肌动蛋白的动态应力纤维和缓慢迁移期间焦粘连在瑞士3 t3成纤维细胞:细胞内的细胞转变机制

文摘

理解机制调节极性的自发变化导致细胞转变,我们定量分析的动力学焦点粘连(FAs)耦合与自组装在瑞士3 t3成纤维细胞肌动蛋白细胞骨架结构。从细胞获得的荧光图像表达GFP-actin和RFP-zyxin激光共焦显微镜。的基础上最大的地区,持续时间,和搬迁距离RFP-zyxin FAs中提取的图像,细胞可分为3个区域:前线地区,中间横向区域,和后方区域。在中间横向地区,FAs出现接近前缘,稳定逐渐随着面积的增加。压力同时,捆绑肌动蛋白纤维(SFs)观察这些FAs垂直的位置,他们连接到其他SFs前缘平行。最后,这些连接SFs融合形成一个科幻与成熟FAs两端。这种变化在科幻的组织细胞收缩在第一个周期的迁移,后跟一个新成立的突出在接下来的周期被认为导致迁移细胞将瑞士3 t3成纤维细胞。

1。介绍

定向迁移细胞在胚胎发育中扮演着重要的角色1),组织再生(2神经系统)、发展和改造(3伤口愈合),在多细胞生物4,5),和生物医学应用,如组织形成(6]。在这些过程中,细胞生成、维护和改变正反面极性通过整合从细胞外环境化学和机械刺激(7,8]。

迁移的机制极性控制细胞在趋化中性粒细胞和已被广泛的研究盘基网柄菌变形虫响应和运动沿着梯度化学引诱物(9,10]。极化趋化细胞迁移与极化的形成相关的肌动蛋白丝、微管网络信号分子的不对称分布,包括pi3k PTEN和ρgtpase [10,11]。也是,当地的温度梯度引起神经突生长报道由于增强型微管和肌动蛋白动力学(12]。密集的研究表明,机械刺激,如刚度(13- - - - - -15和地形16,17的细胞外基质,化学和热刺激控制迁移细胞的极性是至关重要的因素。机械反应细胞的收缩性之间微妙的力量平衡调节肌动蛋白细胞骨架和外生机械力量传播整个病灶粘连(FAs) [6和改变他们的迁徙方向15,18,19]。因此,涉及FAs的肌动蛋白细胞骨架系统的自组织是一个关键因素来理解迁移细胞的极性控制与机械刺激的细胞外环境。

极性的细节维护通过自组装肌动蛋白细胞骨架结构与FAs的动态耦合,这是已知受ρ家庭gtpase [20.,21),已被广泛的研究与关键步骤:突出前沿,通过FAs粘附到细胞外基质,超然和收缩细胞后方。突出的前缘是由肌动蛋白聚合形成lamellipodium,它是一个动态的树突网络与肌动蛋白结合蛋白如Arp2/3成核和分支的肌动蛋白丝22,23),限制蛋白质的终止肌动蛋白聚合(24和ADF / cofilin切断肌动蛋白丝25]。一些肌动蛋白丝lamellipodium再次解聚和回收聚合肌动蛋白丝。其他人包括丝状伪足,棒状预测从lamellipodium扩展,由肌动蛋白丝束,由肌动蛋白逆行交付给薄板流组装收缩牵引网络组成的捆绑丝,肌球蛋白II, FAs [26- - - - - -29日]。肌动球蛋白的收缩力量生成网络所需逆行组装收缩网络流,以及细胞胞体易位和拆卸FAs后(30.,31日]。

自组装的肌动蛋白细胞骨架为极性代一直在报道身体推lamellipodial片段,其中的物理刺激导致地方压缩打包肌动蛋白丝与肌球蛋白II,导致了一个积极的反馈回路,启动极化和持久的迁移32]。此外,极性一代被证明是依赖于ρkinase-mediated重组肌动球蛋白网络的基础上,详细分析时空重组的f -肌动蛋白网络(33]。

