文摘

EhADH112是一个痢疾阿米巴Bro1 domain-containing蛋白质,在结构上与哺乳动物的阿历克斯和酵母Bro1参与运输所需的Endosomal排序复合物(ESCRT)介导的多泡体(多功能车辆总线)生物起源。在这里,我们调查的另一个角色EhADH112多功能车辆总线的蛋白质走私途径overexpressing 166个氨基酸的氨基端Bro1滋养子域。营养体显示减少吞噬率和累积外生Bro1在胞质囊泡聚合为异常的复合物在吞噬作用晚期,可能防止EhADH112函数。此外,假定的存在大肠阿米巴ESCRT-III亚基(EhVps32)可能与EhADH112互动,让我们用GST-EhVps32展开下拉试验和³⁵S]标记EhADH112或EhADH112衍生品,确认EhVps32绑定EhADH112通过其Bro1域。我们的总体结果EhADH112定义为一种新型的成员暂时ESCRT-accessory蛋白质在细胞表面和endosomal隔间,可能导致多功能车辆总线在吞噬作用形成。

1。介绍

痢疾阿米巴,人类阿米巴病的病原体引起第二次世界范围内的发病率和死亡率最高由于原生动物(1]。大肠阿米巴营养体获得主机从一个非常活跃的吸收营养和高效的细菌,吞没红细胞(RBC)和细胞碎片2),这使得他们被视为专业吞噬细胞。自大肠阿米巴phagocytosis-deficient突变体减少毒性在体外和在活的有机体内(3,4],nonvirulent大肠阿米巴菌株表现出减少的吞噬率(5),这种细胞事件被定义为一个重要毒力因子。

EhCPADH,大肠阿米巴蛋白复合物形成的EhADH112 adhesin EhCP112半胱氨酸蛋白酶,被广泛参与坚持,吞噬作用,破坏靶细胞(6]。生物信息学分析显示,EhADH112在结构上与哺乳动物的阿历克斯(7),一个进化守恒的,无所不在地表达和多功能支架蛋白,最初确定的与proapoptotic信号伙伴协会(8,9]。额外的证据了,阿历克斯调节其他的细胞机制,包括[差别受体对这些10,11),endosomal蛋白质排序(12- - - - - -14],integrin-mediated细胞粘附和细胞外基质总成(15),actin-based细胞骨架重塑(16,17),和膜内陷和离层在胞质分裂和逆转录病毒出芽18]。

阿历克斯是一个丰富的胞质蛋白multimodular架构包含一个氨基端“香蕉”形Bro1域(19),中间“V”形域(20.)和c端脯氨酸区域(21]。这三方域组织出现在大多数的阿历克斯orthologues并为他们提供多个此种站点特定的角色在几个细胞过程,并连接成不同的蛋白质网络的可能性,因此作为脚手架蛋白(22]。

知道阿历克斯的大部分也源于最亲密的orthologue的表征,酵母BRO1, Endosomal排序复合物的关键组件所需的运输(ESCRT)途径23,24]。ESCRT机械由一组蛋白复合物(ESCRT-0,我——,三世和相关蛋白质)他们中的大多数由所谓的空泡的蛋白分类(Vps)的因素。ESCRT装置的组装endosomal表面需要有选择地传输ubiquitinated受体蛋白质和其他货物到核内体称为后期多泡体(多功能车辆总线),对最终退化到液泡或溶酶体(25,26]。在这个过程中,人类的阿历克斯或酵母BRO1促进膜分离多功能车辆总线的管腔内的囊泡的形成,带动了直接关联的氨基端BRO1领域人类CHMP4或酵母Vps32(也叫Snf7) ESCRT-III子单元,分别为(19,20.]。

尽管EhADH112函数的理解重大进展与寄生虫有关毒性(6),其结构与阿历克斯和BRO1蛋白质之间的关系(7),最近的证据对于大多数ESCRT组件的存在(27)和MVB-like细胞器大肠阿米巴(28)的潜在作用EhADH112 ESCRT-dependent蛋白质排序和贩卖沿着多功能车辆总线通路尚未探索。Bro1域发生在大群真核蛋白质作为连接支架不同的蜂窝网络,包括多功能车辆总线形成依赖ESCRT。事实上,一个著名标志Bro1域功能是绑定到ESCRT-III子单元的能力。这里,我们发起的描述组成小型的氨基端残留EhADH112 Bro1域最初定义的蛋白质域包含了数据库(29日),但后来延长结晶实验(19]。EhADH112的三级结构建模,在这项研究中,提出了预测所需的空间构象与ESCRT-III假定的互动单元通过Bro1域。探索如果EhADH112可以参与多功能车辆总线在吞噬作用形成,我们生成的营养体的人口(ANeoBro1) overexpressing的前166个氨基酸EhADH112 Bro1域。ANeoBro1营养体大大减少他们的吞噬作用,可能是由于EhADH112功能的障碍,看似由外生Bro1积累在胞质囊泡和异常的复合体,在质膜和时间及其缺乏,EhADH112目标细胞粘附和吞噬作用的发挥它的作用。电子immunolocation EhADH112的结构类似于多功能车辆总线,连同其发现在这两种可溶性和不可溶性亚细胞分数,建议参与多功能车辆总线的形成。此外,EhADH112在体外绑定到一个蛋白质同源Vps32 (EhVps32),加强了我们的假设关于EhADH112贡献ESCRT-mediated蛋白质排序在多功能车辆总线途径由于Bro1域。总之,我们的结果定义EhADH112作为小说的成员Bro1 domain-containing蛋白质在细胞表面和endosomal隔间多功能车辆总线通路中的潜在作用。

