胚胎发育毒性的碳量子点/罕见的不起眼的幼虫(Gobiocypris rarus)

文摘

CDs罕见的不起眼的毒性作用(Gobiocypris rarus)胚胎不同发育阶段。结果表明,罕见的小鱼胚胎降低了自发运动,身体长度,增加心率、心包水肿、卵黄囊水肿、尾/脊柱弯曲,各种形态畸形,孵化率下降。生化分析表明CDs敞口显著抑制Na的活动⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶和钙^{2 +}atp酶、MDA含量和SOD的活性增加,猫,GPX。进一步检查表明,CDs敞口引起严重的胚胎细胞DNA损伤。此外,信用违约掉期敞口诱导upregulation发展相关的基因(Wnt8a和Mstn)的差别以及对这些Vezf1。总的来说,目前的研究显示,CDs敞口显著发展毒性罕见的小鱼胚胎/幼虫。从力学上看,这种毒性可能结果诱导氧化应激压力的协调与发展相关的特异表达基因表达的CDs敞口。

1。介绍

碳量子点(CDs)表示一个类小于10纳米大小的纳米粒子组成的碳,氢,氧,氮,和其他元素(1]。轴承优势更高的耐热性、耐光性、量子产率,降低重金属离子的释放率比传统的半导体量子点(2)、cd提出了广泛的潜在应用在分析化学、生物探测和成像、药物输送等(3- - - - - -5]。此外,随着纳米技术的出现、cd在环境正变得越来越普遍。这引发了公众越来越关注生物安全和长期暴露于cd的潜在健康风险。先前的研究表明,TiO的浓度₂在地表水21 ng / L和C₆₀在污水是4 ng / L,这可能会增加到35 mg / L通过悬浮过程在自然水系统(6]。此外,一系列研究表明纳米材料包括CdSe /硫化锌和TiO₂可以诱导鱼类胚胎的发育缺陷,如胚胎心包水肿,卵黄囊水肿、和尾畸形7),这表明CDs的潜在风险影响的自然水生态系统。因此,生物和环境毒性的cd逐渐引起了极大的研究兴趣为进一步应用程序所需的安全性评价。

然而,只有有限的关于这个问题的研究报告而全面的毒性作用和潜在的机制仍不清楚。在16 HBE细胞,高浓度的cd治疗导致氧化损伤和增殖率下降。此外,cd可以与BSA形成一个复杂导致一些功能蛋白质的结构变更(8]。在动物模型中,当cd管理通过大鼠的尾静脉注射,观察氧化损伤和破坏了免疫平衡的靶器官,最终诱导补偿病理病变(9]。

这里我们报告一个生物安全研究CDs罕见的小鱼(Gobiocypris rarus),一个在中国流行鲤科的鱼(10]。与严重的特性,比如短生命周期,授精率高,孵化率,罕见的小鱼被认为是一个合适的水生生物的生物毒性评估(11]。

在我们的研究中,我们调查了在胚胎发育毒性的cd /幼虫罕见的小鱼。我们的数据不仅丰富了科学认识的生物相容性和风险评估cd,也促进早期诊断的潜在污染渔业水域引入纳米材料。

2。材料和方法

2.1。cd

cd (w - 900 - 440)是购自北大Jubang科技有限公司(中国,北京)。单分散的cd是2 - 6纳米大小的和准备10毫克/毫升(水溶液)。CDs的荧光发射波长440 nm。

2.2。鱼饲养和胚胎收集

性的成熟和健康的罕见的小鱼被选为母鱼。后长期适应环境(超过4周)循环水系统以性别比例为1:1,产卵时间点设置每日20:00通过操纵昼夜节律。一旦性母鱼的追逐行为观察,收集受精卵其次是人工授精(受精率> 95%)。母鱼每天喂三次视觉饱满(两次与商业颗粒食品和仙女虾)。文化被设置为条件°C与日常光周期循环12:12(光明:黑暗)。

2.3。胚胎毒性试验

毒性试验的目的是根据既定的协议(12]。简单地说,一些罕见的小鱼胚胎受精后立即收集;在胚泡阶段,正常胚胎选择和单独引入24-well盘子装满1毫升/每口井的每日更新的解决方案或控制。盘子被孵化°C水浴96 h的光周期12:12 h(光明:黑暗)。CDs后续的胚胎发育的毒性影响罕见的小鱼被暴露评估受精卵一系列浓度(0、1、5、10、20、40和80 mg / L)。标准的稀释溶液作为控制。三个井浓度组和三个复制集的测试,与20胚胎复制。在我们的研究中,胚胎、幼虫从五个胚胎早期发育阶段(12高通滤波器,24高通滤波器,48高通滤波器,高通滤波器,72和96年的高通滤波器)进行了采样和分析。

