优化、净化和淀粉污点洗两个新的应用程序α-Amylases从叶子和茎中提取的Pergularia tomentosa

文摘

连续的研究试图实现最高的工业需求的自然淀粉酶呈现特殊的属性。新α-amylases从茎和叶中提取的Pergularia tomentosa广泛和日益增长的自发在突尼斯,研究了他们的活动优化和净化的方法。有些相似之处记录了两个确定酶:(i)最高的淀粉酶活性显示在50°C促进热稳定性;(2)淀粉底物在酶活性提高1%;(3)α-amylases似乎calcium-independent;(iv)锌^{2 +}、铜^{2 +}和Ag)^{2 +}被认为是重要的酶活性的抑制剂。在Mono Q-Sepharose列上洗脱梯度的增加,增加的具体活动记录的11.82倍和10.92倍,分别为叶子和茎的存在不同的山峰净化配置文件。Pergularia淀粉酶活性稳定,兼容测试商业洗涤剂。植物淀粉酶和洗涤剂的结合使我们提高清洗性能增加42.56%和35.24,分别为茎和叶淀粉酶。淀粉酶特征被报道有提升潜力暗示尤其是在洗涤剂工业以及生物技术领域。

1。介绍

麦芽糖淀粉酶广泛分布于微生物、植物和高等生物,构成淀粉水解酶的亚科(1,2]。通过他们的转糖基作用的活动,他们负责溶解度增加,氧化稳定性,甜蜜,致癌性减少(3,4]。属于这种酶家族,α-amylases (4-a-D-glucan glucanohydrolase)催化的水解α1,4糖苷键相关的淀粉和多糖。他们代表大约25%的工业酶在全球市场5]。因此,他们有一个工业重要性由热阻和加强适应特殊工艺酿造和液化过程(6)、纸张和纺织品行业(7),重型和清洁剂8]。目前,α-amylases也隐含在化学、临床、医药、或分析过程(9]。

从世界范围内的酶生产,α-amylases中包含约30%的全球洗涤剂行业和90%的固液洗衣服(10,11]。尽管持续的需要适合新洗涤剂配方,新发现的酶微生物淀粉酶还有至关重要的利益(12- - - - - -15]。一些研究集中在植物淀粉酶非常有用的清洁的目的,如固定的情况下α淀粉酶大豆到壳聚糖提高淀粉的去除污渍(16]。与当地的无知内生应用程序(17),需要描述植物淀粉酶通过其稳定性、特异性、最佳的活动范围,和金属的依赖仍然存在。

这一事实α-amylases通常从不同植物器官中提取和纯化,如块茎(18],叶子[19),种子(20.,21),和茎(22),鼓励我们主要集中在植物源和野生植物不研究文献中,可能存在有趣的特殊和独特的属性。当植物被视为一种丰富的酶被搜查了在食品行业(23),则较少受到关注的物种,可以包括在工业淀粉加工将木薯耐糖,小麦,和玉米(24]。

萝摩科家族的几个物种的丰富性在不同的酶。Asclepias后在其乳胶(包含asclepain25)和calotropain被发现Calotropis procera(26]。半胱氨酸蛋白酶水解纤维蛋白原被发现在Pergularia extensa和白puciflorum(27]。属于这个家庭,Pergularia tomentosa了最近的一项科学的重要性由于其蛋白酶,凝乳酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶,β淀粉酶、脂肪酶、L-asparaginase和脂氧合酶广泛的乳胶相比,整个植物的粗提取液(28- - - - - -30.]。根据文献,这草地物种的Pergularia包含几个二级代谢物,抗氧化生物活性分子,和有效的抗真菌化合物尖孢镰刀菌f.sp。黄瓜(31日,32]。在传统医学作为补救的肺结核、皮肤疾病,便秘(33]。它提出了抗炎34],antidermatophytic [35],molluscicidal [36),和抗菌活动(37,38),它被称为抗癌剂(39和杀虫剂40]。

鉴于上述情况,本研究报告的净化α-amylases提取野生药用植物的叶子和茎,Pergularia tomentosa。几个条件优化也如pH值、温度、底物浓度。额外的离子在反应介质被归类为活化剂或抑制剂达到高和更好的酶活性。

我们也打算评估中提取酶的去污剂潜在的高洗涤剂产业征用淀粉酶使用低成本的原材料。酶的应用程序的主要目的在本研究调查植物淀粉酶合成洗衣粉的清洗效率及其独特的兼容性作为高效新添加剂。