2。材料和方法

2.1。三级(3 d)蛋白质建模

EhADH112主要序列提交Phyre服务器(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ ~ phyre /由瑞士模式)和验证数据库。EhADH112 3 d建模进行了与人类阿历克斯(2个项目)和酵母BRO1 (1 z1b)结晶序列作为模板。结果记录和分析通过DeepView-Swiss-Pdb查看器软件。

2.2。大肠阿米巴文化

营养体的克隆(应变HM1: IMSS)在TYI-S-33培养基培养axenically在37°C (30.]。媒介转染营养体(ANeo ANeoADH112和ANeoBro1人口)与40补充μg / mL geneticin (G418)(生命技术、Gaithesburg MD)。营养体收获在对数生长阶段对所有实验和细胞生存能力是由显微镜利用台盼蓝染料排斥监控测试。

2.3。Bro1-FLAG编码的PCR扩增片段

498年英国石油公司从5′末端片段EhAdh112基因,对应的前166个氨基酸EhADH112-Bro1域是扩增,菌进行使用(上皮EhAdh112nt) 5′-GGGGTACCATGAATAGACAATTCATTCCTGAA-3′和反义(477 - 497年EhAdh112nt) 5′- CGGGATCCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCACTACCTGCTGCACATAGTTGG-3′寡核苷酸,核苷酸10毫米,100 ng大肠阿米巴和2.5 U基因组DNA为模板TaqDNA聚合酶(Gibco)。PCR进行30周期包括在94°C, 1分钟30秒59°C, 40秒72°C。包含一个寡核苷酸Kpn我限制网站,而包含国旗(DYKDDDDK) tag-encoding反义寡核苷酸序列(下划线)31日)和一个BamH1限制站点。寡核苷酸用于这项工作专门识别序列中EhAdh112之前报道基因但不在场EhAdh112例如基因(7]。

2.4。代ANeoBro1 pNeo营养体的转染Bro1FLAG质粒

的扩增产物菌进行(Bro1FLAG)被克隆到BamH1和Kpn我的网站pExEhNeo (pNeo)质粒,它包含大肠阿米巴。特定转录信号和G418抗性(Neo^R)授予基因选择标记(32),生产pNeoBro1FLAG构造。大肠杆菌DH5α细菌与pNeo转换Bro1FLAG或pNeo质粒。这两个质粒纯化使用试剂盒马克西工具包(就是,CA)并自动测序。质粒(200μ(g)是由电穿孔转染如前所述32克隆)成指数增长的营养体,生成ANeo和ANeoBro1营养体的人口。

2.5。rt - pcr实验

互补脱氧核糖核酸合成使用1μg DNase-treated总RNA的核苷酸10毫米,200 U lamv逆转录酶(Gibco)和0.5μ克的低聚糖dT (Gibco)在最后一卷10μL, 1 h 42°C。使用4进行PCR扩增μL (~ 330 ng)的cDNA、1 UTaq核苷酸聚合酶2毫米,100 ng的感觉(上皮nt)和反义寡核苷酸的(477 - 497元)EhAdh112基因。此外,(17元)5′-ATGATTGAACAAGATGG-3′和反义(780 - 794元)5′-TTAGAAGAACTCGTC-3′引物被用来放大794 bp的片段Neo^R基因。每个PCR进行如上所述。放大产品1%琼脂糖凝胶电泳分离,ethidium bromide-stained和可视化凝胶医生1000设备(BioRad)。

2.6。免疫荧光分析

营养体生长在盖玻片和4%多聚甲醛固定(PFA)(σ)37°C 1 h, permeabilized 0.5% Triton x - 100在PBS (PBS-Triton) 30分钟和孵化1%牛血清白蛋白(BSA) 40分钟37°C。营养体孵化了鼠单克隆抗体EhADH112 (mαEhADH112)(1: 10)或兔多克隆anti-FLAG (pα国旗)(USBiological)抗体(1:500),在一夜之间在4°C(上),其次是孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)标记anti-mouse或anti-rabbit二级抗体(1:100)(酶),分别为1 h 37°C。

colocalization实验,PFA-fixed营养体是孵化在4°C和mαEhADH112和pα标记抗体,随后在37°C) (1 h FITC-labeled anti-mouse IgM和tetramethyl-rhodamine-isothiocyanate——(TRITC)标记anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体。对于一些实验,营养体最先孵化用新鲜红细胞(1:40)在不同时间37°C,固定PFA,与3毫米diaminobenzidine (DAB)和治疗免疫荧光检测。一切准备工作就绪保存使用不变色试剂Vectashield(向量)和检查通过一个尼康倒置显微镜在激光共焦扫描系统(莱卡)。

