改进模型的稳定IgG3 DoE-Based评价的缓冲配方

文摘

制定适当的储存条件对生物制药的蛋白质是至关重要的,以确保其稳定性,从而他们的纯度,力量,和安全的保质期。使用一个模型小鼠IgG3产生在生物反应器系统中,多个配方成分在能源部设计优化系统地探讨一个具有挑战性的抗体形成坏的情况下的稳定性。抗体在每个缓冲区配方的稳定性评估UV / VIS吸收280 nm和410 nm)和大小排阻高效液相色谱(SEC)来确定整体的溶解度,乳白光,分别和聚合形成。乙酸在初步测试,消除潜在的存储缓冲区是由于显著可见沉淀的形成。一个额外的2⁴完整的阶乘能源部进行结合的稳定影响精氨酸和组氨酸的缓冲能力。从这个最后的能源部,200毫米精氨酸的优化配方,50毫米组氨酸,100毫米氯化钠的pH值6.5被大幅提高长期储存条件下稳定并经过多次冻结/解冻周期。因此,我们的数据突显出美国能源部的力量基础配方筛选方法甚至挑战性单克隆抗体分子。

1。介绍

生物技术产品的生产是一个复杂的物流过程,连接多个单元操作和经常导致进程内保持时间太长或大部分药物物质存储。识别适当的储存条件和优化生物制药蛋白质缓冲系统在确保这些产品的稳定性至关重要,因此保持纯洁,效能、安全性和疗效的药物物质在整个制造过程。一个典型的单克隆抗体的纯化方案包括蛋白质亲和色谱法其次是抛光色谱法和过滤步骤,最终产品的集中抗体在温和的酸性中性pH值的解决方案,在药物药物配方。选择合适的缓冲系统,减轻了物理和化学退化的单克隆抗体,尤其是一个最小化总和粒子的形成是一个重要的考虑下游fill-finish高效运营和长期稳定(1]。参数通常是研究包括溶液的pH值、缓冲系统,包含糖类、强壮剂,洗涤剂和其他辅料(2,3]。

监管指导规定,抗体用于人体测试大量释放和稳定性研究[4)为各种不同的产品属性,包括乳白光和降解产物如聚合、粒子,或沉淀的形成。这些不良的降解产物可能与免疫反应有关(5),在极端情况下可能导致重大损失单体内容或蛋白质不溶性,影响效力,和有效性,它是不可接受的使用在人类身上。

在这项研究中,我们使用一个单克隆抗体细胞培养系统,该系统是由杂种细胞技术,已经被一些学术组织评估制造业从细胞培养的不同方面制定原料药的物质(6- - - - - -10]。这个模型小鼠IgG3,而不是一个人源化抗体适用于临床使用,没有专用的纠葛,可以成功地用作生物反应器模型生产单克隆抗体。其生产系统之前适应无血清悬浮生物反应器所使用的文化和几组评估细胞培养生物过程在单一运行实验和实验设计(DoE)格式(11- - - - - -13]。我们后来发现其生物化学的某些方面制定严格的挑战模式发展。醋酸缓冲可以用于其他抗体(2),但似乎导致聚合和降水的情况下很难制定模型抗体。

经验与该抗体(数据未显示)表明,随着时间的推移形成可见的微粒浓度高于5毫克/毫升的程度明显的单体的种类随着时间的损失。聚合程度进一步加重冻结/解冻周期(数据没有显示)。虽然这种药物物质模型抗体已经足够稳定短期存储在50 mM精氨酸和100毫米氯化钠,pH值8.0之前使用药品冻干法研究[14),抗体所需的解决方案是长期稳定的模型质量评估和测试。此外,通过执行这个练习抗体与我们的模型,我们提出一个严格的测试用例来论证美国能源部的力量为液体抗体形成发展的方法。

为此,我们证明了能源部的力量基础研究快速确定合适的缓冲配方最大化这个抗体的稳定性。我们测试了四种不同的缓冲系统,选择拥有一个pH值范围的最适条件,同时也避免了抗体的等电点(pI)范围8.4 - -8.8。能源部方法使综合评价相关的配方参数会影响抗体的稳定性。

