Biodistribution和SPECT成像的研究^99米Tc标签是裸小鼠移植瘤模型肽在人类HepG2肝癌

文摘

包含Asn-Gly-Arg肽(是)序列合成和直接贴上。放射化学特征、biodistribution裸小鼠移植瘤模型和SPECT成像评估人类HepG2肝癌。裸小鼠轴承HepG2被随机分成5组,每组5只老鼠和注射~ 7.4兆贝可。SPECT图像中获得1、4、8和12 h接受通过尾静脉。主要器官的代谢示踪剂决心在不同的时间点,它演示了快速、显著的肿瘤吸收和减缓肿瘤冲刷。对照组小鼠被coinjecting未标记的是(20毫克/公斤)。肿瘤吸收()ID / g (1 h,吸收最高的(在8 h) ID / g。相比之下,阻塞的摄入控制集团(注射后)ID / g (1 h。SPECT静态图像和肿瘤/肌肉(T / NT)值。T / NT值最高8 h。异种移植肿瘤变得可见1 h和肿瘤的最清晰的图像观察8 h。总之,可以有效地准备和它表现出好的属性潜在的肿瘤SPECT显像剂。

1。介绍

血管生成肿瘤血管肿瘤生长和转移的重要元素,metalloexopeptidase CD13 /氨基肽酶N (APN)在肿瘤血管生成中起着至关重要的作用。肽包含的是显示高的效率目标细胞,组织,和新船CD13受体超表达(1,2]。此外,在组织接受血管生成,血管也导引和过表达和内皮细胞的增殖是众所周知的一个重要因素在肿瘤血管生成3,4]。证明是可以结合新血管氨基肽酶N (CD13)和整合素αvβ3,虽然绑定机制是不同的。同时,CD13受体介导肿瘤脉管系统绑定是具体的而不是其他CD13丰富的组织,由体内研究证明(5]。好血间隙被认为倾向于利用成像技术。因此,特征是肽是一种有前景的候选分子成像早期诊断,特别是对肿瘤。

许多肽包含的是主题产生的肿瘤靶向疗效,如tTF-NGR NGR-hTNF,循环NGR-labeled顺磁量子点(cNGR-pQDs) [6- - - - - -10]。我们以前的工作表明,是单体和二聚体显示相对较高的肿瘤吸收(5,11]。

在这项研究中,一个新的是肽合成和标记,然后进行SPECT成像的表达CD13皮下鼠标HepG2肝癌异种移植模型,这是证明显示积极CD13受体和肿瘤的形成。

2。材料和方法

2.1。一般

所有的化学物质(试剂级)获得从商业供应商和使用前未经纯化。是(YGGCNGRC)是由许可证使用Fmoc方法chlorotrityl氯树脂。是由^99年Mo /发电机(北京原子高科技,中国)。水净化用Milli-Q超纯水系统从微孔(米尔福德,美国),其次是通过Chelex bioconjugation前100树脂和放射性标记。Radio-TLC进行二氧化硅gel-coated塑料布(多字母SIL G, Macherey-Nagel)和丙酮和Vethanol: Vammonia水:Vwater = 2: 1: 5作为洗脱液。读了盘子Bioscan Mini-scan(美国)和Allchhrom +软件。半制备高效液相色谱法(高效液相色谱法,闪耀着,加拿大)是用于肽分析。NGR-containing肽是由固相多肽合成(许可证)使用Fmoc战略chlorotrityl氯树脂如前所报道(12]。质谱用于证实产品的身份。质谱上得到Q-Tof premier-UPLC系统配备一个电喷射接口(ESI;水域,美国)或热电子Finnigan LTQ质谱仪配有电喷雾电离源(美国热科学)。

2.2。Radiolabelling和配方

新鲜的解决方案(37 - 74兆贝可)被添加到一个解决方案是肽(15 ~ 20μ每mCi g肽),200年μg氯化亚锡溶于1 M盐酸(5μ克/μL)和20μL 0.2 NaAc / HAc缓冲区(pH = 4.2)的解决方案。混合物在室温下孕育了30分钟。的包含过滤解决方案是0.2μm注射器过滤器(美国笼罩Acrodisc),然后通过一个0.2μ米微孔过滤到无菌瓶使用。

