文摘
众所周知脊髓损伤(SCI)可能会导致慢性神经性疼痛(NP);然而其内在的分子机制仍然是难以捉摸的。本研究旨在揭示差异表达基因(度)和激活信号通路与SCI诱导慢性NP,为了确定其诊断和治疗靶点。从基因表达微阵列数据集GSE5296已经被下载综合(GEO)数据库。重要的微阵列分析(山姆),京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路富集分析,和通路网络分析被用来比较度的变化和SCI和sham-injury集团之间的信号通路。因此,度分析显示有592度显著改变表达式;其中Ccl3表达式显示最高upregulation涉及其与SCI诱导慢性NP。此外,KEGG分析发现209通路变化显著;其中最显著激活MAPK信号通路,这是符合KEGG分析结果。我们的结果显示Ccl3高度与SCI诱导慢性NP; as the exosomes with Ccl3 can be easily and efficiently detected in peripheral blood, Ccl3 may serve as a potential prognostic target for the diagnosis and treatment of SCI induced chronic NP.
1。介绍
神经性疼痛(NP)是一种常见的脊髓损伤(SCI)后,结果这会影响一个人的生活满意度和质量。据估计,平均成本是47518美元每个SCI患者NP在美国(1]。据统计的GoPubMed网站(http://www.gopubmed.org/web/gopubmed/),NP SCI后的分子机制仍然是难以捉摸的。NP在SCI可分为“层次”的痛苦(2- - - - - -4],”级以下“疼痛[2,3),和“高于”痛苦(5- - - - - -7]。根据国际脊髓损伤疼痛分类系统(8),疼痛经历或在下面三种麻醉神经的损伤被认为是在层次神经性疼痛,疼痛,存在三个多麻醉水平以下的伤害分为级以下神经性疼痛。虽然在层次疼痛神经根病变的结果和/或脊髓和感觉在相应的部分,级以下疼痛是疼痛引起的脊髓损伤途径,提出不同的病理机制的疼痛一代(9,10]。然而,没有太多的描述以上级别SCI后神经性疼痛在以前的研究。不是很少,患者会在层次和级以下的疼痛,但在层次临床疼痛似乎比级以下早出现疼痛(11]。
NP综合症一般人群的患病率高达7 - 8%12,13,大约有30 - 50%的患者慢性NP (SCI将开发14- - - - - -16]。根据先前的研究[17),共有140名参与者进行了分析,其中70是SCI-NP主题和剩余的70控制不出现神经性症状。SCI可以由于创伤、肿瘤、感染、退行性条件;其中包括创伤SCI在诱导慢性NP中起着举足轻重的作用18]。全世界每年有0.25 -050万例SCI, 90%以上是由于创伤性损伤19]。SCI导致细胞损失,破坏神经回路,慢性功能障碍(20.];因此慢性后NP SCI患者可能受益于策略旨在促进神经发生、神经可塑性和功能恢复,如人类脐cord-derived间充质干细胞移植(21[],星形胶质细胞移植22- - - - - -25),和神经干细胞移植(26,27]。SCI的机制诱导慢性NP仍然难以捉摸,和最近的进展神经科学已经涉及科学是一种多基因疾病,其致病机制与基因表达的变化联系在一起;因此识别相关基因在慢性NP SCI后可以提供新的见解基因功能以及潜在的诊断和治疗靶点。在这项研究中,我们使用微阵列技术来识别差异表达基因(度)和激活信号通路与SCI诱导慢性NP鼠标SCI模型。
2。材料和方法
2.1。数据源