2。材料和方法

2.1。植物材料

Pergularia tomentosal是识别和收集从周围的Bir本德(斯法克斯南部,突尼斯)[31日]。茎和叶与蒸馏水冲洗仔细从土壤和空气环境净化杂质。植物被放置在滤纸直到相对干燥清洗后一步。每个器官都单独地面最低的蒸馏水。混合物在5000 g×30分钟离心机,获得的上层清液通过滤纸过滤(150 nm, 5 b, Advantec东京,日本)获得一个清晰的粗提物。

2.2。降水的α淀粉酶和酶测定

蛋白质沉淀与硫酸铵80%进行了持续温和搅拌在冰浴和存储后一夜之间在4°C (41]。解决方案是离心机12000 g×30分钟和4°C。获得的沉淀溶解在蒸馏水和透析对同一溶剂24小时在4°C,通过改变溶剂三次。使用纤维素油管进行了透析(分子量截止13000 kDa, Himedia LA393-10 MT)。

布拉德福德的蛋白质含量测定方法(42)指的是牛血清白蛋白。α淀粉酶测定后进行DNS(2 -哦- 3.5 dinitrobenzoic酸)米勒(法43]。光密度测量在550 nm对底物和酶的空白。一个单位的淀粉酶酶的释放量被定义为1μ每分钟摩尔葡萄糖。

2.3。pH值和温度的影响

最佳pH值是由孵化amylase-substrate反应10分钟在不同pH值从4.0到10.0不等。温度优化淀粉酶是由携带10分钟的反应混合物(40 -°C)和pH值保持不变44]。pH稳定性研究preincubating 0.5毫升的酶与0.1米缓冲在不同pH值在4°C [3 h45]。的热稳定性α淀粉酶测试通过孵化酶3 h在确定最佳pH值和50和60°C。样本每15分钟和剩余活动决定撤回。

2.4。底物浓度和金属离子的影响

Pergularia tomentosaα-amylases活动确定了几家淀粉浓度在1 - 2.5%的范围,溶解在0.1最佳pH值的缓冲区。最大的活动为100%,相对活动策划对不同浓度的值。

Ca^{2 +}、镁^{2 +}、铜^{2 +}、铁^{2 +}、锰^{2 +}、锌^{2 +}、铁^{3 +}、有限公司^{2 +}在1和5毫米补充酶提取和淀粉溶液的反应介质和孵化30分钟在pH值和温度的最佳植物器官。酶活性没有添加任何离子(抑制剂或激活剂)被认为是100%。

2.5。净化的α淀粉酶

透析分数在60°C水浴加热15分钟和变性蛋白沉淀被离心分离去除,而上层的检查活动。获得积极的分数被加载到Mono Q-Sepharose列(2.1×24厘米)与6.5毫米preequilibrated钠磷酸盐缓冲剂(pH值5.0)在4°C。同一个缓冲区用来洗列。有界的蛋白质被筛选了氯化钠的线性梯度(0 - 1米)在同一缓冲区5毫升的流量最小⁻¹。蛋白质含量测定为280 nm据布拉德福德的方法(42]。淀粉酶活性的恢复分数后确定DNS方法(43]。

2.6。茎和叶的兼容性α-Amylases与商业洗涤剂

茎和叶的兼容性α宝莹-amylases与商业可用洗涤剂,潮流,Savex,决心。洗涤剂浓度的解决方案7毫克/毫升煮90分钟灭活酶活性包括在他们的配方。与每个单独冷却解决方案是混合淀粉酶(1:1)和孵化50°C 1小时。计算剩余活动相比,控制(而不是洗涤剂溶液)。

2.7。茎和叶的效率α-Amylases淀粉污点洗

研究了淀粉污渍的清洗效率Savex洗涤剂和这两个概念Pergulariaα-amylases [46]。白色棉布块沾淀粉溶液(0.5%)被放置在80°C 30分钟承担公司绑定的污点材料支持。洗涤性能测试通过改变清洁,水,水+洗涤剂,水+酶+清洁剂(7毫克/毫升)+酶。染色棉布块是在孵化瓶平台上相应的清洁混合物(100 rpm) 30分钟50°C。获得解决方案收集每个混合物测定还原糖的浓度释放淀粉(43]。的空白由蒸馏水代替液体清洗。相同的试验程序后的茎和叶α-amylases。