澄清的极性变化的机制是下一个挑战理解迁移细胞的控制响应机械刺激,因为大量的研究已经证明了自我组装的肌动蛋白细胞骨架的结构和动力学的FAs极性生成和维护。我们的目标是证明机制调节极性的改变导致细胞将通过关注FAs的动态和捆绑肌动蛋白丝称为应力纤维(SFs) [34]。我们结合精确的观察FAs和SFs FA和拆卸的定量分析与SFs的时空变化。这些观察和分析证明了细胞内的时空协调由于肌动蛋白细胞骨架重组FA形成的自组装机理和动力学。

2。材料和方法

2.1。细胞培养、转染和样品制备

瑞士3 t3成纤维细胞(这里细胞库、筑波、日本)的5%股份有限公司₂在37°C杜尔贝科修改鹰的介质(低糖DMEM;美国GIBCO)补充10%胎牛血清(Nacalai Tesque、日本)和青霉素和链霉素(50单位/毫升和50μg / mL, resp) (GIBCO)。长期的观察细胞迁移,细胞被镀在35毫米的玻璃盘子(Matsunami、日本)。肌动蛋白SFs的观察和FAs细胞迁移,细胞与pAcGFP1-actin cotransfected(美国Clontech)和pTagRFP-zyxin (Evrogen、俄罗斯)使用FuGENE高清转染试剂(美国Promega)根据制造商的指示。硅胶基质细胞被播种。玻璃碗和硅胶基质与50预镀μg / mL纤连蛋白(美国BD生物科学)在室温下30分钟。电镀后,细胞培养至少3 h有限公司5%₂孵化器在37°C,使细胞坚持在衬底和传播。

2.2。硅胶基质

一层硅胶基质嵌入荧光微球制备,其他地方的详细描述(35)做了一些调整。简单地说,一副液体硅树脂(cy52 - 276 a和B;道康宁东丽、日本)的重量比混合6:5和脱气。混合物的扩散是22×22毫米盖玻片(Matsunami)使用一个旋转涂布机(LH-D7;MIKASA、日本)。硅层的厚度小于50μm。35毫米的塑料盘有洞底部(直径14毫米)(Matsunami)组装与涂硅固化硅胶盖玻片的70°C 30分钟。组装硅胶substrate-bottom菜肴都保存在一个密封的情况下100年μL整除的液态硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane;Sigma-Aldrich日本、日本)1 h将硅衬底的表面的硅烷气相沉积。一个250μL整除的解决方案包含深红色荧光微球(0.2μ米直径,峰值激发和发射波长的660和680海里,分别地。f - 8807;美国英杰公司)与蒸馏水稀释400倍是添加到固化硅酮。大约10分钟后,底物被用蒸馏水洗净。杨氏模量的硅衬底通常1.0 kPa [35]。

2.3。长期观察活细胞成像和图像处理的细胞迁移

长期观察瑞士3 t3成纤维细胞的迁移进行了37°C 5%股份有限公司₂通过相差显微镜使用一个倒置显微镜(ECLIPSE Ti-E;尼康、东京、日本)配备完美的焦点系统,数码相机(retiga - 4000 r CCD相机;打印大师、加拿大)和萤石10 x计划目标(NA 0.30;尼康)。相衬图像捕获每10分钟24 h与NIS-Elements受控AR软件(尼康)。这些照片是1024×1024像素分辨率为1.48μ米/像素。相位对比图像的基础上,细胞边缘手工测定。

2.4。观察活细胞成像和图像处理的肌动蛋白和Zyxin

瑞士3 t3成纤维细胞表达pAcGFP1-actin和pTagRFP-zyxin镀硅衬底上的嵌入式荧光微球使用了浓烈的暗红色(图1(一))观察到37°C公司5%₂使用激光扫描共焦显微镜(A1R;尼康)计划Apo 60 x油浸物镜(NA 1.40;尼康)。荧光图像与微分干涉对比(DIC)图像获得每3分钟60分钟。在这里,时间仅限于是60分钟比图像相衬显微术的持续时间短,这是由于色差尤其是RFP-zyxin图像。在每个周期的图像捕捉,栈上的荧光成像进行0.2μ总厚度2.0米部分μ米,范围包括衬底表面顶部和底部的细胞。由于GFP-actin之间现有的高度位置的差异,RFP-zyxin,深红色的微球,最大强度投影(MIP)图像配置从5片系列共有11个系列的片荧光图像。一个例子是图所示1 (b)创建:GFP-actin MIP图像和RFP-zyxin 7片(= 1.2μ米)11片(= 2.0μ米)从底部而荧光暗红色的MIP图像创建微球从1号(= 0μ米)5片(= 0.8μ米)。从这个成像,我们收集了3套512×512像素荧光图像一起DIC图像最大的21个周期。图像分辨率从0.14到0.21不等μ米/像素。