2.4。显微观察

发展参数监测和记录每六个小时12高通滤波器(小时后受精)和96之间高通滤波器。毒理学端点确定通过显微镜观察(日本尼康SMZ 25日)。96年12个高通滤波器和高通滤波器阶段之间,孵化率、死亡率和畸形率计算。自发的运动频率在36个高通滤波器阶段和心率60高通滤波器计算阶段,分别。体长(mm)、心包水肿的面积(μ米²),sac-yolk水肿面积(μ米²)和SV-BA距离(μ米)在96高马力阶段用数码相机拍摄和测量从这些数字图像使用图像专业+ 6.0软件(媒体控制论,美国)。

2.5。测量的抗氧化酶,Na⁺/ K⁺atp酶、钙^{2 +}atp酶活性和丙二醛(MDA)含量

从每组20胚胎/收集幼虫。每个样本解冻和均质冰冰冷的生理盐水为0.65%。离心法在2500×g在4°C后10分钟,上层清液的收集和测量的MDA含量和抗氧化酶的活动,Na⁺/ K⁺atp酶、钙^{2 +}腺苷三磷酸酶基于工具手册(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。

2.6。彗星试验

从每组20胚胎/收集幼虫。样本完全消化在37°C水浴0.25%胰蛋白酶。离心法在2500 g×10分钟后,补充适量的PBS (pH值7.4),单细胞悬液(10⁴-10年⁶/毫升)准备和单细胞凝胶电泳(SGCE)。对于每一个治疗组,每张幻灯片约100个细胞被随机分通过荧光显微镜图像分析。彗星图像分析汽车彗星图像分析系统(13]。样本的DNA损伤评估的彗星尾长,比例的总DNA的尾巴,尾巴,尾巴和橄榄的时刻。

2.7。基因表达分析

根据基因库的基因序列,引物设计的引物(表5.0软件1)和合成生物技术公司(表达载体)。测试的总RNA罕见的小鱼胚胎/幼虫提取使用RNAiso +(豆类,京都,日本)。总RNA含量测定通过测量吸光度在260 nm和RNA质量验证了吸光度的比值在260/280 nm(范围在1.8 ~ 2.0)。第一链cDNA合成是由使用PrimeScript®RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类,京都,日本)根据制造商的指示。qPCR结果计算使用方法(14]。

2.8。统计分析

统计分析是单向方差分析或进行的t以及根据方差异质性(SPSS 17.0)。单向方差分析分析后,LSD多重范围测试是用于评估之间的控制和治疗组;否则t- - - - - -测试进行控制和治疗组之间因为异质性的方差。的差异被认为是重要的p< 0.05和非常重要的p< 0.01。

3所示。结果

3.1。胚胎发展的形态和行为分析罕见的小鱼

CDs罕见的小鱼胚胎的毒性效应/幼虫在不同发展阶段是浓度的方式调查。如图1(一)12个高通滤波器的阶段,没有明显的发育缺陷被观察到低浓度组(1、5、10和20 mg / L)与对照组相比。在高浓度组(40 mg / L和80 mg / L),胚胎卵黄浊度/观察凝集。此外,长曝光时间畸形率表示增加了身体的长度越短,尾巴/脊柱弯曲和心包水肿,和罕见的小鱼胚胎卵黄囊水肿/幼虫(图1 (b))。

CDs的影响胚胎的孵化率和死亡率罕见的小鱼进行测试。如图2与对照组相比,最高的cd浓度导致加速孵化。孵化的幼虫是第一阶段观察到54 ~ 60高通滤波器最高浓度组当他们发现阶段60 ~ 66高通滤波器在对照组。孵化率显著降低,以应对CDs治疗(图2(一个))。当曝光时间延长到96年高通滤波器,大多数未孵化的胚胎死亡。

,死亡率增加浓度的方式观察后接触阶段的cd 96高通滤波器。有趣的是,各浓度组无显著变化在72年之前发现治疗高通滤波器相比后的死亡率明显海拔72高通滤波器(图2 (b))。建议72高通滤波器阶段可能是重要的决定命运的罕见的小鱼胚胎发展的环境压力的反应引入的cd。