淀粉洗涤去除的过程的效率表示为下列方程(47]: 在哪里是葡萄糖的释放量(g / mL)在清洗过程和淀粉的量(μg / mL)用于染色棉布。

2.8。统计分析

数据表示为均值±标准差和比较是用适当的控制使用学生的以及。置信区间是设定在 对所有值分析一式三份。

3所示。结果与讨论

3.1。优化和表征α-Amylases

淀粉酶的活性最高Pergularia tomentosa展出的pH值5.5的叶子和茎的pH值6.0(图1)。pH值4.0和6.5之间,茎的相对活性淀粉酶保留超过60%的最大的活动。然而,在叶子的情况下,保留活动的60%是观察到的pH值5.0 - -7.0范围。除了pH值8.0,淀粉酶活性损失是最初的相对活动的68%。这可能是由于pH值影响电离的侧链保持酶活性位点结构及其影响的活动。从发芽的种子中提取淀粉酶的最佳pH值大豆类似于我们的研究是48),而叶子α淀粉酶的pH值Carthamus tinctorius淀粉酶与种子(49]。

酶被孵化3 h在多个缓冲区;超过80%的叶片酶活性之间保留pH值5和8,表明它很稳定,尽管高pH值(图2(一个))。叶子淀粉酶的过程相比,相当损失的活动在酸性pH值观察茎酶(图2 (b))。最新的淀粉酶一直稳定pH值范围6 - 8和保留大约60%的初始活动180分钟后孵化。

淀粉酶的曲线活动作为温度的函数钟形的最佳看着50°C(图3)。茎和叶的曲线一致的间隔47岁,52°C。温度的增加是相对的α-amylases活动增加,40到50°C,化验在每个植物器官的最佳pH值。超过50°C的峰值,活动大概开始下降,直到温度变化从53到60°C。60°C以上酶仍保留60%以上的初始活动。最佳温度不同物种间;此外,我们确定的最佳活动α-amylases略低于豇豆属辐射动物和松果体koraiensis(65°C) [50]。

高温淀粉酶主要是寻找淀粉行业应用(51]。我们的叶子淀粉酶是稳定在50°C到150分钟,损失只有2%的初始活动90分钟后孵化(图4(一))。在90分钟后60°C和酶孵化,失去了最初的活动的38%。在茎的情况下,55%的初始活动保持在60°C到100分钟(图4 (b))。研究了酶的热稳定性大大超过海丰的酶的结果Aureobasidium支链淀粉50分钟后完全变性60°C (52]。这个更高的百分比活动保留和热稳定性进一步鼓励的含义Pergularia tomentosal在各种实际领域。观察到的差异对过程的行为可能是由于每个物种的特定基因遗传53]。这热稳定性可以归因于一些二、三级绑定的存在增强酶酶蛋白质结构的整合及其抵抗热处理(54]。

底物浓度的影响是最大的1.0%淀粉溶液的叶子和茎(图5)。这个浓度也经常用于淀粉酶测定在以前研究[55,56]。然而,底物浓度从0.5%开始增加明显其次是增强的酶活性提高23.81和31.74%,分别为叶子和茎。然后在1%,活动逐渐下降,而茎的下降曲线的形状是广泛与叶片相比,特别是在1 - 1.5%的浓度范围,那里只有11.56%的酶活性丧失。淀粉酶活性的降低可以用这一事实来解释所有的底物结合位点吃饱了。

叶子α淀粉酶抑制了所有测试离子金属,而茎α淀粉酶是激活有限公司^{2 +}增加35%的相对活性和抑制了其他金属离子和变化的程度。发现钙有负面影响,尤其是在提高浓度。相同的过程是观察到的淀粉酶胡芦巴种子(45]。这种效应可能是由于金属比赛和/或酶结构的特殊性。已知的抑制剂锌^{2 +}和铜^{2 +}(57诱导,分别在5毫米不同的酶活性下降。的叶子在5毫米,锌^{2 +}导致87%的活性抑制和72%的茎淀粉酶。在同一浓度,抑制铜^{2 +}和quasi-total更明显。Ag)⁺报告为一个强有力的抑制剂在2毫米58)导致减少91%和82,分别从叶子和茎淀粉酶。因此,在所有的金属离子呈现在图6、有限公司^{2 +}、镁^{2 +},Ca^{2 +}似乎较弱的提取的淀粉酶抑制剂。

3.2。净化的α-Amylases

净化的α-amylases如图7。淀粉酶的阴离子交换色谱法从树叶中提取在Mono Q-Sepharose列筛选了与氯化钠的线性梯度增加显示三个山峰的活动,只是两种不同的山峰被透露的茎。

