DASAF: R包深Sequencing-Based母亲常染色体异常的胎儿游离DNA检测

文摘

背景。随着大规模并行测序(MPS)的发展,非侵入性产前诊断使用母体DNA正迅速成为游离胎儿染色体异常检测的首选方法,由于其固有的高精度和低风险。通常,议员数据解析计算风险评分,这是用来预测胎儿染色体是否正常。虽然有几位议员高度敏感和特定的数据分析算法,目前没有实现这些方法的工具。结果。我们开发了一个R包,发现常染色体异常的胎儿(DASAF),实现三个最受欢迎的三染色体细胞检测方法标准分数(STDZ)方法,GC修正分数(GCCZ)方法,内部参考分数(IRZ)等方法与一个subchromosome异常识别方法(SCAZ)。结论。与DNA测序的成本下降和个性化医疗的进步,非侵入性产前测试的需求无疑将增加,这将反过来触发增加工具进行后续分析。DASAF是一个用户友好的工具,实现R,支持识别whole-chromosome以及subchromosome异常,基于颗粒后基因组DNA测序数据映射的孕产妇。

1。介绍

胎儿常染色体非整倍性是一种异常的染色体数目在新生儿的死亡率为6% -11%。最常见的常染色体非整倍性是唐氏综合征(称21三体综合症)的发生率1每160个新生儿中导致精神发育迟缓和发育不全1]。除了whole-chromosome非整倍性,相当数量的胎儿是高危subchromosomal异常(2- - - - - -4),也导致精神疾病和其他异常(5]。

传统的筛查染色体异常产妇年龄相结合,胎儿的超声检查,和各种蛋白质或激素水平在产妇血指传统无损检测(6]。然而,传统的非侵入性方法缺乏准确性,因为它们是潜在的间接度量染色体缺陷(7,8]。所以孕妇要选择包括绒毛膜绒毛取样和cordocentesis侵入性方法,加上胎儿细胞核型分析,给出明确的答案。但有0.5%的流产风险增加了额外的关注孕妇及其家属(9,10]。

胎儿游离DNA的发现在孕产妇血清11)和大规模并行测序(MPS)技术的最新进展(12- - - - - -14现在启用无创性产前测试(NIPT)胎儿染色体非整倍性15- - - - - -18),具有很高的特异性和敏感性19- - - - - -21]。除了作为非侵入性,NIPT只需要5毫升的母体外周血进行测序。序列使用生物信息学方法分析计算危险分数,然后使用它来确定胎儿染色体是否正常。虽然标准分数(STDZ)方法最初是使用,后来发现,这种方法的准确性取决于问题的染色体的GC含量(15]。更具体地说,方差系数(测量的百分比表示的每个染色体)是更大的染色体18比21号染色体和13 (15,16]。这种变化在准确性与测序功效的差异作为染色体的大小和GC的函数的内容。近年来,出现了许多方法来解决上述问题,包括一个GC校正分数(GCCZ)方法(21),内部参考分数(IRZ)方法(20.),无创胎儿三染色体细胞(漂亮的)测试19),以及方法Srinivasan et al .,从今以后称为subchromosome异常分数(SCAZ)方法(22]。前三种方法是类似于标准方法(分数)整整识别异常染色体,而最后一个方法用于识别subchromosomal(即。染色体区域)损失和收益。刘等人表示,标准分数(STDZ)方法准确地检测称21三体综合症在怀孕早期低精度的11周对于其他非整倍性,为三倍体13 0%和40%三倍体18,而GC校正黄土回归方法(GCCZ)更准确比STDZ但仍称18三体的检出率较低。使用和调整方法分数与一个内部参考(IRZ)为GC纠正偏差和测序效率,显著地提高了性能测试(20.]。

另一方面,Verweij等人调查孕妇的态度关于NIPT称21三体综合症的检测(T21):他们有一个积极的态度对于NIPT T21的检测,超过50%的人拒绝传统的筛选会接受NIPT如果可用23]。然而,尽管NIPT已成为越来越受欢迎的和可接受的和后续的数据分析算法出现,目前没有工具来实现这些数据分析方法。在目前的研究中,我们开发了一个R包,DASAF,实现三个最受欢迎的三染色体细胞检测方法(STDZ、GCCZ IRZ)和一个subchromosome异常识别方法(SCAZ)。我们还包括胎儿性别预测模块DASAF包中。与DNA测序的成本下降和个性化医疗的进步,我们相信NIPT的需求将会增加,这无疑会导致增加的工具可用于后续分析。