自发的胚胎运动在36个高通滤波器阶段后浓度的方式减少暴露在cd。10、20和40 mg / L组,自发的胚胎运动显著降低与对照组(p< 0.01)。在60高通滤波器阶段,胚胎心率在对照组每30秒跳动(平均数±标准差)(表2)。胚胎心率显著增加20 mg / L组(p< 0.01)。40和80 mg / L组心率只是略微增加。畸形率增加浓度的方式在CDs敞口96高马力的阶段。在10 ~ 80 mg / L浓度组,畸形率显著增加的价格相比对照组(p< 0.01)。

我们也调查了罕见的不起眼的cd对心脏的影响发展的胚胎。1和5 mg / L浓度组,与控制相比,没有检测到显著改变SV-BA距离(p< 0.05),在10 ~ 80 mg / L浓度组,SV-BA距离显著增加(p< 0.01)。心包水肿显著扩大面积和sac-yolk水肿出现,分别的比例增加cd浓度。在组织浓度高于10 mg / L,心包水肿和sac-yolk水肿明显减少控制幼虫(相比p< 0.01)。

此外,高浓度cd治疗导致幼虫体长的变化。在96年的高通滤波器,幼虫在对照组明显短身长比更高的浓度(40和80 mg / L)组(表2)(p< 0.01)。

3.2。CDs Ca的影响^{2 +}腺苷三磷酸酶和Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶活性的罕见的小鱼胚胎/幼虫

如图3Ca的活动^{2 +}腺苷三磷酸酶和Na⁺/ K⁺暴露后atp酶浓度的方式降低cd。在最高浓度(80 mg / L)组,Ca^{2 +}腺苷三磷酸酶活动下降到43%,28%,33%,和25%的控制阶段12个高通滤波器,48高通滤波器,72高通滤波器,分别和96高通滤波器。同样,Na⁺/ K⁺atp酶活性下降后浓度的方式接触到cd。在最高浓度(80 mg / L)组,Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶活动下降到40%,47%,65%,63%,和67%的控制在12个高通滤波器,24高通滤波器,48高通滤波器,72高通滤波器,分别和96高通滤波器阶段。

3.3。发育相关基因表达

我们讨论的影响CDs开发相关基因的表达模式。如图4,Wnt8a,Vezf1,Mstn信使rna水平在不同浓度(1、5、10、20、40、80 mg / L)检查β肌动蛋白基因作为内生控制。mRNA水平评估的值的褶皱控制。在12个高通滤波器阶段,Mstn和Wnt8a显示,表达而增加Vezf1表达式是各浓度组表达下调。

在24日带通滤波器阶段,Mstn表达式是调节。进一步提高cd的浓度,这些褶皱的变化Mstn表达式显示趋势的上升,然后下降。此外,随着浓度的cd,Mstn表达式显示趋势的上升,然后下降。Wnt8a表达式是调节。在40和80 mg / L集团Wnt8a表达显著升高与控制()。相比之下,Vezf1表达下调的cd浓度增加。在40和80 mg / L组,Vezf1表达式来控制相比明显减少。

在后期(48 - 96高通滤波器),Wnt8a表达式是调节cd浓度增加。为了应对治疗80 mg / L cd,Mstn表达水平显著增加公司的显著减少Vezf1在48个高通滤波器表达式,72高马力和96高通滤波器(图阶段4)。

3.4。cd对SOD的影响、猫和GPX活性和MDA含量的稀有小鱼胚胎/幼虫

我们也调查了CDs SOD的影响,猫,GPX活性和MDA含量的稀有小鱼胚胎/幼虫(图5)。SOD活性增加和延长曝光时间与对照组相比,除了在72年的高通滤波器的阶段。在较高的浓度(20、40和80 mg / L)组,显著提高SOD活性检测与控制(p< 0.05)(图5(一个))。猫活动变更显示了类似的模式与SOD。延长曝光时间,显著更高的猫活动相应的检测(图5 (b))。GPX活动倾向于上升与cd暴露时间增加。在每个阶段,更高的cd治疗浓度诱导GPX活性的大幅增加(p< 0.05)(图5 (c))。CDs敞口增加了MDA含量明显比控制在每一个发展阶段。随着曝光时间变得更长,MDA含量显示增加的趋势更加突出在高浓度组(20、40和80 mg / L) (p< 0.01)(图5 (d))。

3.5。DNA损伤分析

通过彗星试验,我们检查了CDs敞口是否会引起胚胎细胞的DNA损伤。结果表明,CDs敞口引起的DNA损伤细胞(图6)。在72高马力阶段,控制细胞显示均匀和定期轮没有尾巴(图大小的核6(一))。1 mg / L浓度组,细胞显示椭圆核染色没有观察到尾(图6 (b))。高尾染色信号出现在回应cd浓度的增加(数据6 (c)- - - - - -6 (g))。