2.3。在体外稳定

的稳定性标签是在PBS和鼠标血清肽37°C进行了研究,3、6和12 h。然后父母示踪剂的比例是由radio-TLC(表1)。

2.4。细胞培养和动物模型

HepG2细胞生长在高葡萄糖DMEM培养基。在培养基培养细胞系都补充了10% (v / v)胎牛血清(美国Gibco), 1% mycillin, 1%谷氨酰胺(Beyotime,中国)37°C在湿润的气氛中有5%股份有限公司₂。使用雌性BALB / c裸小鼠(4 - 6周的年龄),HepG2肿瘤模型建立了皮下注射2×10⁶肿瘤细胞HepG2(0.1毫升)到正确的上层侧翼。当肿瘤体积直径达到0.8 ~ 1.0厘米(接种后2 - 3周),带有老鼠用于SPECT成像和biodistribution研究。所有的动物实验被FMMU临床中心批准。

2.5。细胞吸收研究

HepG2细胞被播种到48-well盘子2×10的密度⁵每口井的细胞实验前24小时。HepG2细胞培养标签是肽(~ 370 kBq /) 37°C 15、30、60、120和240分钟。孵化后,肿瘤细胞被洗了三次冰冷的PBS和收获通过胰蛋白酶化0.25%胰蛋白酶/ 0.02% EDTA(美国Hyclone)。细胞悬浊液收集和测量γ计数器(Zhida,陕西,中国)。细胞吸收数据提出了总额的百分比输入放射性衰变校正后添加到培养基。一式三份井实验进行了两次。

2.6。细胞结合分析法

体外CD13受体的亲和力和特异性是通过竞争细胞结合试验进行评估。最佳适合50%抑制浓度(IC₅₀HepG2细胞)值计算与非线性回归拟合数据使用Graph-Pad Prism5.0 (Graph-Pad软件、圣地亚哥、钙、美国)。

2.7。SPECT成像

HepG2肿瘤动物与一个脑袋SPECT成像在仰卧位MPR(美国通用电气)配备一个针孔准直器。7.4兆贝可标签是肽是通过静脉注入每一个鼠标在戊巴比妥钠腹腔注射剂量为45.0毫克/公斤。静态SPECT图像获得了1、4、8和12 hπ。收购的数量限制是200 k。

2.8。Biodistribution研究

裸小鼠轴承人类HepG2肝癌被随机分为5组,注射~ 7.4兆贝可是有或没有多余的未标记的是肽(20毫克/公斤)。注入示踪剂后,老鼠牺牲和解剖。HepG2的放射性肿瘤,主要器官,肌肉被收集和湿重与管(% ID / g)。意味着吸收(% ID / g)对一群动物与标准差计算。值被表示为平均数±标准差(/组)。

3所示。结果

3.1。化学和放射化学

是肽是(图做好了充分准备1)。分析高效液相色谱法和质谱法是用来证实产品的身份。质谱分析数据和化学结构是代表(图下方1)。是电喷雾质谱的测定()。净化后的具体活动标记示踪剂测定兆贝可/ nmol约为3.08 ~ 6.17。产品的标签产量%,放射化学纯度大于98%。的体外稳定性是在PBS (pH值7.4)37°C是图所示2。12 h的孵化后,超过92%的是肽小鼠血清中完好无损。

3.2。细胞吸收

细胞吸收的研究表明是直接绑定到肿瘤细胞HepG2。在前15分钟,%的是吸收HepG2细胞测定。2 h后孵化,肽吸收HepG2细胞达到最大%(图3(一个))。关于%的是仍与HepG2细胞4 h后孵化。

3.3。细胞结合分析法

中的绑定的亲和力是CD13是由竞争cell-binding化验。是抑制的绑定是肽HepG2细胞浓度的方式(图3 (b))。的集成电路₅₀值是计算nmol / L。

3.4。SPECT成像

的肿瘤疗效是探针在HepG2带有裸体小鼠被静态评价SPECT扫描注射后不同时间点。代表decay-corrected图像如图4。HepG2肿瘤显然是良好的可视化tumor-to-background示踪剂的对比。总的来说,是提供了更好的图像质量与相同数量的注射活动。