2。材料和方法

2.1。试剂

缓冲区是准备使用组件通常用来制定抗体:组氨酸(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)、氯化钠(BDH,二,PA),盐酸(费舍尔,Fairlawn, NJ)和L(+)精氨酸(记述有机物,沃尔瑟姆,MA)或Freebase精氨酸(费舍尔)。NuPAGE摩门教的样本缓冲区,NuPAGE还原剂,NuPAGE抗氧化和Novex锋利的标准,和拖把从英杰公司(CA)卡尔斯巴德。艳蓝g - 250、乙酸和丙胺得到费舍尔科学。除非特别指出,否则在文本中试剂中描述读et al。7]。

2.2。免疫球蛋白生产

暂停了小鼠杂交瘤细胞生产IgG3 /κ抗体(15110)是生长在一个7.5升Bioflo生物反应器(新布伦瑞克科学、爱迪生、新泽西)包含4升的媒体如读取所述et al。7]。抗体从阐明细胞培养液(CCF)被抓获,25毫升Prosep(微孔,Billerica MA)列上运行一个AKTA旅行车(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)和筛选了1米精氨酸pH值4.0 [16]。在其他的研究中,描述这种洗脱策略导致两座山峰,包含主要宿主细胞蛋白质早期峰值,随后峰值主要包含完整的抗体(13,16]。分数组成第二洗脱峰被紫外线测试证实蛋白质含量池之前,缓冲交换,下面的描述和分析方法。

2.3。初步的实验设计

初步探索三种常见缓冲系统是由一个2³完整的阶乘能源部中心点(表1)。经验与IgG3抗体用于这项研究显示,这是一个具有挑战性的模式从稳定性的角度来看,倾向沉淀(数据没有显示)。早期的尝试找到一个合适的单一物种缓冲体系(包括磷酸盐、三乙酸酯、组氨酸和柠檬酸)包括一系列在弱酸性或中性pH值未能产生一个系统乳白光,甚至总降水,并没有随着时间的积累。考虑到需要建立一个合适的缓冲系统,该模型抗体,我们发起了一个控制评价常用的单物种缓冲系统(醋酸、组氨酸、精氨酸)中所描述的表1。同时精氨酸在中性pH值范围有限的缓冲能力,它被选为轻微离液序列高的代理,据报道稳定抗体易于聚合(16]。以下全部!并评估每个缓冲区物种不同氯化钠,pH值远离抗体等电点,和缓冲物种浓度。统计设计、试验随机化和分析进行人民币10.0版本(SAS研究所Inc .卡里,NC)。

2.4。样品分析计划

缓冲交换1米精氨酸抗体稳定到测试单缓冲区物种形成缓冲区,3毫升的IgG3整除2毫克/毫升以上加载到10 kDa分子量截止Slide-A-Lyzer磁带(热科学,罗克福德,IL)。这是透析在测试制定缓冲一夜之间,相当于18000倍缓冲区交换。透析样本收集,重来确定postdialysis体积,和视觉检查总沉淀和乳白光的存在。监测长期稳定,证交会,蛋白质,和吸光度测量在280 nm(蛋白质含量)和410海里(乳白光)进行天0 (T在4°C(0), 30天T30),三个周期后冻结2小时(−80°C)和解冻(F / T) (37°C 10分钟)为精氨酸和组氨酸缓冲配方。其余9醋酸配方没有充分测试基于抗体的初步分析表明稳定性下降T0。

2.5。实验中2⁴完整的阶乘能源部

一个2⁴完整的阶乘精氨酸和组氨酸系统额外的16个缓冲配方。测试的文章他/参数(人力资源)能源部分析过程中所描述的表相同2。

2.6。UV / VIS (A280海里/ A410海里)分析

NanoDrop 2000 c与测试系统是被冷落的缓冲区之前测量吸光度的样品在280 nm和410 nm。样品没有离心机之前这些读数以免斜410海里吸光度占乳白光/可见的微粒。确保280纳米测量仪器的线性范围内,样品稀释10倍,然后再分析。任何显示一个样品一个410年阅读0.2或更高版本被认为是穷人的候选人进行进一步优化,并进一步分析都停产了。