进一步,我们测试了如果尾巴长度染色细胞比例的cd浓度细胞治疗。如图7、cd治疗促进尾部形成细胞。20、40和80 mg / L组,尾巴长度染色明显强于控制()。除了低浓度组(1、5、10 mg / L),长cd曝光时间促进彗星尾巴的长度和DNA含量。在稍后阶段(96年48高通滤波器,72高通滤波器和高通滤波器),彗星尾巴的长度和DNA含量增加浓度的方式。

4所示。讨论

4.1。CDs罕见的小鱼胚胎的早期发育毒性

一系列的研究表明,纳米材料可以诱导鱼类胚胎的发育缺陷其中心包水肿、卵黄囊水肿、脊椎弯曲,出现最频繁,表明CDs的潜在风险影响的自然水生态系统。

陈等人发现异常凝结的胚胎蛋,心包水肿,脊椎弯曲,斑马鱼胚胎/幼虫后接触CdSe /硫化锌量子点(15]。金姆和畅谈表明citrate-functionalized TiO₂纳米粒子引起心包水肿、卵黄囊水肿、颅面畸形,不透明的蛋黄在斑马鱼胚胎16]。Lv表明,纳米氧化锌诱导斑马鱼胚胎心包水肿,卵黄囊水肿,尾部畸形(17]。

一致,我们的结果表明CDs敞口也引起心包水肿,卵黄囊水肿,尾部畸形的胚胎、幼虫罕见的小鱼。这些数据证实了结论:纳米粒子暴露会引起鱼类胚胎的发育缺陷/幼虫。另一方面,我们的数据也显示心包水肿,卵黄囊水肿、和尾部畸形的主要后果是纳米粒子暴露在不同的香料除了斑马鱼鱼,意味着共同的潜在环境风险cd和守恒的发展途径的可能的分子机制特异表达在鱼类胚胎/幼虫。

4.2。分子机制强调了发展缺陷引起的信用违约掉期敞口

为Na的主动运动提供能量⁺和K⁺穿过细胞膜,上皮细胞和Na⁺/ K⁺在全身渗透调节atp酶起着核心作用,离子运输、肌肉功能,和其他几个膜运输相关的生理过程。先前的研究已经报道,Na的活动⁺/ K⁺atp酶是重要的生长和存活中国对虾在postlarval阶段(18]。希尔等人表明,显著减少引起的畸形率TCDD通过调节渗透压平衡的斑马鱼胚胎19),这表明化学诱导浮肿的畸形和渗透调节之间的相关性。在我们的研究中,cd治疗降低了Na⁺/ K⁺atp酶活性浓度方式(图4 (b))。它可能会阻止钠的排出⁺随后打破Na的平衡⁺积累,最终导致细胞的水肿和破坏20.]。

鱼卵的孵化过程很大程度上是由合作孵化酶和膜脂质过氧化作用,这削弱了蛋膜随着胚胎蠕动(21]。在大多数鱼类、孵化酶合成的孵化腺分布在胚胎的外表面和卵黄囊22]。通过干涉光谱仪,在我们的研究中,我们观察到,在罕见的小鱼,孵化腺细胞位于表面的卵黄囊(数据没有显示)。因此,卵黄囊的缺陷发展可能引发孵化腺的失活。光盘可以通过内吞作用进入胞浆机理(23]。此外,cd可以与蛋白质、多糖、细胞或其他生物分子,随后影响孵化酶活性。它可以解释下孵化率结果从cd治疗(80 mg / L)。

在我们的研究中,血管内皮锌指(Vezf1)表达水平降低cd浓度增加(图5 (b))。Vezf1参与控制血管早期发育的分子途径。Vezf1可能发挥重要作用内皮血统决心和胚胎血管生成和血管生成在后期24]。沉默Vezf1对鸡胚胎体内建议Vezf1是重要的血管和心脏的发展(25]。的表达水平下降Vezf1在早期发展影响心血管系统的功能。最终,心脏生理补偿促进胚胎的增加心率和SV-BA距离在10 ~ 80 mg / L浓度组(表2)。

在我们的研究中,Ca^{2 +}腺苷三磷酸酶活动减少和增加的cd浓度和暴露时间(图3(一个))。Ca^{2 +}atp酶起着至关重要的作用,在维持细胞内钙的浓度^{2 +}(26]。抑制钙的活性^{2 +}atp酶会导致细胞内积累的Ca^{2 +}导致骨骼发育缺陷。肌肉生长抑制素(Mstn),Wnt8a表情明显观察到被调节的cd治疗浓度的方式(数字4(一)和4 (c))。Mstn属于转化生长因子b (TGF-b)家庭和已被确定为一个重要的负调节肌肉发展的27]。