微阵列技术是一种广泛使用的高通量测量基因表达的工具(28- - - - - -30.]。此外,先前的研究已经表明,DNA微阵列数据分析可以为确定可靠的和有用的新靶点为临床诊断和治疗方法31日]。因此,我们使用微阵列表达谱(GSE5296)、地理(中提取https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库,识别度与SCI诱导慢性NP。C57BL6小鼠SCI模型使用(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE5296)。实验组( )受到中度损伤T8脊髓段在异氟烷麻醉。总RNA提取的喙的地区,尾地区,从T8脊髓损伤和病变中心在每一个长度(0.4厘米)。在一系列基因的表达检测时间点:0.5,4,24岁,72 h,分别和7和受伤后的28天。根据临床情况,患者普遍有NP在最初的3 - 6个月,3 - 5年后SCI (2]。因此,必须指出神经性疼痛没有出现在我们研究的时间点。对照组sham-injured ( ),椎板切除术。全球变化评估使用Affymetrix老鼠基因组430 2.0数组。实验进行了三次。
改变度和信号通路损伤组和sham-injury组之间的比较在不同的区域:吻侧,病灶中心、和尾地区和连续时间点。病变中心最重要的改变在度和信号通路,从而在不同时间点的日期从病灶中心之前选择执行下一个分析规范化处理RMA(健壮的多片平均)。
2.2。数据预处理
RMA方法(32)是计算一个表达式测量三个步骤的过程:背景校正、标准化和总结。方法包括一个探测特定背景校正和探针选择策略的一个子集探针与高度相关的强度在多个样本选择总结基因表达。
2.3。分析方法
GCBI平台(https://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index)主要是在整个生产过程中使用。最初,度明显脊髓中确定的总RNA样本C57BL6小鼠模型挫伤损伤相比,样本只动物椎板切除术。重要的分析微阵列(SAM)是用于研究度。 被用作筛选度的意义阈值,和褶皱变化> 2作为阈值来确定基因表达差异的重要性。聚类分析根据皮尔逊相关性计算被用来确保筛选基因完全表达SCI组和sham-injury组之间的差异。此外,功能(33)和KEGG分析进行识别途径参与SCI的改变。极大地丰富与褶皱条款和KEGG通路(罗斯福)< 0.05和发现率 被筛选出来。最后,通路网络分析探索每个通路之间的关系。更重要的是,必须指出的是,山姆(重要的微阵列分析)是用于研究度()的差异表达基因,而RMA(健壮的多片平均)标准化队伍,和它们的功能是完全不同的。
3所示。结果
3.1。数据预处理的病灶中心
原始数据预处理的RMA函数R语言的Affymetrix包(34]。最初的玻璃纸文件转换成探针表达式措施,和probe-level数据转化为基因名称由一个注释GCBI平台支持的方案。扣除背景的影响后,信号的样本值仍然很高(图1(一)),保证分析结果的可靠性。可以看出,黑色线几乎是在同一行(图1 (b)),指示一个优秀程度的标准化,以确保后续数据处理的准确性。所有样本的相关性是非常强大的(图1 (c)),提供后续的交叉分析和系统分析的基础。数据预处理结果表明样本足够,足够精确,稳定支持以下分析。
(一)
(b)
(c)
3.2。筛选差异表达基因显示病灶中心(Ccl3最大改变基因表达谱在592度)
度被使用了显著差异表达的意义分析微阵列(山姆)35,36在GCBI平台。 和褶皱变化> 2的阈值被用作筛选差异表达基因。当样品的数量大,我们实现一个标准分析方法筛选差异基因。事实上,我们使用两个样本的韦尔奇以及(不平等差异)对两组的差异分析和使用方差分析(方差分析)为多个组(组数不少于3)。对于多重比较分析,我们计算核反应能量控制错误发现率(37]。十大最大的差异度与褶皱变化> 2和筛选 ,基因表达谱的最大变化是调节Ccl3(表1)。后的热图coexpression网络分析基因表达差异的基因,我们发现592显著度(图2(一个)),这是符合已知的结果,科学是一种多基因疾病,其致病机制与基因表达的变化。Ccl3的横坐标值为3.45(图2(一个)),这表明Ccl3最大所有度之间变化。
(一)
(b)
我们进一步计算皮尔逊相关构建基因和样品之间的距离和实现基于层次聚类平均法用于链接(38]。根据列出的前10度的大小不同和Ccl3前度的调节。从顶部的水平轴,可以得出的结论是,样品一般可以分为集群:sham-injury对照组和实验组的伤害(图2 (b))。此外,基因表达谱的最大变化是upregulation Ccl3(褶皱变化= 10.91, )。
