当前和新方法在GMO检测:挑战和解决方案

文摘

在许多国家,转基因生物(GMO)立法建立了为了保证市场上食品/饲料产品的可追溯性和保护消费者的选择自由。因此,一些转基因检测策略,主要是基于DNA,开发实现这些立法。由于其众多的优点,定量PCR (qPCR)是首选的方法实施在GMO常规分析实验室。然而,鉴于越来越多和转基因生物的多样性发展,把世界各地的市场上,一些技术障碍可能遇到qPCR技术,主要是由于其固有的特性。解决这些挑战,替代转基因检测方法已经开发出来,允许更快的检测单通用目标(例如,loop-mediated等温扩增),同时检测多个通用目标(如PCR毛细管凝胶电泳、微阵列和Luminex),更精确的量化通用目标(例如,数字PCR),或描述的部分(例如,步行和下一代DNA测序(上天))或未知的(例如,挥动)转基因生物。这些方法的优缺点进行了综述。

1。介绍

目的是提高农业实践和营养品质,植物育种技术已经开发生产转基因(GM)作物表达有趣的特征,如除草剂耐性,抗虫性和非生物压力电阻(1]。为此,创建自己的遗传物质的新组合通过使用现代生物技术(2]。第一个转基因生物体(GMO)批准商业化是Flavr-Savr番茄在1994年。从那时起,1.815亿公顷的种植转基因作物在28个国家报告了2014年1]。鉴于“知情权”消费者,转基因标签政策在一些国家建立了世界各地不同阈值的公差在0到5%之间。因此,转基因的食品/饲料链是由主管部门(3]。保证GMO的可追溯性,一个关键因素在这些法规的实施,一些策略,分为间接(蛋白质方法)或直接(基于dna的方法),开发了检测转基因食品/饲料样品中通过使用不同的技术。蛋白质的方法中,目标蛋白质编码的转基因,几种方法依赖于酶联免疫吸附试验(ELISA)方法(表1)[4- - - - - -21]。一个可移植的免疫测定系统也提出了(表1)[22]。作为替代,immuno-PCR方法被用来确定GMO(表1)[23,24]。

此外,蛋白质的方法包括使用质量spectrometry-based技术作为一种工具允许描述转基因作物(25]。然而,尽管他们目前的几个优点,如速度和简单性,蛋白质的方法取决于目标蛋白质的表达水平,这是变量根据植物组织和植物发育状态。此外,蛋白质是由食品加工高度退化或变性。任何修改的目标蛋白质可能确实改变试验的特异性和敏感性。此外,这种策略不适用,如果基因修饰在蛋白质水平没有影响(26,27]。为了克服这些问题,许多基于dna的方法,针对直接转基因整合序列,广泛发展。即使定量PCR (qPCR)在GMO常规分析方法的选择,其固有的PCR属性意味着一些限制。因此,为了应对这些挑战,一些替代方法已经被开发出来,允许特别是提供更快的检测的通用目标单独放大在常规实验室和领域(例如,loop-mediated等温扩增(灯)),同时检测的几个通用的目标(例如,PCR毛细管凝胶电泳(CGE),微阵列,和Luminex),通用汽车的更精确的量化目标(例如,数字PCR (dPCR)),或描述的部分(例如,步行和下一代DNA测序(上天))或未知的(例如,挥动)GMO(图1)。这些dna的方法和他们的目标是本文中描述。此外,最宜采用的这些方法讨论了根据采用的策略GMO检测以及可用的关于转基因测试序列的信息。