所有使用配置的MIP图像进行图像处理,并保存为12位灰度图像(图1 (c)(左)。使用首先进行灰度GFP-actin图像的关键方法(36),随后侵蚀,开了,扩张(图1 (c)、中)。细胞边缘被发现使用轮廓检测算法和MATLAB中的“bwperim”功能。获得的细胞轮廓和区域质心如图1 (c)(右)。该区域重心计算的关键图像,在那里和每个像素的坐标和像素值,分别。应该是1(白)或0(黑色)对于关键的图像,然后呢决心是。

RFP-zyxin的每个连续的MIP图像FA可分为出生,继续到下一个时间步,或死亡。首先,个人FAs从灰度确定手动RFP-zyxin图像,而每个FA的持续时间则取自英足总出生的时间的时间死亡。其次,为了计算面积和面积重心FA,灰度RFP-zyxin图像裁剪每个足总他们在本地使用首先进行方法的关键(36)(图1 (d)(左)。我们确定个人FA领域像素的数量为每个FA局部图像的关键。此外,一个区域质心为每个足总也使用相同的计算方程对于整个细胞,上面提到的。最后,搬迁距离获得区域质心之间的距离的FA出生和相同的FA死(图1 (d),对吧)。

2.5。SFs的分类

我们定义的腹侧SFs SFs两端连接FAs和背SFs是那些连接到只有一个目的,FA靠近前缘和电弧SFs的免费或连接的另一端。严格,一般腹SFs从附近的一个足总细胞边缘扩展到另一个。弧SFs不固定在FAs,背表面可以观察到的细胞迁移。最后,背SFs将结束与足总靠近前缘,上升到背侧细胞的一部分,通常连接弧SFs (34]。在我们的分析中,SFs腹侧或背是否决定基于MIP图像根据SFs和FAs之间的连接的数量。

2.6。位移场分析使用基于图像模板匹配

为了衡量图像之间的硅衬底的位移场,连续的MIP图像荧光深红色微球嵌入到硅衬底分析模板匹配(37),我们在MATLAB中实现。为了估计衬底之间的位移场的时间阶段和,我们计算了归一化互相关函数(NCC)。NCC函数计算样本图像的每个像素与大小在时间根据模板与大小在时间: 在哪里,,和。代表的意思是和的意思是。

3所示。结果

3.1。细胞将在长期迁移

长期的观察瑞士3 t3成纤维细胞迁移进行玻璃衬底相衬显微镜。总共有19个细胞观察:2细胞显示定向迁移;7细胞失去极性和保持在同一位置;和10个细胞显示超过90°缓慢迁移期间将与大变形。四个10细胞特别是显示不同寻常的行为,具有代表性的例子在图所示2。见图2,细胞与最初的前缘的崩溃,其次是新板状伪足的形成、正交于最初的方向迁移。

专注于细胞内的自组装与肌动蛋白细胞骨架结构耦合动力学FAs的细胞,我们收购了延时的荧光图像迁移瑞士3 t3成纤维细胞表达GFP-actin RFP-zyxin和激光共焦显微镜和DIC显微镜。如图3(一个),这个设置使我们能够检测捆绑丝状肌动蛋白SFs和斑点像FAs细胞建立正反面极性方向迁移的基础上。图3 (b)代表突出的方向收缩,红色和蓝色箭头,分别。主要细胞伸出上部区域(红色箭头1)也有一个小招人注意的区域左上角(红色箭头2)。在细胞后,右下角(蓝色箭头1)和左下(蓝色箭头2)地区收回。在这里,红色箭头的方向1几乎是一样的蓝色箭头1和2,而2红色箭头的方向是垂直于蓝色箭头。这表明,细胞从红色箭头的方向转动1红色箭头的方向2。

