布朗Microalga培养潜在的高盐中生产高价值的化合物

文摘

双耳瓶sp.是孤立于斯法克斯太阳能盐场和高盐条件下栽培。它包含适度的蛋白质、脂质、糖类、矿物质和生物活性化合物的重要内容:茶多酚,叶绿素,类胡萝卜素和脂肪酸。脂肪酸与GC / MS分析表明,C16系列占75%左右双耳瓶sp.脂质。饱和脂肪酸的棕榈酸是最重要的(27.41%)41.31%。双耳瓶sp.被发现富含单不饱和脂肪酸9 -十六碳烯酸的主导地位。它还包含一个重要的多不饱和脂肪酸比例高的二十碳五烯酸(2.36%)。在使用不同的溶剂,乙醇提取80%的最高含量的酚类和黄酮类38.27毫克儿茶素没食子酸当量和17.69毫克当量g⁻¹分别为干提取。使用各种在体外化验包括DPPH和abt激进分子方法,还原能力测定β胡萝卜素漂白试验,80% ethanolic提取抗氧化活性高。检查一个强大的抗菌活性对革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌和微球菌危害)和革兰氏阴性细菌(肺炎克雷伯菌和沙门氏菌血清)。这些结果支持双耳瓶sp.稳定物价在水产养殖、食品和医药行业。

1。介绍

微藻被认为是生物活性化合物的重要来源和范围广泛的应用程序和商业用途。他们生产蛋白质、脂类、维生素、色素和其他分子利用卫生,食品和饲料添加剂,对能源生产。由于其广泛的多样性和高存储容量的脂质,尤其是二十碳五烯酸(EPA)和氨基酸,微藻有制药和化妆品应用程序(1,2]。此外,保护作用的天然抗氧化剂,对化学诱导氧化损伤,现在一直在注意,特别是当自由基的生成。底栖硅藻已经成为良好的天然抗氧化剂的来源,揭示了许多研究[3- - - - - -6]。此外,微藻代表一个大型和抗菌化合物的未开发的资源7,8]。可能,microalgal提取物已经被测试作为食品和饲料配方的添加剂,以取代目前使用的合成抗菌化合物,包括subtherapeutical剂量的抗生素使用作为一项预防措施在动物育种9]。微藻是无所不在地分布在整个生物圈,他们已经适应了生存在一个大范围的环境压力,如热、冷,乏氧生活,盐度、光致氧化,渗透压,暴露于紫外线辐射(10]。因此,从本质上说,他们可能会在大多数可用的环境条件,从淡水到极端的盐度。他们拥有大量的额外优势代谢可塑性,依赖于它们的生理状态。同样地,他们的次级代谢可以很容易地由大多数形式的外部应用压力(7]。

在各种各样的微藻、蓝藻纲绿藻类,硅藻纲(硅藻)和金藻纲是研究最多的生物柴油生产(11]。据估计,硅藻产生约25%的全球主要生物质(12]。斯法克斯太阳能盐场,硅藻纲主导的沟鞭藻纲至少咸池,但是他们并不丰富的高盐环境(13]。

与初级代谢的通用高分子(如单糖、多糖、氨基酸、蛋白质、和脂质),它通常存在于所有生物,次生代谢物在自然界中分布更为有限。他们不一定在所有情况下,只能在特定的生物或生物。生物体可以产生这些化合物在自己生活的生态系统保护自己或在其日常生存中发挥基础作用。这揭示了生物活性分子在不相关的生物系统14]。药用和药理行动往往依赖于次级代谢产物生物活性化合物的存在(15]。藻类的生长较快,可以控制生产的生物活性化合物如茶多酚、色素通过修改培养条件(10]。

在目前的工作,双耳瓶sp。(硅藻纲)在咸水环境中培养,物理化学性质,脂肪酸,具有生物活性的化合物,和一些生物活性测定。

2。材料和方法

2.1。Microalga

双耳瓶sp.硅藻纲是孤立通过精密控制和串行稀释水样收集的池塘C4-1斯法克斯太阳能盐田107 p.s.u平均盐度。(实际盐度单位)。斯法克斯太阳能盐场位于中央东部突尼斯,成本约为34°39′N和10°42′E。池塘是浅(20 - 70厘米深度)和各种盐度从40到400 p.s.u。(16]。它们通过管道连接和通道沿着12公里的部分成本。