2.7。粘附和吞噬作用动力学

营养体是孵化5、10和15分钟与刚获得人类红细胞(10⁸细胞/毫升)(1:100比)在4°C的依从性,在37°C或吞噬实验(33]。红细胞与民建联和清点随机从三个独立的实验来确定红细胞的数量坚持或摄入100营养体。

2.8。透射电子显微镜(TEM)分析

Fast-freeze固定紧随其后cryosubstitution EhADH112用于超微结构的位置和FLAG-tagged Bro1重组多肽。转染营养体是颗粒状,放入7毫米直径的孔antiadhesive塑料环放置在一个泡沫橡胶铜镜子上的支持和冷冻预冷液氮温度使用Reichert KF 80单位。冻结替换实现与丙酮Reichert CS autosystem含有4%四氧化锇48 h−80°C。之后,样品被带到房间温度的速度4°C / h和嵌入在环氧树脂。超薄部分得到和染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。标签,然后在电镜下观察薄片放在formvar-coated镍网格和孵化0.1氯化铵的15分钟。然后,部分与PBS洗两次(每5分钟),阻止了1% BSA 15分钟,孵化与多克隆兔anti-EhADH112 (pαEhADH112)或单克隆鼠标anti-FLAG (mα国旗)(σ)抗体在1:50或1:20稀释,分别为60分钟。然后,部分被清洗和孵化1 h和山羊anti-rabbit或anti-mouse免疫球蛋白g(1: 20)抗体结合到15纳米胶体金(BBI国际、卡迪夫、英国)。最后,部分被洗,视为高于通过蔡司EM 910电子显微镜观察。吞噬作用实验,营养体最先孵化用新鲜红细胞(1:40比例)在37°C为TEM所描述的15分钟和治疗。

2.9。隔离大肠阿米巴膜

大肠阿米巴细胞分数被群起革命获得所述et al。34]。简单地说,从野生型克隆营养体(40×10⁶与19毫米)是收获,洗两次磷酸钾缓冲,pH值7.2和0.27 M氯化钠溶液(PD)和集中。细胞颗粒resuspended 2×10⁷细胞/毫升包含10毫米MgCl PD的解决方案₂和快速混合同等体积的1毫克/毫升伴刀豆球蛋白在同一个缓冲区。5分钟后,细胞纺50 g×1分钟去除多余的伴刀豆球蛋白a的上层清液都被丢弃和细胞颗粒resuspended 12毫升10毫米Tris-HCl缓冲区,pH值7.5,包含2毫米phenylmethylsulfonyl MgCl氟化物(PMSF)和1毫米₂。10分钟后肿胀低渗的缓冲区,细胞均质玻璃的18 - 20中风Dounce杵严的均质器(惠顿科学Div)。细胞溶菌作用和膜表形成被相差显微镜检查核实。匀浆是分层的两步组成的梯度8毫升0.5甘露醇/ 4毫升0.58蔗糖,三羟甲基氨基甲烷缓冲液,和旋转,享年250岁g为30分钟。剩余材料的顶部0.5米甘露醇(SN1)离心机在000×40 g 1 h可溶性分子(SN2)小膜分离碎片和囊泡(P2)。大型等离子体膜碎片和其他重型碎片形成了一个紧密的颗粒底部的梯度(P1)。这个球是resuspended 1毫升三羟甲基氨基甲烷缓冲液中含有1 Mα甲基甘露糖苷和留在冰与偶尔的混合了40分钟。等离子体膜无伴刀豆球蛋白三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到三卷,与玻璃Dounce均质机均质在80年中风,分层20%蔗糖三梯度和旋转30分钟250×g。起泡等离子体膜漂浮在初始蔗糖层(SN3)被离心收集,然后集中在000×40 g 1 h。颗粒(P4),浓缩在等离子体膜,resuspended三羟甲基氨基甲烷缓冲液。所有步骤都在4°C。样品(50μg)进行了分析通过sds - page(10%)和转移到硝化纤维膜使用兔多克隆抗体的免疫印迹分析EhADH112最后的c端243个氨基酸(pαEhADH243)和peroxidase-labeled anti-rabbit免疫球蛋白二级抗体,1:300和1:000稀释,分别。作为一个控制,鼠标单克隆抗-大肠阿米巴肌动蛋白和peroxidase-labeled anti-IgG相应的二级抗体用于1:1 500年和1:分别为000。

2.10。在体外绑定化验

质粒编码谷胱甘肽S-transferase(销售税)EhVps32构建了包含EhVps32 PCR片段编码序列插入BamH1的pGEX-5X-1(法玛西亚)。质粒用于在体外的合成EhAdh112和EhAdh112截断衍生品是由插入扩增或限制片段包含相应的EhADH112菌进行基因编码序列的polylinker pGBKT7 (Clontech)。销售税,EhVps32表达和销售税大肠杆菌BL21细菌。文化(50 mL)在诱导后30°C的0.1毫米-异丙酯β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)和孵化额外2.5 h与GST融合蛋白纯化[在继续之前35]。(³⁵S] -EhADH112和[³⁵S] -EhADH112截断衍生物合成在体外使用transcription-translation Promega TNT耦合系统的存在(³⁵S]蛋氨酸(1 000 Ci /更易)。标记反应(2μl)加入谷胱甘肽珠子含有GST-EhVps32或销售税蛋白质和孵化在4°C 1 h 500毫升的10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8.0,1毫米EDTA和150毫米氯化钠溶液(STE)和1% (v / v)特里同x - 100。五洗后STE Triton x - 100 / 1%,珠子都煮在样品缓冲和蛋白质10%聚丙烯酰胺sds - page分离。结合蛋白检测到放射自显影法或Coomassie蓝色染色的凝胶。