2。转基因检测方法

2.1。qPCR技术

qPCR系统,这是最常见的策略,允许检测,识别,量化GMO通过SYBR绿色或TaqMan化学(图1)[28]。使用一对引物特定目标,这些qPCR化学反应都是基于PCR扩增实时记录与不对称的花青染料的荧光是绑定到双链DNA (SYBR绿色)或fluorogenic探测特定于目标序列(TaqMan) [29日]。这种技术适用于未加工和加工食品/饲料扩增子约100个基点以来矩阵通常放大。即使许多qPCR方法已报告,三个主要步骤通常是跟随在GMO常规分析(30.]。首先,转基因生物的潜在的存在是通过筛选评估方法针对最常见的转基因生物中发现转基因元素,如p35区域(35 s启动子从花椰菜花叶病毒)和tno(胭脂氨酸合成酶终结者根癌土壤杆菌)。此外,一些标志更多的歧视,如Cry3Bb gat-tpinII,和t35S pCAMBIA, taxon-specific标记也可以使用。这个步骤允许建立一个列表的潜在GMO在测试样本和防止进一步后续步骤(表中不必要的化验2)[28,30.- - - - - -34]。几个这些筛选标记验证,基于最低性能要求,在欧盟层面以下环试验和包含在参考纲要GMO分析方法(35]。根据观察到的积极的和消极的信号不同的筛选标记测试,通用事件可能会发现在第二步确定使用construct-specific或徽章标记定位,分别转基因盒内的两个元素之间的连接或转基因磁带和植物基因组之间的连接。为了正确区分每个通用事件,事件相关标记目前支持自独特的转基因整合网站目标。最后,确定转基因事件的数量在确定食品/饲料样品进行测试。使用徽章和taxon-specific标记,这个量化的步骤进行副本的数量的基础上属于转基因和单子叶植物(表2)[30.]。所有方法用于确定EU-authorized转基因生物和转基因的授权是等待还是受到撤回在低水平的情况下存在(LLP)由申请人和报告提供参考纲要的转基因生物分析方法(35]。在结合几个taxon-specific、徽章和construct-specific TaqMan标记以96 - prespotted板,基于实时PCR现成的多目标分析系统开发,允许同时识别39通用事件(36]。

尽管它的灵活性,简单、快速、高灵敏度分析,特别是对探测低量的通用目标至关重要,然而qPCR战略的成功取决于一些因素。例如,qPCR策略的吞吐量通常局限于一个标记反应。由于越来越多的转基因,额外的标记已经不断地开发和使用完全掩盖自己的检测,从而使实验室的工作和结果的分析非常复杂和艰苦的32]。此外,这种先验的方法目标唯一已知的序列。因此,保证只有负面信号没有已知的转基因食品/饲料样品进行测试。同样,在原因不明的信号,换句话说,积极的和消极的信号的获取,没有发现符合已知的通用事件,未知转基因只能怀疑的存在。事实上,转基因生物的检测qPCR特别是基于转基因元素源于自然生物,如从CaMV和tno p35区域农杆菌属。仅仅出于这个原因,qPCR系统提供了一个间接的证明转基因食品/饲料中矩阵的存在,因为它只能证实了转基因的序列侧翼地区。关于量化步骤,它的成就取决于认证参考资料的可用性(CRM) (30.,33,125年]。最后,抑制剂的存在,如多糖、多酚、果胶、木聚糖,或者脂肪,可以改变PCR反应的效率。因此,后来qPCR比理论上预期将观察到的信号,诱导一个低估甚至隐瞒转基因生物的数量出现在测试样本(126年- - - - - -128年]。