2.2。培养条件

microalga是种植在批热压处理过的人工海水,富含F / 2营养培养基,硅酸钠(Na₂SiO₃),微量金属解决方案(17,18]。进行了文化在100年的盐度p.s.u 15天。,25°C, light : dark (L : D) cycle of (16 h : 8 h), and cool white fluorescent light intensity of 60 µ摩尔光子米⁻²年代⁻¹。生物量被离心分离培养基(4500 g×10分钟),球是用蒸馏水洗净,再离心4500 g×10分钟(清洗重复了两次)。颗粒是冷冻干燥和储存在−70°C。

2.3。测定干物质、灰分、蛋白质、脂肪、总糖

干物质和灰分测定根据采用AOAC公认的标准方法(19]。总氮含量双耳瓶sp.原油和未消化的蛋白质底物测定采用凯氏法采用AOAC公认的方法根据984.13 [19B)的设备气消化单位k - 424(瑞士)。粗蛋白质被估计总含氮量乘以6.25的系数。

索氏提取后的脂类含量确定重量分析地干样品与己烷2小时使用Nahita模型655(西班牙瓦)。

至于糖,用苯酚-硫酸法估计(20.)利用葡萄糖作为标准。

2.4。内容确定色素:叶绿素和类胡萝卜素

色素测定根据Lichtenthaler[描述的方法21]。两毫升文化在5500×g离心5分钟,上层清液被丢弃和颗粒在黑暗中混入99.9%甲醇和孵化24小时45°C。孵化后,颜料含量是决定测量吸光度在470,652.4,和665.2 nm,纠正为浊度减去吸光度在750海里。

2.5。测定矿物含量

分析钠、钾、钙、镁、铁、铜、锌含量双耳瓶sp.进行了使用电感耦合等离子体光学发射分光光度计(ICP-OES)模型4300 DV, PerkinElmer(谢尔顿、CT、美国),根据1999年采用AOAC公认的方法(22]。测量进行了一式三份,结果三个值的平均值。

2.6。gc - ms技术测定脂肪酸概要文件

脂肪酸甲酯(名声)是由基本的酯交换协议。提取的油脂收集在10毫升庚烷和引入50毫升瓶。10毫升的KOH溶液的体积(11 g L⁻¹)在甲醇添加一些antibumping珠子。混合回流冷凝器下煮10分钟。然后,5毫升的三氟化硼(男朋友₃),甲醇复杂(150 g L⁻¹了毕业注射器通过冷凝器,和混合煮2分钟。混合物在室温下冷却,15到20毫升的饱和硫酸钠溶液添加和动摇。此外,该解决方案添加到液面达到瓶的颈部。相分离后,上层(正庚烷)收集的巴斯德吸管和蒸发在氮气流。在500年重新溶解的名望µL己烷的gc - ms分析。

名声的分析了6890 5973 GC / MSD安捷伦GC / MS系统,配备了一个HP-INNO蜡聚乙二醇毛细管柱(30米长度;250年µ米直径;0.25µ米膜厚度)。氦用作气体运输船的流量通过列1毫升/分钟。列温度举行最初在200°C和1分钟增加到250°C 10°C分钟⁻¹然后是举行250°C,持续15分钟。喷射器是保持在260°C模式,使用离了然后一个示例1µL注射。离子源温度设定在230°C。质谱获得了在全扫描模式女士,和扫描范围是(相对原子质量):50 - 600(12)电子轰击(EI)电离(70 eV)。数据被利用使用国家标准与技术研究所(NIST)质谱搜索程序(版本2.0 g)。

2.7。测定总酚的含量

总酚类含量microalga决心Folin-Ciocalteu方法(23]。短暂,0.2毫升的提取混合1毫升Folin-Ciocalteu试剂(稀释1:10,v / v)紧随其后的0.8毫升的碳酸钠(7.5%,w / v)。在黑暗中孵化后,吸光度测量在760海里。藻提取物的总酚含量表示为毫克每克干没食子酸当量提取(mg GAE g⁻¹使用校准曲线与没食子酸提取)。所有样品都是一式三份分析。