3.3。KEGG通路富集分析显示病灶中心(MAPK信号通路在209通道)是最重要的
极大地丰富与罗斯福< 0.05条款和KEGG通路筛选出来。排名是根据浓缩的分数,值,罗斯福。KEGG生物通路富集分析发现MAPK信号通路(浓缩分数= 5.68, , )是209年中最重要的一个途径根据浓缩分数(表2)。
3.4。通路网络分析显示病灶中心(MAPK信号通路也最重要的途径)
KEGG的交互是用于构造之间的交互网络通路。的整体和系统通路分析标记通路之间的关系可以帮助披露模块协同效应的重要途径。十大改变通路中的交互网与111个节点和404年彼此之间的关系,MAPK信号通路是最重要的一个最大的程度(出度= 5,入度= 39岁,和程度= 44)(表3),在改变的中心途径交互网络(图3)。
3.5。度和改变通路在不同部分的系统分析,山姆和KEGG时间点
度Ccl3和MAPK信号通路并不一定在前10名名单(表4和5),因为不同的数据分析。我们只讨论、验证和确认度之间的相关性Ccl3, MAPK信号通路,SCI诱导慢性NP由于基因的多样性和巨大的整个工作的复杂性。然而,最重要的是,系统分析度和改变通路的不同部分和时间点由山姆和KEGG另一种方法和策略研究表明神经相关性疾病的目标基因和通路。
4所示。讨论
科学已经证明是一种多基因疾病,其致病机制与许多基因的变化相关联。在这项研究中,我们使用微阵列技术来识别差异表达基因(度)和激活信号通路与SCI诱导慢性NP鼠标SCI模型。我们发现Ccl3和MAPK最调节度和最被激活的信号通路,分别。我们的结果与以前的研究一致。这将是非常有趣的,进一步研究SCI患者。整个分析,影响结果的因素包括样本属性(样本来源、样本大小和样本质量),筛选治疗工具,治疗方法和结果。此外,使用各种分析方法,包括差异表达基因的筛选、KEGG通路富集分析,和通路网络分析。GCBI平台上的所有过程进行分析,以避免造成错误的区别在不同的平台上运行不同的分析。
居民的激活细胞和炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞)在pn参与周边敏感。在脊髓背角,胶质细胞(小胶质细胞和星形胶质细胞)被激活占中枢敏化。外周及中枢敏化引起的神经性疼痛是由一些炎症介质(ifm)包括趋化因子和细胞因子(例如,Ccl3) [39]。SCI后,Ccl3显著诱导的背侧角2天后病变和保持在高水平明显高于强度(40),周围神经损伤后,Ccl3及其受体(CCR2和CCR1 / CCR5、职责)增加(41]。此外,基因表达在不同阶段有不同的痛苦。例如,Ccl3在六个时间点的表达反映了前十的排名度(表5)。因为持续的疼痛和诱发疼痛的存在SCI后,这里我们讨论的神经性疼痛的定义是SCI后诱发疼痛。此外,我们没有进行动物实验证实蛋白质功能和SCI-NP之间的关系,我们不排除假阳性芯片结果,由于条件不足。
的配体Ccl3 CCR1 [42]和CCR5 [43,44),是调节在SCI和抒发慢性炎症,导致NP (45,46]。外围Ccl3 [47,48)和Ccl3脊髓(49,50)可以产生疼痛的行为通过趋化因子受体的激活在背根神经节(DRG)。Ccl3被发现调节激活雪旺细胞和巨噬细胞浸润接近受伤的神经,发现参与神经性疼痛的发展主要通过其受体CCR1 CCR5,也是位于雪旺细胞和巨噬细胞39]。
CCR1被发现被诱导的早期阶段(SCI)后的第一个7天,而在后期时间进程(SCI后42天)趋化因子水平升高后只发现严重SCI (42]。CCR5参与其他炎性疾病的发展通过巨噬细胞激活51- - - - - -53),位于初级传入神经元或继发性脊髓背角的神经元47,54]。Ccl3和其受体CCR5,调节脊髓损伤后的使用中存在分析(43,44]。
小胶质细胞和星形胶质细胞表达CCR1起来从而CCR5 [55,56]。SCI后强劲已经表明小胶质细胞增殖和诱导NP敏化至关重要57,58]。此外,二甲胺四环素,小胶质抑制剂,据报道,预防、延迟或减轻NP (59,60]。相反,小胶质激活足以诱发疼痛敏感(61年]。小胶质细胞被称为ifm在中枢神经系统的主要来源62年,63年),在神经性疼痛的发展起着至关重要的作用[64年]。