2.1.1。qPCR分析工具

为了方便的解释结果,通过分析快速和有成本效益的系统开发工具集成同时几个目标。为此,CoSYPS平台(组合SYBR绿色qPCR筛选),这是一个决策支持系统(DSS)在筛选级别,已经成功开发了。对于每个测试食品/饲料矩阵,这立即DSS结合实验和二十SYBR绿色方法得到的值,运行在一个96孔板和目标植物基因,分类的基因,转基因元素(表2)。这个选择筛选标记允许至少覆盖所有EU-authorized GMO和LLP)的情况下(例如,p35区域和tno),尽可能区分自己和一些EU-unauthorized GMO(例如,t35S pCAMBIA和gat-tpinII)为了减少识别/量化进行下游[30.,33,34,129年]。另一种解释qPCR GMOseek和GMOfinder数据库,提供的结果是包含在GMO的可靠信息。获得的实验结果的解释后,欧盟内部或参考方法,介绍了积极的元素的名称在数据库提供的列表可能检测到转基因,然后通过实验验证(130年,131年]。这些预测的真实性是然而减少由于元素名称相同的可以拥有不同的序列和不考虑使用的检测方法。事实上,针对相同的元素,几种方法可能存在和可能存在不同的聚合酶链反应效率可能产生的变化结果。最近,JRC-GMO-Matrix平台,结合信息从GMOMETHODS数据库(所有参考方法为GMO分析)和核心DNA序列信息系统(几个标注转基因序列),也提出了相同的目的。这个平台整合了正面和负面的信号与欧盟验证taxon-specific实验观察到,特定于元素,construct-specific和相关方法对任何测试食品/饲料矩阵为了更可靠地预测潜在的放大通用事件(28]。JRC-GMO-Matrix平台也加强了联合研究中心的GMO-Amplicons数据库包含公开可用的假定的GMO-related序列(132年]。

2.1.2。多路复用qPCR策略

多重pcr方法,一些DNA能被探测到的目标在一个反应。它介绍了反应的优势减少必要的测试潜在的转基因生物样品中存在。几个多路复用qPCR TaqMan策略也因此受到调查,包括主要筛选标记p35区域和tno(表3)[38,41,43- - - - - -49]。为系统提供高GMO报道,23三缸和一个复式PCR聚集在384孔板来确定47个目标(表3)[42]。

然而,单工qPCR相比,最优多元分析可能是更具挑战性的发展尤其是在引物和探针设计以及灵敏度和重现性。此外,这种策略的吞吐量是相对有限的可用性染料的发射和吸收光谱荧光足够明显的避免重叠的信号。不同染料的组合风险也增加荧光背景。因此,大多数的报道多路复用qPCR化验放大同时只有两个或三个目标。迄今为止,最多6个标记已经成功地结合在一个反应检测GMO (35,49]。

2.2。选择多元化战略

仍然,目的是进一步发展的多元分析,几种方法不是基于qPCR也使用尤其是CGE开发,微阵列,Luminex技术。一般遵循两个主要步骤。首先,保证足够的灵敏度,样品都放大了PCR自通用目标可能在食品/饲料矩阵跟踪级别。在第二个步骤中,使用CGE PCR产品分析,微阵列或Luminex平台。尽管这些技术提出了更高的吞吐量比qPCR复用水平仍然是影响PCR的固有属性限制反应的数量一般在10目标/ PCR试验(133年,134年]。

2.2.1。PCR毛细管凝胶电泳技术

为了同时检测多个目标,利用PCR复合CGE,在荧光标记引物,允许歧视不同的扩增子相同大小的,一直还建议GMO检测领域的应用(图1和表4)。电泳凝胶相比,该决议的力量CGE系统检测PCR产品从多元分析显然是更高的134年]。然而,CGE系统的敏感性低于qPCR技术(135年]。使用PCR CGE系统,确定了八个转基因玉米通过nonaplex PCR包括专题、construct-specific, taxon-specific方法(表4)[57,58]。同样,一个pentaplex PCR和两个hexaplex PCR也发达,分别检测具体四个转基因玉米,五个转基因棉花,五个转基因玉米(表4)[52- - - - - -55]。最近,一位tetraplex针对转基因元素和cotton-specific基因(表也报道了4)[51]。此外,郭et al ., 2011年开发使用普遍尾随三octaplex PCR引物preamplify通用目标下短周期的数量。增加产量和PCR效率,这些扩增子,早些时候提交PCR乳液,富含通用引物。通过这种方式,从十四24目标通用事件被CGE系统(表确定4)[56]。这种技术的变种,这意味着没有荧光标签引物,是由博瑞尔et al ., 2011。本研究提出了一个tetraplex组成两种特异的PCR方法和两个筛选标记允许检测的存在使用商业化Bt11玉米和大豆GTS40-3-2事件电泳仪器(表4)[50]。