3.5。Biodistribution研究

组织分布数据老鼠是轴承HepG2肝癌肿瘤作为比例每克组织管理活动(% ID / g)在表2和图5。有和没有coinjection的体内biodistribution nonradiolabeled是肽(20毫克/公斤的老鼠体重)检查在HepG2带有肿瘤的老鼠。为是,肿瘤吸收被确定为2.52±0.83、3.03±0.71、3.26±0.63、2.81±0.25% ID / g(1、4、8和12 h,分别。是表现出% / g肾脏吸收和ID% ID / g肝脏摄取1 hπ。非特异性吸收的肌肉处于非常低的水平。是表现出较高的肿瘤在早期的时间点(图吸收5),表示特定的绑定和循环时间相对较长。

减少放射性在所有组织和器官解剖观察类似于阻塞组(SPECT成像结果表2),肿瘤吸收的变化是最重要的显著减少% ID / g而nonlabeled的存在是肽显著降低% ID / g 1 h后注入。为是阻塞组,% ID在肝脏和/ g% ID / g在肾被减少% ID / g和分别为% ID / g通过阻断。

4所示。讨论

在这项研究中,我们合成了一种新型的是肽,研究其生物靶向特异性,这被证明是一种很有前途的肿瘤分子成像探针进行临床实践。

有良好的化学和物理性质,可以直接从发电机生产(11]。CD13受体是一个有吸引力的目标生物,被发现是过表达对新成立的neovasculature和广泛的肿瘤细胞类型。放射性示踪剂的放射化学纯度高(> 98%)刺激进一步分析包括体外和体内评价,没有耗时的步骤的净化和干燥的化合物。的标记示踪也表现出稳定性好(图2(图)和亲和力3)。结果表明,成像后收购12 h内注入足够的检测肿瘤明显。标签的过程在这个研究是如此的方便,在未来的临床成像探测是可行的。

放射性标记的肽对于诊断和治疗应用的发展扩大了指数在过去几十年(8,13,14]。肽链型放射性药物可以简单和廉价地生产,有许多良好的性能,包括快速通关,迅速组织渗透,和低抗原性(6,9,15- - - - - -17]。在这项研究中,旁边的半胱氨酸是主题形成了一个循环通过二硫键和直接标记方法导致了一个非常稳定的产品。同时,打破NGR-containing肽的二硫键直接标记过程中可以解释略低亲和力与我们之前的结果(18]。否则,额外添加了三个甘氨酸保护核心主题是,可能会增加肽半衰期和稳定19]。同时,肝脏和肾脏吸收明显减少与之前的研究相比,这也可能是由于添加甘氨酸(18]。

SPECT扫描裸小鼠移植瘤模型是在HepG2肝癌显示,肿瘤和显著的吸收主要肾和肝间隙。但不具体的绑定在其他组织减少,肿瘤nontumor比因此增加。受体的特异性是进一步证实了有效抑制肿瘤吸收的多余nonlabeled biodistribution研究中是肽(表1)。虽然是肝脏和胃肠道的吸收低于先前的结果,这种做法在检测腹部肿瘤和转移是不适用的。从探测器主要是肾的排泄,快速血液净化应该另一个有利的特性。

总之,我们的数据表明,合成的小说是是一种很有前途的合成策略SPECT成像在体外和体内的属性。我们未来的工作将持续专注于更优的方法来减少肝脏和胃肠道吸收通过修改肽结构和特异性结合。此外,深入比较各种是肽才能保证屏幕的发展更好的放射性示踪剂。

5。结论

是肽与generator-produced成功标记肿瘤CD13受体的SPECT成像。是表现出好属性的亲和力,细胞吸收,肿瘤吸收和保留,药物动力学。是肽是一个潜在的SPECT成像代理人和肿瘤的早期诊断。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

文汇马和哲王同样这项工作。

确认

这项工作是支持的关键中国国家自然科学基金项目(批准号81230033),主要的国家基础研究发展计划(批准号2011 cb707704),国家自然科学基金研究项目的主要仪器(批准号81227901),中国国家自然科学基金重大项目(批准号81090270),中国国家自然科学基金项目(批准号81371594),Xijing医院的国际合作项目(批准号XJZT13G02)。

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