2.7。证券交易委员会

分析规模大小排阻色谱(SEC)是执行TSKgel G3000SWxl列(Tosoh生物科学,格罗夫市哦)和安捷伦1200液相色谱系统。这些数据被用来确定与抗体样本总量的相对比例(7]。可见颗粒被删除前离心熔块的高效液相色谱分析,防止堵塞。

2.8。sds - page凝胶(减少和Nonreduced)

样本(200μL)离心机在17000×g创建可溶性(上层清液)和不可溶性(颗粒)分数。上层清液是恢复直接进行分析。颗粒是用相应的测试缓冲区之前制定resuspended 20μL无菌水。分数都是混合1:1与加载缓冲区(包含德勤减少样本)和举行70°C水浴10分钟。15μL(每个样本被加载到一个Novex NuPAGE (4 - 12%) Bis-Tris迷你凝胶(表达载体,卡尔斯巴德,CA)在拖把缓冲区。NuPAGE添加抗氧化剂是为了减少样本的上部缓冲室。电泳后,测试条带状模式比较Novex急剧作为分子量的参考标准。

凝胶都是固定用25%的醋酸溶液、10%丙醇在染色前至少20分钟0.006%艳蓝g - 250一夜之间在10%醋酸。使脱色是通过使用10%的醋酸,取代了前两次成像凝胶。

3所示。结果与讨论

3.1。初步能源部结果

随着时间的推移我们的模型IgG3抗体建立了制定严格的挑战模式发展。其氨基酸序列(基因库蛋白质序列ID AKH40268 AKH40269)建立它作为一个小鼠IgG3:κ与V_κ4和V_H1-S121地区。童军个人缓冲物种,IgG3抗体与变量制定氯化钠浓度和pH值范围和评估总抗体的稳定性。单缓冲物种配方是基于历史经验公式和已知的可接受的pH值范围。许多这样的配方作为候选人的基础上被淘汰T0分析表明降低溶解度和抗体的稳定性下降。吸光度在410海里(乳白光代孕)和证券交易委员会证明是敏感测量溶解度和抗体的稳定。这些数据指导2⁴完整的阶乘能源部基于组氨酸/精氨酸缓冲配方如下所述。

3.1.1。醋酸

所有醋酸缓冲配方显示可见小规模缓冲区交换过程中沉淀。这个观察是反映在一个较高的水平一个410年阅读加上一个下降一个280年。这种不同寻常的结果表明,醋酸抗体成为不溶性的配方取代了1米精氨酸在透析洗脱缓冲。这是验证在sds - page显示重和轻链的不溶性分数缓冲交换样品(图2)。所有醋酸配方给了一个410个读数大于0.5(图1(一)、表3),因此停止从进一步的研究。虽然不是一个常见的许多版本测试受雇于生产商,一个410年担任乳白光的测量。这个测试量化微粒迅速排除了不理想的配方。抗体对我们的模型,在大量反映在一个不溶性聚合物一个410年超过0.2允许我们我们的分析集中在物种更有前途的缓冲区。这个最初的沉淀后,抗体保持几乎100%单体,以秒来衡量,这表明组件容易成核沉淀完全,只留下单体。高百分比单体剩余不够有利大于乙酸溶解性的问题,因此没有进一步的测试之外T在这些配方0时间点进行。