2.2.2。微阵列技术

微阵列技术应用于转基因生物检测、通用目标由PCR扩增,通过有针对性的和/或通用引物,在杂化数组之前,允许同时检测250多000目标分析(图1和表5)[136年]。qPCR相比,微阵列策略提出了这样一个更高的吞吐量但略弱敏感性[133年,137年]。DNA制成的的一种方法,称为多路复用定量PCR (MQDA-PCR),测试转基因玉米事件,包括第一次使用有针对性的引物PCR港通用尾巴允许在第二个使用通用引物PCR。然后信号被检测PCR杂交后的产品与DNA的荧光标记的探针阵列(表5)[63年]。此外,使用挂锁探针ligation-microarray检测系统(PPLMD),一些转基因玉米、棉花和大豆事件被检测到。PPLMD系统,目标是最初杂化线性挂锁探针窝藏有针对性和通用序列然后放大用通用引物PCR(表5)[64年]。此外,基于核酸序列的扩增微阵列(奈玛)方法实现,使用通用引物,测试在转基因玉米(表5)[62年,137年]。作为替代的潜在问题与荧光标签的使用,DualChip GMO系统提出了。与生物素化的有针对性的引物PCR扩增后,扩增子杂化的数组是由比色检测的反应,同时允许识别一些转基因玉米、大豆和油菜籽事件。DualChip GMO的性能系统,针对14元素,也是通过欧盟合作环试验进行验证。这个系统的升级版本(DualChip GMO V2.0)提出了一个更高的GMO覆盖率目标三十元素(表5)[59- - - - - -61年,133年,138年]。最近,一个多路复用与读出放大芯片低聚糖微阵列(宏观)系统,针对九十一年的目标覆盖广泛的转基因生物,也报道(139年]。

2.2.3。Luminex技术

生物素化的目标放大由单一或多重PCR分析可以分析Luminex技术,可能能够同时检测500不同的目标在一个示例使用独立的幽灵似地截然不同的珠子与独特的核酸探针。杂交后的生物素化的寡核苷酸相应probe-bead复合物,读者设备分别分析每个微球通过流式细胞术应用激光激发635 nm和532 nm)允许,分别确定珠设置和确定目标(图的存在与否1)[140年]。这项技术是首先在GMO检测评估Fantozzi et al ., 2008(表6)。在这项研究中,p35区域和EPSPS元素,早些时候单独放大的PCR GTS-40-3-2大豆事件,同时检测(65年]。之后,通用汽车堆叠LS28×Cry1Ac大米和281-24-236×281-24-236棉事件被确定在Luminex平台上使用上游,分别pentaplex PCR或hexaplex PCR(表6)[67年,68年]。这项技术也被用于检测十转基因玉米事件通过四套复合PCR检测(表6)[66年]。同样,液珠阵列方法允许识别13个转基因玉米是最近开发的141年]。

由于其潜在的高吞吐量,Luminex技术似乎是一个不错的选择在GMO检测。此外,液珠阵列被认为是更敏感和速度比微阵列系统67年]。然而,缺点与PCR复杂的设置一个独特的多路同时分析针对所有通用事件。此外,只有少数研究使用这种技术在转基因检测报告到目前为止,实验还为了提供有效的进行和验证系统。

2.3。数字PCR技术

解决困难期间观察qPCR相对量化的一步,尤其是当转基因的拷贝数低和/或PCR抑制剂存在,数字PCR (dPCR)技术已经在GMO检测(图进行测试1)。基于二项式泊松统计,每个分区分级确定样本的正面(放大目标观测)或负面(dPCR没有放大目标观察)技术允许绝对量化目标核酸的数量从转基因生物存在于任何给定的样本。两种方法的端点PCR系统目前被用于这个目的(表7)。一方面,美国商会dPCR (cdPCR),分区样例在几个成千上万的微流控室,用于目标转基因玉米MON810事件使用组成的复式PCR MON810徽章和玉米taxon-specific方法。这种方法的检测极限也调查(72年- - - - - -74年]。此外,一个策略基于cdPCR系统是为了覆盖广泛的开发转基因通过应用单独28特定于元素,36个专题,5 taxon-specific方法(表7)[69年]。之后,这种策略应用与48标记,包括7名转基因因素特定14徽章,和五个taxon-specific方法(表7)[70年]。另一方面,液滴dPCR (ddPCR)方法,这意味着数千油水乳化液滴的生成,用于单工或复式PCR MON810徽章和玉米taxon-specific方法(71年]。最近,双化验,包括一个GMO-specific标记与一个大豆、玉米、或大米taxon-specific标记,使用ddPCR进行系统量化十二转基因大豆,十六个转基因玉米和两个转基因水稻的事件(表7)[48,75年]。