MAPK信号通路和趋化因子信号通路参与SCI,扮演非常重要的角色在SCI诱导NP (65年]。MAPK家庭包括三个主要成员:p38,细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun n端激酶(物),调节不同的信号通路。MAPKs被磷酸化激活和转导广泛的细胞外刺激转录和nontranscriptional监管,导致不同的细胞内的反应。Asiaticoside变弱SCI诱导NP通过抗炎作用和抑制p38-MAPK机制(66年]。鞘内注射抗炎细胞因子的缓解SCI诱发炎症,抑制SCI诱导激活p38-MAPK [67年]。此外,CCR5是Ccl3受体之一,淘汰赛CCR5镇压SCI引起的神经性疼痛(67年]。抑制p38 MAPK信号通路可以缓解神经性疼痛(68年]。
p38 MAPK由上游激酶激活MKK3 / MMK6,报道在脊髓小胶质细胞的激活在SCI模型(69年]。p38α和人们β两个主要p38亚型在四个亚型:α,β,γ,δ在成熟的神经系统70年]。p38β在脊髓小胶质细胞似乎表示,p38的击倒β但不是人们α防止急性疼痛敏感(71年]。p38是参与维护神经性疼痛,及其抑制剂可以减弱和反向NP症状(57]。
激活细胞因子受体CCR1和CCR5)导致p38 MAPK在脊髓小胶质细胞激活。p38激活导致增加表达式,通过转录因子NF -κB或者其他转录因子(例如,ATF-2),分泌炎症介质/生长因子(例如,细胞因子和BDNF)或膜受体的基因编码。此外,人们还产生PGE2和il - 1β通过快速转译后的监管。释放后,这些介质会使敏感疼痛的背角神经元通过突触前和突触后机制,导致持续性痛过敏(57]。
此外,液和其他细胞外囊泡正在成为一种新颖的神经系统内的信息交换,和液能发挥神经保护和神经毒性作用[72年]。液是发布的神经元突触活动,在某种程度上取决于这些液可以由其他神经元夺回,暗示小说为interneuronal沟通(73年]。液源自heat-stressed肿瘤细胞(HS-TEX)含有趋化因子,如CCL2, CCL3,亚兰,CCL5,和CCL20 chemoattract并激活树突状细胞(DC)和T细胞更有说服力地(74年]。雪旺细胞液促进轴突再生,增加神经元生存prodegenerative刺激后(75年]。cotransplantation雪旺细胞和近年的星形胶质细胞数量减少、小胶质细胞和巨噬细胞浸润和趋化因子的表达(CCL2和CCL3)在受伤的网站,提供一个更好的免疫环境科学修复(76年]。
Ccl3和其受体CCR5和CCR1调节SCI后,和淘汰赛Ccl3和抑制p38 MAPK信号通路可以缓解神经性疼痛(67年]。因此,Ccl3拮抗剂可能潜在的新药治疗神经性疼痛。
5。结论
在这项研究中,基因表达谱的最大改变Ccl3(褶皱变化= 10.91, )被发现在SCI后529度阈值的改变 和褶皱变化> 2。此外,KEGG分析发现209通道的意义,其中最重要的是根据浓缩评分(MAPK信号通路富集得分= 5.68, (罗斯福)=,褶皱的发现率 )。根据之前的研究,在SCI诱导慢性NP,外周血液将包含Ccl3,来源于雪旺细胞。液可以通过blood-spinal绳的障碍物,结合Ccl3受体,CCR5,占慢性神经性疼痛综合症。Ccl3和其受体CCR5,也调节SCI后,淘汰赛Ccl3和抑制p38 MAPK信号通路可以缓解神经性疼痛。自从液Ccl3可以很容易地和有效地在外周血中发现,Ccl3可以作为一个潜在的预后和预测目标SCI诱导慢性NP的诊断和治疗在临床的应用。最,度的系统分析和改变通路在不同的部分和时间点由山姆和KEGG另一种方法和策略研究表明神经相关性疾病的目标基因和通路。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委。81171719)和重庆市自然科学基金(CSTC, 2008 BB5281)。作者感谢吴医生东升的阅读和修改手稿。