2。材料和方法

本研究的独立伦理委员会批准临床研究中心上海。这里使用的参考数据由DNA测序数据从湖州一百二十名孕妇产妇和儿童保健医院位于湖州,浙江,中国。Illumina公司产生的所有数据都为100 bp pair-end HiSeq2000 7×10⁶17×10⁶阅读对每个样本序列。

人类基因组的测序读是对齐的组装与领结hg19短读准仪(版本1.1.2),最多允许两基地不匹配时调整(24]。只有独特的映射读取。

在使用DASAF之前,测序数据应该一致使用上面的方法,这是独立于DASAF软件和需要用户自己完成。结果文件从领结是DASAF作为输入。所有的引用数据集描述表1。典型DASAF工作流涉及两个过程:映射读统计和常染色体非整倍性预测(图1)。

2.1。读取数据映射

读映射数据产生两个文件:一个包含独特的映射读取每个染色体计数和其他包含映射位置为每一个独特的阅读。规范化染色体比(NCR)按照下列方程生成每个染色体在每个示例:NCR的比例是读取唯一地映射到特定的染色体数除以总数量的读取唯一地映射到所有常染色体染色体(15,25]。如果使用GCCZ方法,计算每个染色体的GC含量从映射的结果。

2.2。常染色体非整倍性预测

2.2.1。标准得分方法

在标准分数(STDZ)理论方法,风险比分数计算,以确定胎儿染色体是否正常: 在哪里序列数的比例是唯一地映射到特定的染色体和总数的独特序列映射到所有的常染色体染色体,染色体的平均NCR吗参考样品,是染色体的标准差为协助参考样品,是特定的染色体数目,13日,18日和21日15]。

的平均值和标准偏差值的协助,可以使用参考文件(NCR_ref.txt)包含在DASAF包或计算基于自己的样品。的分数是一个数字表明观察偏离平均多少人口(26]。通常,一个分数3选为阈值,以确定胎儿是否正常或不22]。

2.2.2。GC校正得分方法

我们从NCR计算斜率值(参考文件NCR_ref.txt)染色体13日18日和21 120参考样品对GC含量(引用文件GC_ref.txt)线性回归和纠正NCR价值计算使用以下方程: 在哪里NCR值GC校正后,NCR初始值,然后呢和是引用的平均值的染色体GC含量和斜率的线性回归参考样本(21]。

然后,均值和SD GC-corrected NCR的参考数据集和计算分数计算染色体的样本测试使用(1),分截止3。

2.2.3。内部参考得分方法

测序偏差最小化(源于不同的GC含量)、刘等人提出了一个得分方法依赖于一个内部参考染色体(20.]。他们表明,使用染色体4、8和14作为内部参考染色体的检测提供了最准确的结果三倍体13,三倍体18,分别和称21三体综合症。方法如下:比较NCR计算从内部参考使用价值,其中红外是染色体,染色体内部参考。的分数也计算了(1),测试样品的红外调整NCR值减去平均红外调整NCR值参考样本和不同的是然后从红外除以标准差调整NCR值参考样本。一个分数3被选为阈值的诊断三染色体细胞染色体的测试样本20.]。

2.2.4。Subchromosome异常得分方法

除了whole-chromosome异常,subchromosome损失和收益也是重要组成部分染色体疾病(4]。subchromosome异常分数(SCAZ)是一个方法用于识别异常的染色体区域长度在100 kb和1 Mb (22]。在第一步中,位置独特映射到基因组中检索和统计为标记。和整个基因组分为连续箱1 Mb的长度和100 kb和标签被分配到单个垃圾箱进行以下分析。然后GC含量百分比的每本计算排名在整个基因组的垃圾箱。然后每一本都规范化使用标签的比例在本标签的数量之和与最近的垃圾箱GC含量百分比。垃圾箱与最近的GC含量百分比包括10箱1 Mb的长度和40箱100 kb的长度。方程如下: 在哪里的比例是th本为染色体和数的标签吗th本为染色体。代表了箱子的长度100 kb和1 Mb。

此外,每个BRV偏离中间值的检查收集所有类似于标准的参考样本评分方法,而平均绝对偏差(疯狂)进行调整(即。,MAD was multiplied by 1.4826); here是1.4826。考虑 的绝对值得分大于3表明,基因拷贝数异变在胎儿染色体特定基因组区域(22]。

3所示。结果和讨论

我们建立了DASAF R包,它支持三种现有的方法用于识别整个染色体异常,一个用于识别subchromosome从议员数据异常。然后,我们比较了运行时间和识别精度的四个方法。