dPCR技术可能成为GMO检测领域的一个关键工具,主要是因为绝对的,而不是相对qPCR,通用的量化目标。测量不需要一定参考材料的使用,解决相关问题的最佳参考资料的可用性。此外,由于样品的分区,PCR效率影响较小的抑制剂,并允许减少测量的不确定性,特别是在低拷贝数,随着观察qPCR校准曲线生成的连续稀释的目标。然而,验证qPCR方法并不总是简单地转移到dPCR技术。事实上,一些优化进行有关,例如,设计引物和探针的浓度。此外,考虑到最大的两个不同的目标可以确定在一个好,低吞吐量的力量dPCR技术突出了其适用性更适合识别/量化级别比筛选步骤(48,71年,75年,142年]。

2.4。Loop-Mediated等温扩增

由于其快速、特异性、敏感性和简单,loop-mediated等温扩增(灯)方法提出了检测转基因(图1)。为此,4个引物特定于不同的六个区域的目标要求,允许,在等温条件下,初始反应扩增速度也增加了一个循环结构的形成。然后放大可以直接管由于荧光染料的可视化。几个灯标记从而为这种方法开发的目标转基因元素(表8)[76年- - - - - -91年,143年]。

灯的策略提出了优势容忍一些PCR抑制剂如酸性多糖(84年]。它的实现也不需要任何诡辩设备。事实上,放大可以使用水浴或加热块(90年]。一些发达灯的方法除了已经成功测试了在田地里(84年]。关于缺点,4引物的设计目标,保证高特异性和敏感性的灯,可能是困难的。此外,一些通用的识别目标使用多路复用分析不适用(28]。

2.5。DNA走

用pcr方法需要先验知识,观察到的结果大多是针对生成的元素来源于自然生物。因此,他们仅仅构成的间接证明存在的转基因食品/饲料矩阵进行测试。此外,当观察到的信号不对应于已知GMO未知转基因生物的存在,至少包含一个已知的元素,只能是怀疑。不容置疑地证实转基因生物的存在的唯一方法是由序列的特征从转基因磁带和植物基因组之间的连接以及转基因元素的不自然的联想。

这个至关重要的信息,一些策略的DNA走路,也称为基因组走路,已报告(图1和表9)。更准确地说,这个分子技术允许识别未知的核苷酸序列相邻的已知在任何给定的基因组DNA区域使用特定的引物对引物由已知序列结合DNA的方法。然后,最后PCR产品通常由桑格测序技术是最终分析可用的数据库(例如,NCBI和联合研究中心的GMO-Amplicons)。经典,三个主要类别的DNA行走,基于他们的第一步的特点144年]。

首先,restriction-based基因组DNA的方法涉及消化使用合适的限制性内切酶针对网站感兴趣的序列,如已知和未知之间的连接序列。获得的限制性片段然后self-circularized或结扎DNA磁带,命名,分别inverted-PCR和盒式PCR方法([144年)和引用)。通过这种方式,一些转基因序列侧翼地区从转基因和非自然协会拟南芥、烟草、大葱、土豆、大麦、柚子、西红柿、香蕉、棉花(MON1445)、油菜(包括GT73),大豆(GTS40-3-2和MON89788)、小麦(B73-6-1、B72-8-11和B72-8-11b)、水稻(包括TC-19、Bt汕优63 (TT51-1) KeFeng-6,和KeFeng-8),和玉米(慢性乙肝- 351,Bt176、GA21 Bt11, MON88017, MON863×NK603, MON863×NK603×MON810, T25, MON810, NK603, MON863, T25, das - 59122 - 7, LY038,和3272年)的特征(表9)[92年- - - - - -108年,145年- - - - - -168年]。