2.8。总类黄酮含量的测定

根据修改后的总类黄酮含量测定的方法Zhishen et al。24]。简单地说,0.4毫升的提取是混合了120年µL 5%的亚硝酸钠和120年µL 10%的氯化铝随后添加0.8毫升的1 M氢氧化钠。孵化后的反应混合物在室温下为6分钟,吸光度测量在510海里。提取总黄酮类化合物含量表达的儿茶素(mg g⁻¹干提取)。所有样品都是一式三份分析。

2.9。提取的抗氧化剂

从生物质提取样本获得的两个固液萃取过程方法的启发Goiris et al。25]。在第一步中,非极性和极性的化合物被80%的乙醇提取。为此,2 g的冷冻干燥生物质地面用杵和臼和提取下搅拌在黑暗中20毫升乙醇/水混合物(4/1 v / v)为1小时50°C。离心后(4500 g×10分钟),颗粒resuspended在2毫升乙醇/水混合物,用浸渍提取第二次。两个提取汇集并存储在−分析前20°C。第二个过程旨在分离极性与非极性化合物在溶剂极性增加:顺序提取后正己烷、乙酸乙酯和水。冷冻干燥生物质(2 g)在20毫升的迫击炮和提取己烷为1小时50°C。离心后,颗粒在己烷resuspended并提取第二次,和提取都的总和。生物质颗粒随后与2×20毫升乙酸乙酯提取两次使用相同的过程,最后用2×20毫升的水在50°C 1小时。提取都集中在减少压力下通过一个旋转蒸发器浓缩残渣干燥。 The dried samples were weighed and then stored at −20°C prior to analysis.

2.10。抗氧化性质

四个在体外分析被用来评估ethanolic提取80%的抗氧化特性双耳瓶sp。

2.10.1。2,2-Diphenylpicrylhydrazyl DPPH自由基清除实验

自由基清除活性评估根据布洛瓦(26)与一些修改:1毫升的提取在不同浓度(0.06毫升1毫克⁻¹)和1毫升的0.1毫米450年乙醇和DPPHμL(50毫米Tris-HCl缓冲区(pH值7.4)。解决方案是孵化为30分钟37°C,和DPPH自由基的减少是评估通过阅读517海里的吸光度。DPPH清除活动给出计算百分比和根据以下方程: 在哪里反应介质的吸光度和吗是反应的吸光度测试包含提取。每个提取物的抗氧化活性是表示为IC₅₀定义为提取所需的浓度,导致初始DPPH浓度降低50%。丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚)作为积极的控制,并且每个样本分析三次。

2.10.2。abt自由基清除活性

Trolox等效抗氧化能力分析(问题),测量的减少2,2-azinobis——(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸)abt自由基阳离子抗氧化剂,是来自Katalinic等的方法。27与一些细微的修改。短暂,abt激进的阳离子(abt·+)是由反应与2.45毫米过硫酸钾abt股票的解决方案,允许在室温下混合站在黑暗中使用前12 - 16个小时。abt·+解决方案是用生理盐水稀释磷酸盐缓冲剂(PBS, pH值7.4)的吸光度0.70(±0.02)在734海里。后加入2毫升的稀释abt·+ 100解决方案μL的提取、或Trolox标准30分钟的反应混合物是孵化一个玻璃分光光度计单元在30°C。减少吸光度被记录在734海里。测量进行了一式三份。自由基清除活性使用下面的公式计算: 在哪里反应介质的吸光度和吗的吸光度与提取反应介质。每个样本分析三次。

2.10.3。铁降低抗氧化能力(捆牢)

提取物的还原能力测定根据Yildirim描述的方法et al。28]。简单地说,0.5毫升的80% ethanolic提取溶液在不同浓度(0.1毫升-0.5毫克⁻¹)与1.25毫升的0.2米混合磷酸盐缓冲剂(pH值6.6)和1.25毫升的1% (w / v)铁氰化钾K₃[Fe (CN)₆]。混合物在50°C孵化20分钟,然后1.25毫升的10% (w / v)三氯乙酸是添加到混合物然后在3500×g离心10分钟。上层清液(1.25毫升)和1.25毫升蒸馏水FeCl和0.25毫升的0.1%₃(w / v)。吸光度测量700海里。抗坏血酸作为参考。反应的吸光度的增加表明铁的增加减少。是一式三份的意思是给出的值分析。