3.1.2。精氨酸

正如所料,精氨酸提高溶解度。在T0,精氨酸缓冲配方显示最小乳白光,通常反映在低一个410的值。样品似乎分为两类,温和一个410约0.5和察觉一个410(图1(一))。的一个280保持稳定后30天内以及三冻结/解冻周期后证明抗体没有严重沉淀在某种程度上见过醋酸在制定。查看所有9配方,降低溶解度T30,相比T0,导致一些但不是全部最小乳白光配方。这些发现表明,精氨酸是赋予cytoprotective效应,就像看到当使冻干抗体在精氨酸的解决方案(17]。精氨酸缓冲配方总量百分比的增加比醋酸和组氨酸配方(图1 (b)、表3)来自较小的总量没有从样本中删除之前运行的高效液相色谱法。9配方的统计分析,我们发现精氨酸浓度增加抗体稳定最全面的积极的影响。我们使用此信息来创建一个额外的能源部缩小我们的关注更高浓度精氨酸结合不同的缓冲系统在一个更典型的pH值用于制定抗体。

3.1.3。组氨酸

总的来说,组氨酸缓冲系统显示更为极端一个410年与醋酸缓冲T0,这趋势了T30以及冻结/解冻过程后。乳白光随时间的增加来自抗体越来越不溶性,形成大骨料完全的解决方案,表明抗体后随着时间的推移越来越不稳定和冻结/解冻周期。这些聚集在sds - page(图中可以看到2)和被移除之前交会分析,导致0%的误导读出聚合(图1 (b))。此外,有更多的变化一个410条结果,低pH值的数据点通常乳白光较低(表3)。测试配方5和6均显示明显降低吸光度在410 nm相比其他缓冲区。这可能是由于高组氨酸(100毫米)和高盐(100毫米)。即使洗不溶性分数,组氨酸缓冲区的sds - page配方T0表明有大量的重型和轻型链缓冲区交换后的不溶性部分抗体(图2)。这些结果表明颗粒和沉淀形成药物物质而不是宿主细胞蛋白质或其它不溶性成分。一个410个读数为组氨酸配方是大于0.2和停止进一步的研究。

3.1.4。总结

组氨酸和醋酸单缓冲系统被淘汰在早期轮由于广泛的乳白光DoE试验件(见图1(一)和2)。精氨酸,即使在pH值接近抗体等电点,提供更好的结果相对于其他两个缓冲系统,稳定与更高的精氨酸浓度。这一观点认为,pH值不稳定并不是一个效果,但是精氨酸作为稳定剂。因此,我们进一步优化配方缓冲区保留精氨酸的假定的稳定作用,而将第二个参数,可以提供缓冲能力在pH值(6.25±0.25)充分低于报道抗体等电点(8.4 - -8.8),防止self-association [15]。组氨酸,即使在低浓度,将提供这种效应结合精氨酸。它进一步指出,氯化钠的稳定效果更明显的氯化钠浓度高时,在所有三个单缓冲系统。

3.2。第二轮能源部

如上所述在单一物种缓冲实验中,抗体表现出适度的趋势更好的溶解度较低的pH值,和精氨酸浓度更高。我们假设一个组氨酸和精氨酸(他/ Arg)能源部,pH值在一个远离抗体等电点,可能会进一步减少乳白光。在这种情况下,组氨酸将缓冲区的pH值低于π的抗体,而精氨酸促进增加溶解度和蛋白质完整由于离液序列高的效果。

统计分析后T0数据,我们发现有一个重要的缓冲精氨酸浓度的主要影响。低精氨酸值(100毫米)和更高水平的关联一个410吸光度,产品质量的不良暗示。此外,虽然不显著,但潜在的生物相关,精氨酸、组氨酸交互()和组氨酸浓度()明显比其余的更重要因素在考虑最小化的策略一个410吸光度。因此,通过调整组氨酸浓度,我们可以设计一个最佳缓冲区实现低乳白光同时最小化的目标精氨酸,这可能影响某些化验。溶解度的增加实现他/ Arg DoE允许我们选择最后一个缓冲制定200毫米精氨酸,50毫米组氨酸,100毫米氯化钠在pH值为6.5。

