众所周知,Jak-STAT途径可以调节细胞生长、细胞凋亡、免疫、炎症反应和免疫反应,因为它的意义Jak-STAT途径通常是利用病原体(45]。在我们的研究中,我们发现Jak-STAT通路基因显著富集的模块lightgreen不检测控制。因此我们认为SOCS3和其他Jak-STAT通路基因可能一起调节有机体的活动感染,导致这个模块coexpressed不同。
上述结果显示某些特定子网的感染,尽管现有常见的网络是否在控制感染组。我们从十大构造两个coexpression网络中心基因的表达谱每个模块从两个不同的条件。如数据所示6(一)和6 (b),共同核心网络,包括最保存模块感染和对照组之间。然而,一些密切互动子网在感染控制消失了。这些infection-specific子网Jak-STAT成员包括基因信号通路(模块lightgreen);其他人与膜锚定(模块淡青色),刺激神经组织的中的交互(模块鲑鱼),和溶酶体处理(模块tan)表示,这些子网系统中特异表达的感染。虽然只有一个数据集是用在这里,由于缺少相关的微阵列数据集出版,这些礼物结果推进我们的理解所涉及的细胞生物学和免疫调节通路沙门氏菌感染鸡的主人。
缩写
| 大卫: | 数据库的注释、可视化和综合发现 |
| DCEA: | 微分coexpression分析 |
| 常规心电图: | 不同coexpressed基因 |
| DCL: | 不同coexpressed链接 |
| DCM: | 不同coexpressed模块 |
| DEA: | 差异表达分析 |
| ECM: | 细胞外基质 |
| 罗斯福: | 错误发现率 |
| 走: | 基因本体论 |
| GSCA: | 基因簇coexpression分析 |
| 汤姆: | 拓扑重叠测量 |
| WGCNA: | 加权基因coexpression网络分析。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Bao-Hong刘了本研究的设计和构思,进行计算实验,执行和解释数据,起草了手稿。Jian-Ping Cai设计这个项目并参与其设计,帮助在解释数据,起草和修订后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
作者感谢朱关从德州农工大学教授和帕特里夏·威尔金斯博士从疾病预防控制中心,美国修改手稿。他们也感谢扬州大学的研究人员提交地理数据集。这项工作是由中国农业科学院的基本研究项目(0032015027)和农业科技创新的特殊项目和专项资金的公共利益研究热点之一(201303044 - 7)蔡教授的团队。