2.10.4。β-Carotene-Linoleic酸测定

提取的能力来防止的漂白β胡萝卜素是评估被Koleva et al。29日]。一个股票的解决方案β胡萝卜素/亚油酸制备混合溶解0.5毫克β胡萝卜素1毫升氯仿,25岁µL(亚油酸,200µL 80渐变。氯仿完全蒸发真空旋转蒸发器在40°C,然后添加了100毫升蒸馏水大力搅拌混合的结果。在每个实验之前获得的乳液是刚做好的。整除(2.5毫升)的β胡萝卜素/亚油酸乳液被转移到试管含0.1毫升的提取在不同浓度(0.1毫升-0.5毫克⁻¹)。为2 h后孵化50°C,每个测试的吸光度测量在470海里。维生素C作为一个积极的标准。控制管中不含样品。抗氧化活性的β胡萝卜素漂白模型表示为百分比计算以下方程: 在哪里和样品的吸光度和控制,分别以时间0和样品的吸光度和控制,2小时后,分别测量了。测试进行了一式三份。

2.11。抗菌检测

最重要的病原菌是革兰氏阳性(蜡样芽胞杆菌(ATCC11778),枯草芽孢杆菌(JN934392),微球菌危害(ATCC4698),金黄色葡萄球菌(ATCC6538))和革兰氏阴性(肺炎克雷伯菌(ATCC13883),沙门氏菌血清(ATCC43972))的细菌。80% ethanolic提取物的抗菌活性是评价使用琼脂扩散法。井被满60岁µ提取的L 20毫克/毫升5% DMSO溶液和5% DMSO作为消极的控制。此外,盘子被孵化24小时37±1°C的菌株。然后,抑制区域的直径(IZD)测量。

2.12。统计分析

生理和生化参数的数据表示为平均数±标准差。测试进行了一式三份。的集成电路₅₀值的计算是通过概率元分析的可靠性区间为95%。

3所示。结果与讨论

3.1。的物理化学特性双耳瓶sp。

的一些物理化学特性双耳瓶sp.展示在表1。结果表明,生物质双耳瓶sp.包含适量的脂肪,蛋白质,碳水化合物,灰烬,矿物质和一个重要的叶绿素和类胡萝卜素的比例。接近7%的干物质含量,发现其他菌株:8%双耳瓶sp。中医2002330.)5.9%,土罐coffeaformis(31日]。然而,的脂质含量双耳瓶sp. DW相对低于11.14%的价值发表的其他菌株双耳瓶(32),高于土罐coffeaformis(6.9% DW) (31日]。八海洋物种的硅藻的研究揭示了种种脂质含量从2.4到21.3%33]。

蛋白质水平双耳瓶sp。(27.62%)低于其他菌株的发现双耳瓶;54% 20023年中医30.)和30 - 40%双耳瓶sp。32]。事实上,蛋白质水平是同意公布值范围的12 - 42%对于某些微藻(34),高于内容发现土罐coffeaformis(31日]。

总糖的含量双耳瓶DW sp.是12.60%,这与某些微藻是一致的(5 - 23% DW) [34]。尽管如此,土罐coffeaformis和一些硅藻含有大量的糖在13.5 - -16.4%的范围31日]。

的灰分含量双耳瓶DW sp。(37.78%),这是符合发现另一个双耳瓶应变(30% DW)种植在盐度15至35 p.s.u不等。(32]。灰分含量超过50%(55.8 - 67.9%)一些硅藻(干重的31日]。双耳瓶sp.有适量的钠、钾、钙和镁。

此外,双耳瓶sp.被发现富含叶绿素,主要是叶绿素和类胡萝卜素。事实上,其叶绿素含量几乎达到5%的干物质,在协议与其他研究工作30.]。此外,类胡萝卜素含量是著名的DW (1.083%)。硅藻纲表现出高水平的类胡萝卜素,即β胡萝卜素和叶黄素,从而表明一个强大的抗氧化活性(35]。