3.2。当地足协动力学:不同的特征在前面,中间外侧,和后方区域

定量分析FA动力学,我们首先FA动力学特征在一个细胞。我们从细胞中提取FAs如图3(一个),然后持续时间、最大的区域,和搬迁距离每个FA是通过图像处理的方法解释图1 (d)。如数据所示4(一),4 (b),4 (c),21 FAs提取。的基础上均值聚类(38),这些21 FAs分为3组:一个短时间内,小面积最大,和短搬迁距离(绿色圆圈);有很长一段时间,大最大的区域,和长搬迁距离(红圈);和一个长时间、大最大的区域,和短搬迁距离(蓝圈)。21 FAs的空间分布如图4 (d)证明了FAs用绿色的圆圈表示是位于前突出的地区,而FAs红圈所示在细胞的细胞后方区域收回。FAs的蓝色的圆圈,而分散,但大约在外侧区域之间的细胞前后。FAs的这些特点的基础上,细胞迁移似乎是分为3个区域:前面,中间外侧,和后方区域。

确认统计这个细胞的分裂成3区域是否基于FAs的特点是典型的,总共有70 FAs从10细胞中提取分析均值聚类和FAs被他们位于的区域分类。结果发现,FAs确实是分为3组:绿色团体前存在的主要地区(地区),蓝色组存在的主要中间横向区域(地区L),和红色组后存在的主要区域(区域R)。最大区域的平均值和标准差,时间和迁移距离FAs的每个区域所示的数据4 (e),4 (f),4 (g),分别。单向方差分析显示显著差异最大地区F FAs之间的地区,地区L,和区域R图4 (e)(= 16.8;= 70;df = 2;< 0.001)。同样的分析,这两个时间之间的差异FAs在图的三个区域4 (f)(= 99.4;= 70;df = 2;< 0.001)和FAs搬迁距离的差异在图的三个区域4 (g)(= 101.8;= 70;df = 2;< 0.001)被发现是重要的。

这些结果表明,细胞可以明显分为3个区域:前地区,FAs小最大区域,时间短,和搬迁距离短;细胞之间的中间外侧区域前和细胞后,FAs有一个大的最大区域,长时间,和搬迁距离短;和后方地区,FAs最大区域大,持续时间长,和长时间的迁移距离。

3.3。当地FA动力学:FA搬迁和细胞外基质变形之间的关系

前面的区域下的基质细胞是流离失所的几微米,而后方区域下的基质是流离失所的远低于图所示5。硅衬底的位移场在其它9细胞也显示相同的结果。

根据图4 (g)前面的搬迁距离FAs地区是几个微米,而后方地区大约是10μm。相比与衬底的位移在前方和后方地区,这表明前门地区的FAs坚定与衬底,搬在一起。FAs后方地区不强烈与衬底,而下滑。这些结果与以前的报告是一致的,能动的成纤维细胞front-towing机制,在细胞内发挥强大的推进力量前缘附近的离散区域,导致细胞尸体被拖向前迁移期间(39),滑动后粘附在细胞后30.]。

3.4。当地FA动力学:定量的表征与衰亡在前方,中间外侧,和后方区域

更详细的理解差异在每个区域的动态FAs,时间课程FAs的面积在前面,中间横向,定量分析(图和后方区域6)。

在前面的细胞,足总动力学进一步分为2模式。第一个是,如图6(一),FAs的面积大约是1.0μ米²或少和他们反复区域之间的波动小,大,表明FAs是不稳定和不成熟。一生还不到30分钟,短FAs相比于其他地区。第二个图所示6 (b);最初FAs的面积增加,然后降低。这可能与FAs的装配和拆卸阶段(40]。足总动力学模式(人物的一生6(一)和6 (b))大约是30分钟。

在中间外侧区域,如图6 (c)和6 (d)FAs显示2的动力学模式。第一个典型模式如图6 (c)随着时间的推移,面积增加。另一种模式如图6 (d),FAs的面积几乎是恒定的60分钟。FAs的持续时间数据6 (c)和6 (d)超过39分钟,超过的FAs前排区域(数据吗6(一)和6 (b))。

的变化区域的FAs后方地区数据所示6 (e)和6 (f)。这个区域显示2中的FAs的动力学模式。在图6 (e)随着时间的推移,面积减少。相反,如图6 (f),其他FAs的面积仍几乎恒定的60分钟。