3.2.1之上。缓冲能源部冻融和稳定性

生物工艺通常发生在不同的药物物质和药物产品的设施。这种方法需要药物的物质,和在某些情况下进程内的材料,进行冻融允许航运之间遥远的网站。监管机构需要具体研究支持持有时间;这些可能包括航运研究设施和长期存储之间的材料如果不立即加工成药物产品4]。而冻结/解冻通常只执行一次运输期间药物物质和药物产品网站,制造商也可能研究多个冻结/消融对产品稳定性的影响来理解潜在的温度偏差带来的风险和意外的冻融。差缓冲配方的其他抗体接触到多个冻融循环已经被证明是容易聚合,subvisible粒子可以形成最终成核可见聚合(18]。该作用被假设导致不良产品免疫原性,虽然未知程度(19]。他们还可以进一步聚合成核在药品填充操作(20.]。因此,重要的是要评估药物物质稳定在多个冻融循环和长时间评估任何缓冲系统的适用性。

他/参数来评估我们的配方为cryoprotection属性和延长保存时间,我们前面描述的分析预制后30天内举行4°C,以及三个冻结/解冻周期。总的来说,我们发现一个410年一直在所有16缓冲配方更有利。的一个410所有的配方结合能源部低于0.2 AU(图5)随着时间的推移和冻结/解冻周期。不出意料,200毫米精氨酸减少的重要性一个410年继续从原始值T0,整个T30和冻融的研究。这也反映在一个显著降低聚合(图百分比3(一个))。然而,精氨酸的重要性:组氨酸交互变得明显,具有统计学意义(,R²= 0.97,,R²= 0.96,resp)(图4)。远低于这个值一个410仅通过组氨酸配方,在精氨酸配方(图30天的稳定1(一))。

我们也评估抗体冻结/解冻的稳定性。三个冻融循环后,精氨酸和arginine-histidine交互是统计学意义(,R²= 0.96)(数据3 (b)和4 (b))。组氨酸曾被证明能降低马伯聚合以浓度依赖方式下冻结/解冻条件。我们的结果的最优组氨酸浓度的50 mM配合陈等人,他们的观察发现,60毫米组氨酸显示最少的总量冻结/解冻[3周期后21]。经常看到,赋形剂结合,赋予抗体的保护作用可能没有必要增加(22]。美国能源部的格式我们的研究让我们全面评估我们选择的缓冲物种的相互作用。

总的来说,我们的观察表明,双缓冲系统是提高健壮性和溶解度的抗体持续时间。一个参数:他的相互作用似乎允许精氨酸浓度较低,如果其他辅料精心平衡。最后缓冲选择所带来的短期存储足够的溶解度特性允许额外的这种抗体的研究。这是重要的其他研究,取决于其稳定性足够长的时间来执行生物化学和物理化学分析。

4所示。结论

作为一个单独的组件在一个更大的生产过程,大部分蛋白质配方的选择是一个关键的步骤,抗体的发展。正确的选择策略的选择可以有效地通知,确保最好的缓冲将作出选择,使药品生产过程的鲁棒性和最终产品的稳定性。组织和领导方法可以确定如果一个生物候选人的差异有一个未来的临床或商业用途。很明显,短期、长期和冻结/解冻稳定这一决定的关键因素,是物流限制和运输需求是不可避免的一部分生物技术生产格局。我们这里,甚至难以形成抗体的稳定性可以通过小心,大大改善了DoE-informed缓冲物种的选择和pH值以及控制包含稳定离液序列高的代理。我们还证明,避免直接重叠抗体等电点可以最小化乳白光和降水。

突出了

(我)我们用4对测试43缓冲IgG3配方的稳定性模型。(2)精氨酸增加了溶解度模型的抗体。(3)结合2缓冲系统、精氨酸和组氨酸,增加稳定性。(iv)pH值的变化是一个关键属性影响溶解度的抗体。

免责声明

本文研究结果和结论没有被美国食品和药物管理局正式传播,不应被解释为代表任何机构或政策的决心。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者承认CDER的关键路径的倡议,批准号1500年,对这个项目的支持。这个项目的部分支持由一个约会的研究参与生物技术产品的项目在CDER /办公室,美国食品和药物管理局,由橡树岭科学与教育研究所通过跨部门协议在美国能源部和FDA之间。作者还想承认Juhong刘和奥黛丽贾仔细准备的评论。

补充材料

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