第二,延伸方法定义的扩展sequence-specific底漆。结果DNA单链DNA随后绑定到磁带或3′尾矿([144年)和引用)。这种策略被成功应用于转基因玉米(MON810),米饭(LLRICE62),大豆(A2704-12),油菜籽(T45)和棉花(LLCOTTON25)事件来描述他们的转基因磁带和转基因侧翼区域(表9)[109年,110年]。

第三,primer-based方法结合组合(随机和/或退化)引物根据各种有针对性的引物PCR([策略144年)和引用)。转基因拟南芥、烟草、马铃薯、大麦、苹果、香蕉、大豆、小麦(B73-6-1),米饭(包括KeFeng-6和KMD1)和玉米(包括MON863和MIR162)从而确定通过转基因的序列侧翼地区和自然元素(表的关联9)[111年- - - - - -116年,152年,154年,157年,169年- - - - - -174年]。

然而,大多数这些DNA行走方法的实现由执行实验室提出了一些困难如特异性不足,敏感性,或收益。此外,其中一些使用费力,复杂和冗长的技术(例如,通过毛细管电泳指纹图谱和基因组DNA库通过(预测)限制性内切酶)。因此,DNA行走的方法,相应的更好实施实验室的需要,开发和验证未加工和加工食品矩阵含有微量转基因目标。这个DNA方法意味着两个seminested PCR轮行走,特异性的产量和通用目标是增加,尤其是关键的低水平转基因生物的存在。这种方法,属于pcr方法类别,也被完全整合到转基因的优点常规分析的类似的引物用于qPCR筛查(GMO检测潜在的存在)和DNA走(转基因标识)。这简单而快速的方法可以很容易地应用到执行实验室,没有任何重大的额外成本和设备,确认信号之前获得qPCR(表9)[33,117年,118年]。

自DNA步行需要较少的先验知识感兴趣的序列比常规pcr方法之前,转基因与完全或部分已知的序列特征。等关键元素,因此,在针对p35区域和tno高度频繁在转基因作物,广泛的转基因生物可能特征(96年,106年,110年,111年,113年,118年,156年]。为了特别是欧盟,识别非法转基因DNA走路的方法使用引物特定元素t35S pCAMBIA向量,大约有30%的转基因植物中发现了(33,117年]。然而,DNA行走策略并不适合转基因只包含未知元素。

2.6。下一代测序技术

尽管他们更高的吞吐量和qPCR相比,上述多路复用策略需要先验知识至少转基因序列的一部分。一旦这些序列信息收集、方法的发展,每一个目标点感兴趣的一个序列,在个案基础上进行。然后,公正的多路复用的优化分析提供平等的分析性能相比单纯形化验仍然艰苦的和复杂的。此外,转基因生物的检测问题不含已知序列仍然没有解决。最近,门店,允许大规模并行DNA测序,建议来应对这些挑战。捷技术显然优于经典的桑格测序速度和吞吐量。事实上,门店提供强大的高通量序列的可能性同时许多不同的样本,可分别的使用范围广泛的条形码(116年,124年,175年]。两个主要策略,早期富含序列的测序样品感兴趣(有针对性的测序方法)(全基因组测序(WGS)方法),存在(图1和表10)。

2.6.1。有针对性的测序

目标感兴趣的目标区域测序策略是特别有益,从大型和复杂的基因组,发现在大多数的植物。即使最小的先验知识序列需要目标感兴趣的序列,它介绍了优势使用专门的所有能量,在时间和成本方面,对感兴趣的区域。这个策略,两个substrategies可用,包括PCR产物测序DNA的图书馆(扩增子测序)或选择从全基因组DNA片段库(目标浓缩测序)(图1)。