3.5。局部动态SFs加上FAs的前面,中间侧、后方区域

接下来,肌动蛋白SFs的局部动态和FAs在前面,中间外侧,和后方地区进行调查(图7)。延时蒙太奇GFP-actin和RFP-zyxin前修建的地区(地区F,装箱区域图7(一)),中间横向区域(地区L,盒装C区),和后方区域(区域R,装箱区域D)。

在前面的地区,如GFP-actin的蒙太奇在图所示7 (b),边缘的细胞逐渐上方向,这表明细胞伸出。RFP-zyxin证明新FAs的蒙太奇(橙色,黄色,绿色,浅蓝色,蓝色箭头)形成一个接一个地在一个前位置既存的FAs(红色箭头),这与先前的报道是一致的(41,42]。如RFP-zyxin的蒙太奇在图所示7 (b),一些外国语音综合症(黄色和淡蓝色箭头所示)显示时间短,而一些FAs(橙色和蓝色箭头所示)存在了近30分钟。的对比蒙太奇GFP-actin RFP-zyxin,两种类型的FAs形成与SFs(厚bundled-like丝),同时与SFs的消失同时消失了。

中间外侧区域的细胞没有凸出(图7 (c))。RFP-zyxin显示一个小的蒙太奇FA出现接近细胞边缘和它的面积逐渐成为大(黄色箭头)。在这种情况下,至于在图7 (b)观察,一个科幻垂直位置的足总。然而,在27分钟,如图所示7 (c)垂直科幻连接到其他科幻小说是对齐的平行于前缘(红色箭头),这是一个不同的行为的SFs区域图7 (b)。同一相交科幻连接又观察了39分钟图7 (c)(红色箭头)和10 8的细胞。这个观察图7 (c)一起SFs的形象在整个细胞在图7(一)表明,这些连接SFs弧科幻小说的一部分,存在平行于前缘。垂直SFs的交互与弧科幻符合以前的报告(43]。

后方地区当地的科幻和FA动态图所示7 (d)。RFP-zyxin显示一个大的延时蒙太奇FA存在最初迁向上游方向,表明英足总向核后方地区搬迁。GFP-actin图的延时蒙太奇7 (d)表明,迁移FA连接到一个衣服当成科幻收缩运动。这结果与先前的研究一致,描述了滑动拖曳粘连与SFs (30.,44]。

3.6。全球协调和FAs科幻动力学耦合

在图8一起显示,SFs连接全球的变化FAs的稳定。在30分钟,中间有2 FAs外侧区域,由白色三角形A和B所示(图8(一个))。短的SFs(红线图8 (b))组装来自FAs向细胞内,背SFs,他们似乎连接到其他长SFs前缘平行,即电弧SFs(黄色线条图8 (b))。这时,从英足总背科幻(B在图所示8(一个)电弧SFs)连接到2。然后,在39分钟,弧SFs平行于前缘开始融合成一个单一的弧科幻。在这个时间点,2背SFs和弧科幻仍然似乎是不同的;也就是说,有3 SFs FA-A和FA-B之间。在45分钟,这三个SFs成为一个科幻与FAs,这是一个腹科幻(绿线在中间区域图8 (b))。类似的改变对齐的SFs FA在前面和中间区域的细胞也可以观察到3细胞迁移。

从30分钟到45分钟,FA-A的面积几乎是常数,表明FA组装的速度被足总拆卸平衡。这将导致明显的稳定性。期间FA-B的面积增加,这表明FA-B逐渐成熟。结果表明,有FAs双方中间外侧区域的细胞通过几个背SFs相连,而这些SFs融合逐渐与弧SFs最后成为一个腹科幻小说的成熟和稳定的FAs两端(绿线在中间区域图8 (b))。这个科幻大会FAs也报道之前(43]。相反在细胞中后,从30分钟到45分钟,有几个厚,长SFs,腹侧SFs(绿色线后方地区图8 (b)),靠近外侧排列的细胞与FAs两端。类似的过渡与FAs SFs对齐的中间区域的细胞中观察到其他三个细胞迁移。