总结如表1,从两个研究植物器官中提取淀粉酶似乎完全不同的针对他们的具体活动,净化褶皱,和产量,以及个人资料与氯化钠洗脱后如图7。

叶子的净化过程α淀粉酶导致增加11.82倍的具体活动范围的洗脱25 - 149 mM氯化钠。它被认为是最高的褶皱与另外两个峰值相比,在更高的收益率为38.33%的峰值筛选了氯化钠在225 - 398毫米。茎的主要净化褶皱α淀粉酶是记录峰值筛选了620至690毫米收益率为27.27%的氯化钠。然而,提取浓度和净化过程的进一步措施如亲和色谱法可以用来更纯α-amylases从Pergularia tomentosa。

3.3。茎和叶中的应用α-Amylases

上述结果证实最大的两种淀粉酶活性光谱从茎和叶中提取的Pergularia tomentosa在一个广泛的pH值和温度。发现有趣的保留活动碱性pH值和适度的温度和展出淀粉酶稳定性被认为是重要的标准制造商用洗涤剂和淀粉类污渍残留的降解。钙的负面影响Pergularia酶活性是搜索实现完美洗涤剂遭受氧化剂sensitives calcium-dependentα-amylases [59]。大量的微生物淀粉酶提高白度的效果,类似的配方基于野生植物酶促进广泛的环境安全、低成本的洗涤剂(尤其是在农村地区60]。

然而,幸运的酶在洗涤剂配方需要一个良好的兼容性61年]。中提供的数据表2表现出优秀的稳定性和兼容性的茎和叶α-amylases的Pergularia tomentosa与测试三个商业洗涤剂。

结果显示,相比其他两个洗涤剂、清洁剂被认为是最低的兼容茎和叶淀粉酶通过获得剩余活动,分别为80.5%和65.22。此外,叶片淀粉酶似乎更兼容洗涤剂A和C比茎淀粉酶与洗涤剂quasi-compatibility b .洗涤剂C被发现更兼容两种淀粉酶,通过保留一个酶活性的87.91%和94.05%,分别为茎和叶。

的应用α-amylases仍然是非常有限的,一些研究报道暗示的可能性与洗涤剂清洗性能暗示他们的兼容性,粉末和液体。此外,表中给出的结果2可能是以前的研究相比,然而他们只是关注从真菌和细菌中提取淀粉酶(12,13]。在上述数据,热稳定性α-amylases从Pergularia tomentosa应该建议洗涤剂配方中作为竞争的添加剂,而洗涤剂影响的剩余活动发现淀粉酶可以归因于洗涤剂成分(13]。

以前的研究报道,细菌的效率α淀粉酶对几个生淀粉来源,例如,可溶性淀粉,咖喱土豆,玉米,小麦淀粉14)番茄酱和蛋黄(15]。图8表明,水的组合、洗涤剂和α淀粉酶的茎甚至叶Pergularia tomentosa大大增强了能力去污渍淀粉从棉布比仅使用洗涤剂或α淀粉酶。的补充披露提高洗涤效率的淀粉酶洗涤剂是按照其他研究[14,47]。事实上,这种组合是显著提高,当树叶α淀粉酶添加增加35.24%和42.56%,分别与简单的酶洗和洗涤剂清洗。

这两个Pergularia tomentosaα-amylases可以集成在工业领域催化剂的污渍去除和整合不同的洗涤剂配方。它可以解决人类皮肤敏感性的问题和副作用的洗涤剂残留疏散环境中通过减少大量的工业组件,如表面活性剂漂白剂,cobuilders通过自然的挑战α-amylases。的信誉良好的热稳定性Pergularia淀粉酶的风险最小化污染和扩散率需要进一步调查为进一步工业和生物技术应用的低成本的外部冷却(62年]。

4所示。结论

本文描述的工作试图描述和净化装置α-amylases在几个领域中都可以利用像油田钻井液的水解和造纸行业。淀粉酶的生化特征识别的研究Pergularia tomentosa显示一个有前途的pH值范围的稳定和一个有趣的热稳定性尤其是在50°C没有需求的钙。简单和廉价的新茎和叶的提取过程α-amylases以及有趣的净化褶皱和收益率提高我们研究的巨大潜力在污渍去除淀粉植物来源的生物活性物质。通过固定过程中,淀粉酶性质可能也改善了隐含在成功和现代生物技术领域。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了突尼斯的研究和高等教育。作者欣然承认穆罕默德Chaieb教授的支持下,实验室的负责人的植物在干旱环境的生物多样性和生态系统动力学斯法克斯学院科学。

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