国防部介导肌肉发展由TGF -严格监管β途径。作为重要的转录监管机构国防部,Mstn可以招募的SMAD蛋白质国防部管理序列占弱智肌肉增长(28]。Wnt8a Wnt /是一个关键因素β连环蛋白信号通路对身体轴扩展(29日]。Wnt8a最初位于底部区域的动物受精卵极古典Wnt /激活β连环蛋白信号通过把注定超小型电子管地区,导致脊椎的弯曲或尾巴在开发进展30.]。表达下调Wnt8a尾轴结构的结果缺乏在斑马鱼胚胎/幼虫(31日]。重要的表达增加Wnt8a表明抑制体轴扩展。综上所述,一方面,这两个Wnt8a表达upregulation和抑制Ca^{2 +}atp酶活性促进骨骼发展,另一方面,增加了Mstn表达块的肌肉发展可以解释观察到的尾巴在这项研究中,脊柱的弯曲度。

值得注意的是详细的机制强调了cd诱导目标基因表达的改变是知之甚少。之前的研究表明,CDs可能包裹着两双链DNA (dsDNA) [32)和细胞功能蛋白质(9]。这些结果的概率提供cd可能影响目标基因的转录通过cis或transregulation。因此,在我们的研究中,我们认为有两种可能的机制一起单独工作或改变发展相关的CDs敞口引起的基因表达:(1)的cd可能绑定到cis-elements阻止转录因子的结合位点。(2)cd可能包裹着直接和特异表达的转录因子。然而,需要进一步的研究来阐明这个问题在未来。

4.3。氧化应激和DNA损伤

氧化DNA损伤和炎症反应迄今为止所涉及的两个主要机制有关纳米材料的生物毒性(33,34]。在正常生理条件下,内源性抗氧化酶对抗活性氧(ROS),防止机体的氧化损伤。事实上,鱼可以对抗氧化应激和酶系统包括SOD、猫、GPX。SOD转换超氧化物阴离子在H₂O₂然后猫GPX催化反应的酶消化H₂O₂在H₂O和(35]。在外源压力,异常的活性氧积累将打破这种平衡并生成细胞的氧化损伤。

环境污染物进入人体并产生活性氧自由基通过一系列的代谢转换。如果不及时清除,平衡将被破坏,导致生物氧化损伤(36]。法律流程外包可以被定义为细胞膜脂质氧化损伤和被广泛使用作为一个生物体内氧化应激(37]。细胞膜的主要产品之一,法律事务外包,MDA水平一直被视为法律外包水平的指标38]。

在目前的研究中,SOD活性增加cd治疗后(图5(一个)),表明氧化应激的发生。SOD首先采取行动,清除;然后抗氧化系统变得活跃,国防和同步SOD与CAT的活性。这些结果与之前的研究一致39]SOD和猫之间的相关性被发现在贻贝Mytilus galloprovincialis在铜纳米颗粒接触压力。此外,由于积累H₂O₂生成的通过SOD,猫成为活跃的快速跟上SOD(图5 (b))。此外,GPX活性诱导的高强度的压力来自cd浓度(图5 (c))。

总之,在罕见的小鱼,抗氧化酶系统包括SOD、猫,GPX组合在一起,对氧化应激和保持较低的MDA含量在一定范围内cd浓度组。然而,长时间的CDs敞口在20日40和80 mg / L浓度组打破了机体抗氧化能力和结果在MDA含量的增加(图5 (d)),这表明CDs敞口胚胎诱导的氧化应激。因此,罕见的有缺陷的发展小鱼胚胎出现了。

CDs浓度增加和延长曝光时间,严重的罕见的小鱼胚胎/幼虫细胞DNA损伤检测(数字6和7)。它可能是更高的畸形和死亡率的原因。cd浓度的进一步增加导致更严重的DNA损伤诱导的活性氧攻击核苷酸。受损的DNA不能及时修复;因此,畸形率和死亡率显著增加(40]。

5。结论

(1)总之,更高浓度的cd有重大发展毒性罕见的小鱼胚胎可以描述为减少自发运动和身体长度,增加心率、心包水肿,卵黄囊水肿和尾巴/脊柱弯曲,各种形态畸形,孵化率下降。(2)底层机制的发育毒性似乎与氧化应激的产生有关,压抑的DNA修复功效,改变发展相关的基因表达。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Haoxing Zhang博士和许博士彭日成的语言编辑手稿。这项工作是支持的基础研究基金为中央大学(XDJK2014C061和XDJK2016E098)。

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