3所示。结果与讨论

3.1。三级结构的建模EhADH112预测构象阿历克斯的相似之处

Bro1 domain-containing蛋白质是真核生物中高度保守的,在几个细胞过程(图表现出不同的功能1(一)),根据合作伙伴他们相互作用[22]。EhADH112显示40%的同源性和20%的人类阿历克斯(身份7)和它的主要序列与相对应的阿历克斯的氨基端Bro1中间“V”域。更多不同的亲属ALIX只包含Bro1域但除此之外,其余结构(没有相似之处36,37]。虽然EhADH112缺乏脯氨酸c端道港口大部分此种网站链接ALIX各种功能(7,22),相反,这种蛋白质靶细胞粘附域,结合97 kDa蛋白在上皮细胞(38]。除了EhADH112,大肠阿米巴基因组预测两个EhAdh112有关的基因编码EhADH112-like1(898个氨基酸)和EhADH112-like2(919个氨基酸)蛋白质7),显示一个假定的Bro1域的n端(图1(一))。然而,这些蛋白质的存在在营养体尚未证实。

我们目前预测EhADH112蛋白质三级结构导致重叠的阿历克斯(图1 (b))。模型确定了回飞棒或“香蕉”形空间构象的氨基端EhADH112 Bro1领域,主要是由时间组成的α螺旋线形成一个螺线管,螺旋6到11安排在一个tetratricopeptide repeat-like结构(19),和一个中央核心安排在两个扩展three-helix束形成细长的手臂,向后折叠成一个“V”(图1 (b))。武器构象表明“V”域可能作为铰链,改变配体结合,所述ESCRT和病毒蛋白相互作用与阿历克斯(18]。显然,EhADH112保存这两个疏水补丁(19ALIX所需或BRO1膜定位和协会,通过直接绑定到ESCRT-III CHMP4或者Vps32个子单元,分别为(数字1 (b)和1 (c)),或者Src-tyrosine激酶对接。自阿历克斯的守恒的交互或BRO1 ESCRT-III是膜内所必需的萌芽和多频振荡器生源论在蛋白质排序和走私(39),有可能EhADH112副假定的大肠阿米巴通过其Bro1 ESCRT-III组件域。

3.2。代的营养体Overexpressing Bro1重组多肽

发起的表征EhADH112 Bro1域,营养体的克隆(HM1: IMSS)与pNeo转染Bro1FLAG质粒(图1 (d))驾驶Bro1重组多肽的表达和生成ANeoBro1人口。的存在和表达质粒在营养体证实的rt - pcr扩增Neo^R基因。Neo^R从ANeo放大(转染空pNeo)和ANeoBro1营养体(图1 (e)巷3),而相应的记录Bro1FLAG片段,只是发现ANeoBro1人口(图1 (e)巷4),预期。没有发现没有放大的总RNA逆转录酶在反应混合物中或使用野生型克隆营养体(图1 (e)通道1和2)。

3.3。ANeoBro1营养体本地化的外生Bro1重组多肽细胞质隔间

作为EhCPADH复杂的一部分,一个大肠阿米巴表面异质二聚体参与靶细胞粘附、吞噬、破坏,EhADH112位于营养体质膜和细胞质液泡6]。确定的位置Bro1多肽中由ANeoBro1营养体和区别于内生EhADH112 Bro1域存在,免疫荧光实验进行了使用多克隆抗体标记标签(pα国旗)和单克隆抗体(mαEhADH112)对EhADH112羧基端依从性抗原决定基氨基酸(444 - 601)。ANeo营养体,以及一个名为ANeoADH112的营养体人口,过表达EhADH112完整蛋白质融合国旗标签(EhADH112-FLAG),作为额外的控制(这里使用7]。

通过共焦显微镜,mαEhADH112抗体显示EhADH112的存在的质膜permeabilized ANeo, ANeoBro1, ANeoADH112营养体(图2(一个)),尽管荧光在ANeoADH112人口更高,因为这些营养体表达,内生EhADH112和外生EhADH112-FLAG。

正如所料,pα标记抗体没有反应与ANeo营养体(图2 (b)),但追踪FLAG-tagged Bro1间断细胞质的结构和大小不同的补丁ANeoBro1营养体。有趣的是,在质膜(图未发现信号2 (b)),这表明EhADH112羧基端,缺席的外生Bro1重组多肽,可以参与EhADH112营养体表面定位。因为EhADH112-FLAG出现在质膜(图2 (b))和一些细胞质液泡(图2 (b)箭头)ANeoADH112营养体,类似的模式表现出的内生EhADH112寄生虫数量分析(图2(一个)),我们排除国旗标签可能导致缺陷目标的重组Bro1膜。负面结果同样获得nontransfected或转染营养体二级抗体治疗。在这里,我们显示结果,分析ANeo营养体(数字2(一个)和2 (b))。