3.2。脂肪酸的组成双耳瓶sp。

100年盐度p.s.u。,on F/2 medium, the fatty acids profile of双耳瓶sp.由饱和、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸(国家林业局、MUFA和PUFA),分别为(表2)。C16脂肪酸系列(0,C16:1、C16:2 C16:3)代表超过75%。此外,棕榈酸(0)和9 -十六碳烯酸(C16:1)占据超过72.51%的脂肪酸。SFA出席一个高水平,41.31%,27.41%的棕榈酸。因此,双耳瓶国家林业局sp.可能是一个合适的制片人,很容易兑换生物柴油(36]。双耳瓶sp.富含MUFA主导地位的9 -十六碳烯酸(45.09%)和包含一个重要PUFA的比例(6.03%)。高水平的9 -十六碳烯酸和其他生物活性脂肪酸也发现梭状形态类型的硅藻纲Phaeodactylum tricornutum(37]。C20:5二十碳五烯酸(EPA)中产生明显的水平(2.367%)。的确,众所周知,EPA是一个重要的卫生防护PUFA的许多疾病,包括心血管疾病(38)和癌症(39]。

3.3。植物化学的成分

总酚类和黄酮类化合物的内容双耳瓶sp.提取总结在表3。80%乙醇提取硅藻纲的显示最高的酚类及其类黄酮含量,38.27±2.21毫克GAE g⁻¹提取和17.69±0.70毫克CE g⁻¹相比分别提取,提取得到的乙酸乙酯、正己烷、和水。酚醛含量的乙醇提取物的摩洛哥海洋微藻被发现的范围从8.2到32毫克GAE g⁻¹提取(40]。作者指出,发现酚类含量最高的提取Nannochloropsis gaditana与32毫克GAE g⁻¹提取。的提取杜氏盐藻sp。Phaeodactylum tricornutum,舟状窝sp.还含有酚类含量高的超过15毫克GAE g⁻¹提取(40]。

类黄酮含量在80% ethanolic提取的双耳瓶sp.是3.22毫克CE g⁻¹DW,比发现高出6倍双耳瓶中医2002330.]。

多酚和黄酮类化合物的高水平双耳瓶sp。80% ethanolic提取可能是由于文化100年的高盐度p.s.u条件。和提取条件。

3.4。抗氧化性质双耳瓶sp。

由于酚类和类黄酮含量最高,80% ethanolic提取是用来检查通过四抗氧化活性在体外化验:abt和DPPH自由基清除能力,铁降低抗氧化能力,β胡萝卜素漂白抑制测试,使用不同浓度的提取。抑制自由基DPPH的百分比和abt的提取和标准(Trolox和二叔丁基对甲酚)被发现浓度(0.065毫升1毫克⁻¹对DPPH测试和0.5到4毫克毫升⁻¹abt测试),如图1。集成电路的推断值₅₀展示在表4。降低集成电路的价值₅₀表明较高的抗氧化活性。双耳瓶sp。80% ethanolic提取物表现出高反激进主义的功率集成电路₅₀值为0.23±0.07毫克毫升⁻¹对DPPH清除活动和一个集成电路₅₀值为2.61±0.64毫克毫升⁻¹abt的自由基清除能力。一些作者已经找到了一种酚醛含量与抗氧化活性相关性强(41]。

酚类的收紧分析是基于能力减少黄色铁tripyridyl三嗪复杂(铁(III) -TPTZ)蓝色黑色复杂(Fe (2) -TPTZ)电子基抗氧化剂的作用[42]。图2(一个)显示了一个重要的还原能力与维生素C作为参考。还原能力也依赖于提取浓度。

抗氧化剂对DPPH自由基清除的影响被认为是来自他们hydrogen-donating能力。在这个调查中,80%的乙醇提取物被证明表现出强烈的DPPH自由基清除效果。事实上,它达到了74.34%的抑制1毫克的提取,这被认为是高于一些硅藻纲测试2毫克的甲醇提取物的提取(22.7%,31.6%,76.6%土罐coffeaeformis,舟状窝sp。Achnanthes longipes职责。)31日]。的集成电路₅₀值abt的清除能力双耳瓶sp.提取2.6毫克毫升⁻¹。许多研究[43)提到过集成电路₅₀abt清除能力两种褐藻的5.29毫克毫升⁻¹为海藻binderi和15.2毫克毫升⁻¹为Turbinaria圆锥体。