3.1。染色体异常检测方法的比较

这里使用的检测方法都是来自现有的算法和其准确性一直测试之前(19,20.]。因此在这里,我们只列出了这些算法之前报道的结果。刘等人提供的检测率和假阳性利率三个whole-chromosome三染色体细胞检测方法。他们的研究显示,所有的三个方法的假阳性率0和IRZ是最敏感的方法,与所有预断检查检出率为100%(13、18和21)。STDZ的方法,检测称21三体的检出率是100%,但只有40%称18三体和近0%的三倍体13,而GCCZ方法称21三体的检出率为100%,90%称18三体,100%为三倍体13比标准方法但比IRZ方法(20.]。江泽民等人也评价这三种方法的性能通报了903起病例和发现,变异系数(CV) STDZ方法比其他两种方法在临床相关的染色体(13、18和21)。因此,穷人STDZ方法检测灵敏度的预断13到18岁。然而,GCCZ方法演示了超过99%的性能检测的敏感性和特异性预断13日18日和21日,虽然IRZ方法显示简历比GCCZ但小于STDZ染色体预断13日18日和21日19]。总之,调整方法(GCCZ和IRZ)更准确地识别预断STDZ方法。

也报道,SCAZ方法,识别染色体基因拷贝数异变,可以准确地检测损失和收益的染色体区域(22]。

3.2。评估的诊断准确性测序深度的函数

为了评估测序深度在诊断准确性的影响,我们随机抽样100个基点pair-end (PE)测序数据读项至少3米,5米,7米,12米。使用STDZ方法,例诊断为T21-positive或T21-negative。重要的是,我们发现,即使读计数3 M, T21准确诊断,这表明测序的成本可以大大降低减少序列覆盖率。结果如图2证明分数的正样本更大3(上图的水平线)。

3.3。执行时间比较

我们测试了所有方法的运行时间DASAF包中包含在数据集上读双12米,20米,40米(来自湖州产妇和儿童保健医院的病人)。

STDZ和IRZ跑的速度比其他方法如果NCR值引用事先准备。GCCZ方法需要用户计算每个染色体的GC含量,消耗了大量的时间。SCAZ方法有最长的运行时因为BRV需要计算每本通过计算标签。尽管所有运行时间是可以接受的,可以大大减少这些时间减少序列读计数(表3 - 5米2)。

4所示。结论

我们开发了一个R包支持染色体异常检测。染色体异常检测,用户可以选择一个支持的四种方法,或者对整个染色体异常检测,总结三种可用方法的结果(即。,平均三个分数)检测预断13日18日和21日。我们选择了一个分数阈值3预测胎儿染色体异常。参考目录下的数据集包中的数据可以更新或替换用户随着样本的增加,可促进这些方法的准确性。详细描述包含在DASAF包协助非专家现场(http://lifecenter.sgst.cn/dasaf/)。

高通量测序的成本大幅下降在过去的几年中,从而增加其效用在临床实践27,28]。无创性产前诊断是应用最广泛的方法,检测三染色体的异常或损失或获得的染色体区域,和越来越多的孕妇都受益于这种技术。2014年8月,无创性产前基因诊断终于获得批准后的法律地位在中国注册的第二代基因测序诊断产品。这是一个重大进步领域的产前筛查,无疑将受益很多孕妇及其家庭。

缩写

DASAF:	检测常染色体异常的胎儿
议员:	大规模并行测序
NIPT:	非侵入性产前测试
STDZ:	标准分数
GCCZ:	GC校正分数
IRZ:	内部参考分数
漂亮的:	无创性胎儿三染色体细胞
SCAZ:	Subchromosome异常分数
NCR:	规范化的染色体表示
BRV:	本比率值。

附加分

(我)项目的名字是DASAF。(2)项目主页http://lifecenter.sgst.cn/dasaf/。(3)操作系统Linux和Windows (Linux推荐)。(iv) R和Perl编程语言。(vi)许可证GPL2。(七)没有非学术的限制使用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Baohong刘设计研究,分析,执行cowrote,构造了R包,和准备。晓燕唐加工数据和cowrote。纯美少女道也cowrote纸。冯秋准备实验数据集。Junhui高,Mengmeng马,Tingyan钟协助软件网站建设。建平Cai也帮助写论文。宜和李Guohui丁协助检索测试数据和修改。所有作者阅读和批准了期末论文。Baohong刘和晓燕唐同等贡献的第一作者。

确认

这项研究受到了中国国家基础研究计划(2010年2011 cb910204 2011 cb510102, cb529200),国家重点技术支持计划(2013 bai101b09)和国家重点科学仪器和设备Develeopment项目(2012 yq03026108)。

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