从这些实验中,我们可以得出结论,表达的重组多肽Bro1 ANeoBro1营养体比EhADH112位于不同的网站,而转染过程或FLAG-tagged蛋白质的表达并不影响内源性EhADH112在营养体的位置。

3.4。表达的外源性Bro1重组多肽ANeoBro1营养体减少Erythrophagocytosis但不是靶细胞粘附

EhADH112被赋予的属性特征之前其靶细胞糖基主要接触,内化,吞噬作用[6,38]。进一步理解Bro1 EhADH112功能域的贡献营养体,加拿大皇家银行坚持实施和erythrophagocytosis化验。坚持效率和erythrophagocytosis率表现出由ANeo营养体在15分钟被100%在所有实验。再次,作为一个额外的控制我们使用ANeoADH112营养体。

15分钟后红细胞孵化在4°C, ANeo和ANeoBro1营养体粘的意思和分别为加拿大皇家银行每营养体(数字3(一个)和3 (b)10点),同时和他们坚持5分钟和和和分别每营养体红细胞。相比之下,ANeoADH112显示活动性增加附加红细胞,通过遵循以上两次比ANeo红细胞和ANeoBro1 15日10日和5分钟(,和分别为每营养体RBC)(数据3(一个)和3 (b))。这些结果表明,外生Bro1重组多肽的表达并不影响营养体的粘附功能,表明EhADH112 n端可能不是促进靶细胞绑定。

有趣的是,值得注意的差异被发现在化验确定转染营养体的吞噬作用的活动。ANeo营养体摄取加拿大皇家银行/寄生虫在15分钟,加拿大皇家银行在10分钟加拿大皇家银行在5分钟(图3 (c)),而ANeoBro1营养体只摄取,和加拿大皇家银行每营养体15日分别为10和5分钟(数字3 (c)和3 (d))。正如之前报道的(7),ANeoADH112营养体展出增强吞噬率,多摄入76%的红细胞比ANeo营养体的15分钟erythrophagocytosis(数字3 (c)和3 (d)),40%和10%,分别为10和5分钟(图3 (c))。这些后者实验表明,过度的Bro1结果在吞噬作用占主导地位的负面影响。我们假设这种现象可能是由于招聘和蛋白可能参与协会的目标细胞内化和截断EhADH112吞噬作用的蛋白质而不是内生的,因此生产竞争蛋白结合位点,减少营养体的摄入率,尽管高效的原代细胞接触。否则,Bro1重组多肽本身,可能是生产的构象变化EhADH112或防止EhADH112易访问性与同行交流,因此导致功能障碍。

转染程序没有修改EhADH112位置和功能,因为ANeo营养体显示类似的结果所提出的nontransfected克隆营养体(数据没有显示)。

3.5。Bro1重组多肽展示不同的细胞吞噬作用期间内生EhADH112位置

以前的工作使用透射电镜和免疫荧光实验确定EhADH112糖介导靶细胞也有利于吞噬作用的活动大肠阿米巴营养体(6,38]。的吞噬率表现出减少ANeoBro1营养体让我们精确的位置EhADH112和过表达Bro1 erythrophagocytosis多肽后5分钟。

通过共焦显微镜,在协议前发现,EhADH112检测与质膜,靶细胞接触网站,膜扩展,时间nontransfected克隆营养体(数据没有显示)。类似的位置确定的EhADH112 ANeo营养体(数据未显示),坚持和白细胞红细胞比野生型营养体以同样的方式。关于ANeoBro1营养体(图4(一)),我们观察到在营养体EhADH112质膜、细胞质液泡和时间(图4(一),最高)。此外,小phagosome-neighbouring泡可能对应于核内体或溶酶体被发现(图4(一)星号)。否则,Bro1重组多肽在细胞质不时被发现和多孔结构,值得注意的是,这是积累在空泡的隔间(图4(一)箭头),红细胞没有重叠位置(图4(一))。图像还证明,外源Bro1没有达到营养体质膜在RBC-containing吞噬作用的早期阶段,没有时间。EhADH112的不同位置和重组Bro1营养体在基底文化条件下,即使在吞噬,连同ANeoBro1减损erythrophagocytosis利率和包含外生Bro1骨料的存在,表明这种多肽可以干扰营养体的功能蛋白质的质膜,可能参与膜重塑和红细胞内化成时间。控制实验中,省略主要抗体在营养体(图没有给出信号4(一),底部)。