的β胡萝卜素漂白抑制和还原能力测试(700海里)的吸光度测定的浓度提取0.1至0.5毫克毫升⁻¹,显示浓度(图的依赖2 (b))。的集成电路₅₀的价值β胡萝卜素漂白试验(表4)是强毫升(0.21±0.05毫克⁻¹),IC的2倍₅₀维生素C作为标准的价值。700海里的吸光度值达到0.78 0.5毫克毫升的浓度⁻¹的提取,这被认为是高,显示良好的抗氧化活性。因此,双耳瓶sp.提取被证实有很强的抗氧化能力。多重回归分析证明,类胡萝卜素和酚醛内容大大有助于解释变异的收紧和问题活动的提取物。回归系数表明,酚类和类胡萝卜素类似的重要性在解释抗氧化活性的变化(25]。

3.5。抗菌试验

在目前的研究中,抗菌活性双耳瓶sp。80%乙醇提取物对6个细菌筛选及其他们的力量是定性和定量地分析了直径的抑制区(IZD)总结如表5。ethanolic提取80%双耳瓶sp, 20毫克毫升的浓度⁻¹积极对革兰氏阳性细菌,微球菌危害和金黄色葡萄球菌和不活跃的芽孢杆菌(昙花,和细小)。这个提取有效地对抗革兰氏阴性细菌测试:克雷伯氏菌肺炎和沙门氏菌血清。提取显示出强烈的活动微球菌危害,金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯菌。的IZD肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌16毫米和20毫米,分别强于那些发现ethanolic提取的应变双耳瓶在标准Walne培养基培养sp.(10毫米和10.5毫米),分别(44]。这种差异可能是由于文化条件。根据一些作者,藻类取决于物种的抗菌活性和活性化合物的提取效率,以及生存条件(45]。

提取用于本研究发现富含多种化合物:脂类和脂肪酸,碳水化合物,多糖、多酚、类黄酮、颜料、类胡萝卜素,可以表明有抗菌活性如前所述几个微藻(46]。微藻的抗菌活性归因于化合物属于多个化学类包括吲哚、萜烯,acetogenins,酚类,脂肪酸和挥发性卤代烃47,48]。描述的一些抗菌药物的作用机制;类胡萝卜素消化细胞壁(49];类黄酮增加渗透率内细菌的50];多酚类物质参与酶抑制,衬底剥夺,络合细胞壁,细胞膜破坏(8];多糖抑制透明质酸酶(8),而脂肪酸和脂质引起细胞膜的破坏(51]。从microalga获得超临界提取物的抗菌活性Chaetoceros muelleri有关它的脂质成分(52]。脂肪酸被报道在一些硅藻生物活性化合物有抗菌活性Phaeodactylum tricornutum(51,53),Skeletonema costatum(54)和其他微藻Haematococcus pluvialis(55),杜氏(56]。

微藻提取应该测试作为食品和饲料配方的添加剂,以取代目前使用的抗菌化合物的合成的起源,包括subtherapeutical剂量的抗生素使用作为一项预防措施在动物育种9]。

4所示。结论

双耳瓶sp,布朗在高盐度microalga培养100 p.s.u媒介。,was confirmed to contain a moderate percentage of proteins, lipids, sugars, and minerals and important levels of polyphenols, flavonoids, chlorophyll, carotenoids, and bioactive fatty acids as EPA. Besides, this microalga has important antioxidant and antibacterial activities. Prominent contents of bioactive compounds in this microalga are in favor of its possible valorization in food additives and pharmaceutical or cosmetic products. Moreover, its richness in saturated fatty acids allows its eventual use for biodiesel production.

的利益冲突

作者声明没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Saoussan Boukhris和哈立德Athmouni同样这项工作。

确认

这项工作是支持的高等教育和科学研究、突尼斯。作者要感谢教授误Drira斯法克斯教师的科学文化室的可用性和层流罩的维护microalga文化。他们还要感谢教授Neji Garsallallah博士Sabrine Sellimi对他们的帮助。

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