4所示。讨论

在这项研究中,我们关注的动态FAs和SFs瑞士3 t3成纤维细胞周期的细胞迁移步骤:前缘突出细胞前,收缩力代对粘连和释放后粘连和收缩的细胞。我们FA和拆卸的精确观察和定量分析表明,细胞迁移步骤的循环由3个不同的足总动力学,和FAs具有不同动力学分布在不同的细胞区域:前面,中间侧、后方区域(数据4,6,7)。此外,分析时空变化SFs的拆卸与FAs澄清科幻动力学本地(图7)和全球(图8)加上FA动力学。的基础上的结果,图9总结了自发的极性变化的假设机制导致细胞行为。

迁移循环的第一步是体内细胞(图前面9(a))。一些FAs新聚集在细胞方面的不稳定(图6(一)),而其他的快速拆卸和组装(图6 (b))。在电池方面,红线图所示9(a),背SFs延长垂直于新成立的FAs的前缘向细胞的内部,然后与拆卸的FAs(图同时消失了7 (b))。相反,在中间外侧区域的细胞,一些背SFs连接或融合长弧SFs平行前缘(图7 (c)),这是由黄线在图中8(一个)。这些SFs终于成为一个腹科幻(图8绿线),这是描述的细胞在图的中间区域9(b),中间横向FAs两端。在细胞后,发生收缩。细胞收缩可能是因为腹SFs的收缩,细胞中描述的绿线后的数字9(一),9(b)9(c),伴随着易位的FAs的SFs(图7 (d))。

在细胞后收缩后,如图9(c)和9(d),腹SFs FAs两端会在水平方向上对齐。在图9(d), SFs将来自新成立的腹侧科幻与FAs两端中间区域图9(b)(绿线)28]。另一个可能由2个或更多的退火腹SFs (45]在单元后过程中数据所示9(c)和9(d)(虚线箭头)。在图9(d),可能突出网站的细胞被认为是在周边地区(红圈线),在这没有SFs。这种假设是由先前的调查结果,局部张力转移在FAs的整合蛋白可以在本地激活Rac Cdc42,导致板状伪足的形成(46),而机械应力FAs抑制lamellipodial突出通过抑制Rac激活(47]。因此,该地区红色绕组线如图所示9(d)可以突出新FAs一起SFs的形成。应该注意的是,新的突出网站的方向垂直于初始状态的细胞在图9(一),导致细胞自发的极性变化和产生的行为。

细胞骨架重组从背腹侧SFs组装SFs和弧SFs已报告从分子的角度来看43][最近审阅的48,49]。然而,据我们所知,这样的细胞骨架重组和细胞迁移之间的关系还没有被报道。在目前的研究中,我们表明,科幻大会,加上越来越多,显然FA动力学稳定,发生在年底背SFs中间外侧区域的细胞。从这个观察,我们提出的模型图9,表明这样的全球协调科幻动力学与FAs会导致细胞将在迁移过程中行为。连续突出的方向细胞可能是最简单的描述细胞行为,可以解释为著名的迁移的关键步骤:突出前沿,通过FAs粘附到细胞外基质,随后的超然。我们的模型可以提供更多新颖的见解极性变化的机制由自我组装的肌动蛋白细胞骨架结构。为了建立这里提到的极性变化的机制,需要进一步观察图后确认过程9(d)。

5。结论

在这项研究中,我们提出了一个假设细胞将专注于肌动蛋白SFs的耦合动力学和FAs瑞士3 t3成纤维细胞。在中间外侧区域的细胞,我们观察了FAs成熟,变得稳定。此外,我们的分析表明,2背SFs组装FAs靠近前缘,然后连接到弧SFs,逐渐融合成一个单一的腹侧科幻。这种变化在科幻的组织细胞收缩在第一个周期的迁移,后跟一个新成立的突出在接下来的周期会导致细胞将在瑞士3 t3成纤维细胞迁移。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

美智子Sugawara和Hiromi三好了同样的工作。

确认

作者感谢博士Iwadate义明(山口大学、山口、日本)的技术建议和帮助使硅衬底内嵌微球。作者还要感谢先生Daishi Inoue博士(日本和光,理kouichi)和渡Murakoshi(日本鹿儿岛大学)的技术帮助观察硅衬底的表面拓扑嵌入微球使用扫描电子显微镜和原子力显微镜,分别。本研究支持部分由日本促进社会科学KAKENHI批准号。24700448,25630046,和16 k01350。

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