3.6。外生Bro1积累在异常的隔间晚期的吞噬作用

之前它已经表明,内生EhADH112蛋白质改变它的位置在营养体在红细胞的吞噬作用。靶细胞接触后,这adhesin从营养体进行等离子体吞噬液泡膜。摄入过程进展,EhADH112存在于红细胞和30分钟之后,它回到质膜(6]。阐明外源Bro1定位是否在某种情况下等离子体膜或时间和更好地理解它的命运erythrophagocytosis过程,我们跟着这个重组多肽ANeoBro1营养体RBC摄入的在不同的时间。RBC交互(0分钟),后立即外生Bro1出现在随机分布的胞质囊泡和补丁的不同大小和形态(图4 (b))。RBC摄入进展(5分钟),外生Bro1重组多肽RBC-containing隔间周围堆积在一个环状结构可能对应于时间或吞噬溶酶体(图4 (b))。这个Bro1-enriched大型结构实现近距离靠近加拿大皇家银行在10分钟的吞噬作用,尽管没有观察到红细胞重叠(图4 (b))。吞噬作用后期阶段(15 - 20分钟),Bro1重组多肽出现在巨大的管状结构(图4 (b))。在酵母、缺失或失活几个Vps的因素,在蛋白质组装成ESCRT机械排序和贩卖通过endosomal隔间,诱发的形成增大有液泡的未成熟到多功能车辆总线和管状的细胞器(40,41]。因此,大液泡中观察到ANeoBro1营养体可能对应异常endosomal隔间外生Bro1多肽在哪里卡住了,影响红细胞的内化的动态膜时间。在我们实验室工作进展,使用特定的生化标记,将使我们能够确定这些结构的身份。

由于immunoelectron显微镜是一个关键技术将细胞内大分子功能上下文,我们解决外源性Bro1的超微结构的位置在ANeoBro1营养体基底文化条件下和在erythrophagocytosis 15分钟。对于这些实验我们使用鼠标单克隆抗体标记标签(mα国旗),这导致更敏感的特定识别FLAG-tagged Bro1重组多肽比pα国旗的人。

在协议与免疫荧光结果显示(图2,4(一)和4 (b)),米α标记抗体没有透露任何信号的质膜ANeoBro1营养体在文化(数据未显示),也在RBC摄入(图15分钟4 (c)左面板)。无数金颗粒与纤维材料中观察到巨大的囊泡(图4 (c)中间面板),可能对应于大液泡中发现数据4(一)和4 (b)。此外,米α标记抗体识别一些囊泡接近加拿大皇家银行(图4 (c)右面板),确认重组Bro1仍在空泡的大小不一的隔间,但不是在加拿大皇家银行或时间(图4 (c)右面板)。综上所述,我们的immunolocation结果显示,在培养条件下,外源Bro1丰富地分布在不同大小的胞质囊泡ANeoBro1营养体。同样,在初始步骤的目标细胞接触,ANeoBro1 Bro1重组多肽仍在细胞质的营养体,保持连接到目标细胞的能力,但吞噬率明显下降。外生Bro1的位置在小结构逐渐转变成夸张的空泡的隔间在吞噬的后期阶段表明在这些网站,重组Bro1也可以保留蛋白质参与红细胞内化,目标,和吞噬作用,他们中的一些人甚至影响EhADH112的函数,或者这个巨大的蛋白复合物可能会阻止蛋白质的回收营养体膜,暂时他们将有助于膜重塑和蛋白质组装过程所需的吞噬体的形成。

3.7。EhADH112在结构类似多功能车辆总线ANeoBro1营养体

根据我们的免疫荧光化验,内生的位置EhADH112 ANeoBro1质膜的营养体是不受基底条件下的超表达重组Bro1。事实上,这导致红细胞坚持效率与野生型和显示ANeo营养体。自EhADH112也是细胞质液泡中发现可以不同于重组Bro1积累,我们评估EhADH112的超微结构的位置在ANeoBro1营养体标签然后在电镜下观察实验中,使用EhADH112兔多克隆抗体(pαEhADH112)(图5),使反应在冰冻超薄部分比mαEhADH112的。值得注意的是,pαEhADH112抗体不承认EhADH112-like蛋白质序列由我们组之前报道,自免疫印迹分析具体检测相对应的区间预测分子量EhADH112(数据没有显示)。

通过TEM、pαEhADH112抗体显示EhADH112的质膜,ANeo(数据没有显示)和ANeoBro1营养体(图5 (b))。黄金标签也观察到内部和外部的囊泡膜囊泡内,经常纤维和膜材料(相关数据5 (c)- - - - - -5 (e))。有趣的是,EhADH112丰富的大液泡内包含几个管和多孔结构。巨大的细胞器,含有不同尺寸和形状的管腔内的囊泡,他们中的大多数immunolabeled,出现在许多营养体(图5 (c))。形态,这些车厢可能对应于多功能车辆总线,显示高相似度的哺乳动物中描述Denzer et al。(42]。我们还发现大量的白色EhADH112-carrying electrodense外囊泡与溶酶体结构的外表,也表现出EhADH112信号(图5 (d))。这些lysosome-like结构提出了一种双膜贴上EhADH112(界定数字5 (d)和5 (e))。引人注目的是,几个空泡的结构,包含在另一个,假设膜内崭露头角的小泡(图5 (e)箭头),与lysosome-like细胞器和EhADH112。复发性和丰富的对接EhADH112不同大小的囊泡膜,表明它可能参与蛋白质排序endosomal隔间和囊泡融合过程(数据5 (d)和5 (e))。