一方面,兴趣的扩增子测序允许描述DNA片段以前丰富了PCR,这种排序方法因此显然取决于PCR策略采用上游以及其固有的特性和性能。为了检测转基因,歌et al ., 2014年通过PCR扩增子生成的,使用针对玉米单子叶植物基因的引物,Bt11基因,Bt176基因大豆单子叶植物基因,35 s / CTP4构造,CP4-EPSPS元素,p35区域启动子,和tno终结者,从样本包含少量的通用目标(Bt176玉米Bt11玉米的1%,2%,2%的GTS40-3-2大豆、GTS40-3-2大豆的1%,GTS40-3-2大豆的0.1%,或0.01% GTS40-3-2大豆)。然后,每种单独的扩增子测序上使用454系统的一种变体,称为焦磷酸测序便携式photodiode-based生物发光更敏感的音序器,紧凑,有成本效益的原454年相比技术(罗氏)(表10)[119年,176年]。这种方法比较类似于PCR筛选提供额外的价值,而不是积极的还是消极的信号,放大的序列片段,这是更可靠的证明转基因生物的存在。这种方法相反,梁et al ., 2014年)显示一个扩增子测序策略允许分析转基因只是部分已知的序列信息。为此,DNA行走(SiteFinding PCR)方法,针对vip3Aa20序列,耦合到门店的技术,使用Illumina公司或太平洋生物科学平台,描述MIR162玉米事件(表的序列10)。即使结果是使用两个不同的门店平台类似,PacBio系统显示的优势序列DNA片段大小达到40 Kbp处理DNA片段大小不同。因此,PacBio系统Illumina公司技术相比,可以在许多情况下避免新创组装步骤的剪切基因组DNA并不总是必需的。此外,挥动的桑格技术允许的使用大大增加了吞吐量的DNA走路的方法。事实上,为了保证整个GMO在测试样本的代表性,所有观察到的扩增子应该被分析。然而,潜在的大量扩增子的净化切除从电泳凝胶和随后Sanger测序可能比较麻烦,尤其是在食品/饲料的矩阵包含几个GMO分享共同的目标元素(116年,118年,177年]。

另一方面,目标浓缩测序方法涉及到的选择感兴趣的序列从整个基因组DNA库。捕捉它们,可以用适当的杂交方法依赖于磁珠或微阵列与特定的探测。杂交步骤的效率因此这个测序策略的关键。DNA片段包含完全或部分已知的地区可以进行排序。然而,即使这种策略被应用于不同的植物,没有研究到目前为止已经报告给我们的知识检测转基因(178年- - - - - -181年]。

分析preenriched DNA片段的兴趣与门店技术允许证明转基因生物的存在特征序列完全或部分预先知道。然而,鉴于其相对成本较高,预计将减少时间,前提生物信息学专业,目标总会策略不合理是目前通常适用于所有食品/饲料由执行矩阵实验室(116年,124年,175年]。

2.6.2。全基因组测序

原则上WGS策略允许描述样本没有任何先验知识(图1)。DNA测序策略,整个图书馆,包括剪切基因组DNA适配器的结扎,测序。生成的读取然后对待转基因生物信息学工具基于先验知识的测试。

首先,当没有转基因磁带信息可用,其转基因插入和侧翼区域分析识别的所有推断叠连群源自读取的部分匹配或无与伦比的内生植物物种基因组参考(123年]。这个WGS策略应用于LLRICE62事件通过使用可用的参考基因组栽培稻ssp。粳稻。结果与来自开发人员的信息档案,GMO的描述一个未知使用门店因此表明(表插入10)[122年]。同样,本文分别从地区通用亚麻FP967事件和转基因水稻TT51-1 T1c-19事件也为特征(表10)[121年,123年]。这一战略的成功因此与参考基因组特定品种的可用性和生物。如果没有参考基因组,新创的策略大会,比较所有生成的读取找到重叠,必须应用。然而,这仍然是相当繁琐的庞大而复杂的植物基因组特别是倍性而言,重复区域,杂合性和不同的转基因的混合物(120年,182年]。促进即便如此新创大会,不同的门店平台可以关联的强度。例如,短读从Illumina公司技术可以对齐到长读PacBio生成的技术,组成一个替代的参考基因组(183年]。