3.8。EhADH112出现在红细胞和吞噬作用期间的时间

初erythrophagocytosis,营养体膜蛋白与加拿大皇家银行取得联系。立即、不容易理解的信号过程发生时,允许招聘分子与不同的角色在靶细胞的吸收和消化。在本文中,我们的免疫荧光实验证明,过度ANeoBro1 Bro1重组多肽的营养体并不影响EhADH112位置在靶细胞接触地点和时间(图4(一))。此外,TEM超微结构的观察,位于EhADH112靠近,使入鞘膜周围红细胞的营养体ANeo(数据没有显示)和ANeoBro1数量(图4 (c))。在营养体中,附近的界定膜周围的红细胞,几个小的白色小泡(图6 (b)),有时就像被释放巨大的囊泡。通过外表(42),这些囊泡可能对应于多功能车辆总线(图6 (b)星号)。吞噬作用先进,更丰富的黄金粒子被发现在加拿大皇家银行(数字6 (b)和6 (c))。此外,含有红细胞约时间,我们观察到白色小泡在安排显然是有组织的,他们中的一些人用金颗粒标记(图6 (c))。

哺乳动物的阿历克斯和酵母BRO1细胞质蛋白质与endosomal隔间ESCRT机械的功能与组件在多功能车辆总线形成(41,43]。内吞作用的途径,从早期的核内体形成多功能车辆总线,然后,他们融合到核内体或溶酶体12,44]。在这里,我们的发现加强EhADH112的作用不仅是一位adhesin营养体表面,而且作为一种蛋白质的相似性Bro1 domain-containing蛋白质如阿历克斯,可以指定一个替代函数在核内体,吞噬体,形成多功能车辆总线。黄金表面的标签的存在小距离的囊泡大液泡可能意味着EhADH112正在针对这些网站在囊泡形成或执行的函数本身传送带蛋白质携带其他分子参与这个过程。此外,EhADH112参与囊泡生物起源的可能性意味着它可以转移从质膜膜利用内部囊泡。因此,EhADH112可溶性或不溶性膜相关蛋白,根据其功能和蛋白质或蛋白质结合。

3.9。EhADH112主要存在于膜亚细胞分数

调查是否本地EhADH112仍然是野生型营养体的可溶性或不溶性膜相关蛋白,我们进行描述的过程群起革命et al。34]其次是免疫印迹分析,用兔多克隆抗体EhADH112的最后243个氨基酸(pαEhADH243)检测adhesin的羧基端。pαEhDH243抗体识别预期78 kDa带对应于EhADH112分子量原油提取(TP)获得中断后营养体孵化与伴刀豆球蛋白A蛋白酶抑制剂(图的存在7(一)左面板,巷1)。在250×g离心后30分钟甘露醇/蔗糖梯度,EhADH112出现在上层清液(SN1),其中包含囊泡,小膜碎片,可溶性蛋白质(图7(一)左面板,巷2)。我们还发现一个弱带颗粒(P1),其中包含大量的碎片等离子体膜和细胞碎片(图7(一)左面板,巷3)。作为一个控制,我们使用鼠标对肌动蛋白单克隆抗体(mα肌动蛋白)的反应与相应的分数(图43 kDa的蛋白质7(一)左面板,车道1 - 3)。

然后,我们超离心机(000×40 g) SN1分数得到上层清液(SN2),在可溶性成分依然存在,颗粒(P2),包含内部囊泡和小膜碎片。EhADH112只是P2(图中找到7(一)中间面板,巷2),表明它可能是主要膜相关蛋白。肌动蛋白也没有SN2分数和强烈P2(图中发现7(一),中间面板,巷2)。

接下来,我们加工P1分数,根据群起革命et al。34),包含起泡和nonvesiculated质膜碎片。P1分数(图7(一)左面板,巷3)均质甲基甘露糖苷和离心机250×g蔗糖垫分离起泡(P4) nonvesiculated膜和碎片(P3)。P3没有与p反应αEhADH243抗体(图7(一)右面板,巷1),表明EhADH112 nonvesiculated膜差存在。然后,我们集中在上层清液(SN3)超速离心法在000×40 g获得起泡膜碎片(P4)。pαEhADH243抗体显示在P4 EhADH112(图的存在7(一)右面板,巷2),因此,确认相关的蛋白质起泡质膜碎片。与此同时,肌动蛋白在P3和P4本地化,nonvesiculated和起泡等离子体膜(图7(一)右面板,通道1和2)。

这些数据显示存在EhADH112膜囊泡,支持通过显微镜实验结果。他们也可以相关证据表明EhADH112质膜在活跃的水泡交通由营养体展出,可能在质膜小泡,最终融合。