第二,条件是至少一个转基因元素的序列是已知的,插入与读取新创组装匹配和无与伦比的转基因DNA序列库包含常用的转基因元素。这种方法测试的转基因大米TT51-1和T1c-19事件(表10)[123年]。

第三,如果插入的序列是已知的,两种类型的生物信息学分析报告。一方面,读取相应的参考基因组不完全,映射到转基因盒式序列以确定插入的数量及其转基因侧翼地区。通过这种方式,转基因水稻TT51-1 T1c-19事件和转基因大豆MON17903 MON87704事件描述(表10)[120年,123年]。另一方面,Willems et al ., 2016开发了一个分析工作流程,包括三种不同的方法。检测方法,包括比较阅读的参考序列插入,允许检测转基因生物的存在在一个给定的样本。证实转基因盒式的集成,并提供一个粗略的定位的侧翼区域,然后比较匹配的读取宿主基因组参考序列的证明方法。通过同时调整这些选择读取宿主基因组和转基因磁带,识别确定精确的定位方法允许转基因磁带和侧翼序列的区域。这种WGS策略最初评估纯转基因转基因水稻转基因水稻(100%)。上面描述的所有其他WGS策略相反,食品/饲料矩阵更容易遇到在GMO常规分析,如转基因和非转基因大米混合(Bt稻米10%)和处理转基因水稻Bt面条(100%),也被测试(表10)[124年]。在这项研究中,统计框架中,预测概率来检测一个序列来自转基因磁带和验证实验数据来自WGS,也是开发的估计在网上阅读的数量,源自Illumina公司HiSeq设备,需要经常遇到GMO的特点。结果表明,样品由转基因生物为100%,除了拥有一个巨大的转基因小麦基因组,可能是明智的特点在一个标准的价格区间。不配合、检测和鉴定转基因出席跟踪等级不合理可行的WGS [124年]。因此,目前,只有前面描述的有针对性的测序方法可以应用于通用混合物GMO在微量水平的原因。

捷技术是这样一个有前途的替代在GMO检测领域提供可能性证明简单的食品/饲料中转基因的存在通过序列的特征矩阵。此外,序列来自未知转基因可以设计新的PCR标记。然而,上天在GMO的实现仍然执行实验室常规分析的困难由于其相对高成本以及足够的计算机基础设施的要求和合格的生物信息学分析人士来处理生成的数据116年,124年,175年]。

3所示。结论

在常规分析转基因品种,qPCR仍然执行实验室的首选方法。然而,正如一些技术障碍可能遇到使用这种技术,替代转基因检测方法已经开发提高其中的一些挑战。为了利用最好的上述描述的性能策略,其适用性可以考虑根据采用的GMO检测以及战略信息可用的测试序列GMO(图1)。完全GMO特征,基于常规PCR方法是绝对适合迅速发现单独通用目标low-prized(灯),同时检测多个通用目标(CGE、微阵列和Luminex)或精确量化的通用目标没有抑制剂(dPCR)的影响。然而,当测试矩阵只包含转基因生物的序列是已知的一部分,这些策略可能产生原因不明信号的观察到积极的信号不能与已知的通用事件有关。针对关键的DNA序列,如元素p35区域和tno经常发现在转基因作物,使用步行或有针对性的测序DNA浓缩策略允许不容置疑地证实转基因通过转基因侧翼序列的存在区域和不自然的关联的遗传元素。如果没有信息是可用的,在这一刻,只有GMO的WGS可以想象”来形容这一类。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

产生这些结果的研究的是由比利时联邦公共服务健康、食物链安全和环境通过接触UGMMONITOR公约(RF) 11/6242。

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