大多数Bro1 domain-containing蛋白胞质,它已经注意到阿历克斯短暂地招募到质膜促进膜裂变在萌芽和释放的病毒粒子,在协会late-acting ESCRT蛋白(45]。EhADH112最初被描述为一个组件的heterodimeric EhCPADH复杂,出席营养体文化条件下质膜和细胞质液泡。有趣的是,在erythrophagocytosis,这一复杂的被发现在不同的位置。首先,营养体等离子体膜蛋白被发现,尤其是在目标细胞联系网站。然后,这种蛋白质检测一起内化红细胞,在时间和吞噬溶酶体。在晚期,EhCPADH再次检测到复杂的营养体等离子体膜,因此建议蛋白质回收,甚至,一个假定的EhADH112参与膜重塑。额外的证据一直确认的存在EhADH112在两者中,营养体质膜和胞质囊泡。根据我们目前的亚细胞部分实验,EhADH112主要存在于膜分数。然而,正如图所示7(一),EhADH112还发现含有可溶性蛋白质的分数。因此,我们不能抛弃EhADH112以可溶形式存在的可能性在特定条件下没有探索。自从精确的蛋白质位置在很大程度上取决于其功能的细胞,它必须考虑Bro1域包含蛋白质如阿历克斯是无处不在的,以作为脚手架蛋白连接多个生物过程。因此,附加功能应该追究EhADH112营养体中更好地理解它的亚细胞位置。尤其是在不同膜EhADH112隔间,强烈支持的假设EhADH112可以执行内吞作用的通路中的一个角色,尽管它仍有待建立之前报道大肠阿米巴ESCRT机器确实是参与这一过程。

3.10。EhVps32结合EhADH112的n端

大多数Bro1守恒的特性之一domain-containing蛋白质是他们ESCRT-III组件Vps32或CHMP4结合的能力。这种交互允许BRO1或阿历克斯目标在多频振荡器形成核内体和病毒出芽13,19]。在这里,我们调查是否EhADH112与交互大肠阿米巴蛋白质同源Vps32酵母。首先,我们发现大肠阿米巴基因组蛋白质序列(EhVps32)和一个数据库值为2.5-12年,显示身份酵母Vps32同源性48%和25%。根据多个序列分析和数据库包含预测,EhVps32包含Snf7域,出现在Snf7家族的所有成员。此外,使用Jpred EhVps32二级结构预测程序,建议EhVps32保存五个特征α螺旋存在于Snf7家族蛋白。确认预测EhADH112和EhVps32蛋白质之间的相互作用,进行下拉实验。因此,我们表达了GST-EhVps32融合蛋白在细菌。销售税单独或纯化GST-EhVps32固定化在glutathione-sepharose珠子(图7 (b)左面板通道1和2,分别地)和孵化。³⁵S]标记EhADH112(图7 (b)左面板巷3)或(³⁵S] -EhADH112(1 - 421个氨基酸(图)7 (b)左面板,巷4)和(³⁵S] -EhADH112氨基酸(422 - 687)衍生品(图7 (b)左面板巷5),之前合成了一个耦合transcription-translation系统,如部分所述2.10。GST-EhVps32珠子保留EhADH112(图7 (b)右面板,巷1),EhADH112导数(图(1 - 421)7 (b)右面板,巷2),但不是EhADH112氨基酸(422 - 687)多肽(图7 (b)右面板,巷3)。正如所料,销售税独自无法绑定EhADH112和EhADH112衍生品(图7 (b)右面板,车道4到6)。蛋白质存在于下拉的反应混合物Coomassie蓝染色作为额外的控制(数据未显示)。在一起,这些结果强烈表明EhADH112结合EhVps32 Bro1域,作为其他Bro1据报道domain-containing蛋白(19,20.]。

尽管我们还不知道其他的身份相关的蛋白质,或经由EhADH112住营养体,基于这些结果,我们推测,ESCRT EhADH112可能相互作用的蛋白质在活的有机体内,因为它已经报道了阿历克斯和BRO1 [19,39,46,47]。有趣的是,EhADH112似乎是小说的一个亚科的Bro1 domain-containing蛋白质在细胞表面(48),或者可以调节蛋白质的组装多功能车辆总线的endosomal膜生物转化。易位的EhADH112质膜内部囊泡,核内体,或时间和回地面,也可以与一个脚手架函数,因为它被描述为其同系物在酵母和哺乳动物22]。然而,蛋白质的伙伴关系在不同的蜂窝网络应该进一步解决。

4所示。结论

在这项工作中,我们首次报道的功能描述EhADH112的n端,一个大肠阿米巴Bro1 domain-containing蛋白质参与寄生虫毒性。大幅减少的吞噬率显示营养体overexpressing一个EhADH112 Bro1重组多肽,加上夸张的积累这种蛋白质在异常的隔间,建议Bro1域新兵参与吞噬作用的蛋白质。此外,EhADH112定位在营养体等离子体膜,多功能车辆总线和时间,在两种可溶性和不可溶性亚细胞分数,提供额外的支持这种蛋白质的另一个角色的endosomal多功能车辆总线途径。这个函数守恒在Bro1 domain-containing蛋白质,联想到核内体与ESCRT组件交互。在这里,我们也展示了在体外协会的EhADH112大肠阿米巴蛋白质的同源ESCRT-III Vps32单元,作为公认的标志EhADH112 Bro1域函数endosomal蛋白质排序。额外的应努力更好地理解EhADH112在ESCRT-mediated多功能车辆总线生源论和其他功能也分配给Bro1 domain-containing蛋白质。

确认

作者感谢阿比盖尔Betanzos提供评论在纸上,西尔维亚周晓明pαEhADH243抗体和阿尔弗雷多·帕迪拉帮助他的艺术品。本研究主要是由欧洲共同体(Phagoamoeba项目)和国家科学技术委员会(CONACyT-Mexico)。作者也感谢西班牙CICYT格兰特bfu2005 - 01970和PFPI奖学金支持o·文森特和s的分别。