文摘

的血鞭毛虫鲁兹锥体美洲锥虫病的病原体。尽管在寄生虫生活周期的能动性的重要性,是知之甚少t . cruzi能动性,没有定量描述其鞭毛跳动。用视频显微镜和量化矢量epimastigote轨迹的分析,我们找到一个寄生虫蠕动由tip-to-base对称鞭毛节拍。这个运动是偶尔打断了根部长到指尖高度不对称的节拍,这代表trypanosomatid鞭毛的纤毛击败。开关鞭毛和纤毛之间跳动促进寄生虫的重新定位,产生很大变化的运动和轨迹,结果在不同的距离范围内旅行的细胞。分析距离、速度和旋转角度表明epimastigote运动不是完全随机的,现象是高度依赖于这种寄生虫行为和运动的特点是直接和翻滚寄生虫以及它们的组合,产生交替的直线和复杂的运动路径。

1。介绍

鲁兹锥体是一个鞭毛原生动物,恰加斯病的病原体,衰弱,无法治愈的致命的疾病,在拉丁美洲(影响2000万人1]。这种寄生虫是一个复杂的两相的生命周期,在无脊椎动物和脊椎动物宿主之间移动三交替发展形式(epimastigotes metacyclic和血液trypomastigotes,无鞭毛体)可以被识别的形态学特征。无鞭毛体的特点是短鞭毛的存在,而epimastigotes和trypomastigotes出来有很长的鞭毛鞭毛的口袋里,一种细胞器,入口孔一起参与寄生虫的内吞作用的和exocytic通路(2- - - - - -5]。

像其它鞭毛细胞,trypanosomatids推动寄生虫通过行动的鞭毛的机械化学的振荡器,产生能动的力量。纤毛和鞭毛的细胞器是高度保守的在进化的过程中,遇到各种各样的生物从原生生物的哺乳动物。因此,trypanosomatid鞭毛显示9的特征模式对外围紧身衣和一个中央对真核生物的基因丝微管是守恒的。外围微管内外动力蛋白臂,径向辐条和nexin链接,而中卫搭档,微管显示具体的预测。句子与细胞通过基体和nexin相互连接的链接。动力蛋白的分子马达,导致相邻微管对比滑过去。动力蛋白的作用是通过dynein-regulating协调复杂,在径向辐条和信号传播,在一起产生的波形纤毛和鞭毛6- - - - - -8]。这个滑动译成鞭毛弯曲。

的鞭毛trypanosomatids kinetoplastids还存在另一个结构独特,眼虫藻、甲藻,命名paraflagellar棒(再生)(综述(9- - - - - -11])。平行的再生是一个以格状结构内的基因丝鞭毛膜。近端,中间,和远端域;它的直径是类似于基因丝;它通过连接固定在基因丝对比4 - 7 (12- - - - - -14]。

因为鞭毛由多样化的结构,是高度动态的,强烈的,和高度协调,axonemal微管的构象变化,相关的结构和再生能源需要执行的所有功能的鞭毛。反向和正向遗传工具被用来评估鞭毛功能和运动的许多方面。主要的鞭毛组件一直沉默,扰乱鞭毛的能动性。因此,它已被证明在锥鞭毛在细胞形态发生中扮演关键角色(15),对昆虫宿主上皮细胞(16),线粒体DNA分离(17),和细胞分裂18]。此外,鞭毛运动已证明是必不可少的t . brucei生存的哺乳动物血液中(19]。

虽然遗传方法允许增加相当大的鞭毛功能和运动的不同方面的知识,对寄生虫蠕动模式和鞭毛。定量分析的鞭毛击败t . brucei(20.,21),l .主要(22已报告);然而,存在没有鞭毛跳动的描述t . cruzi。

最近的再生能源结构分析epimastigote鞭毛跳动t . cruzi表明三个部分(中间,近端和远端)再生能源的重新安排,进行动态重构在鞭毛跳动(5]。然而,定量了解epimastigotes跳动依然缺乏,很少知道的能动性t . cruziepimastigotes。

在目前的研究中,我们分析了能动性和鞭毛殴打鲁兹锥体epimastigotes。捕捉到的图像自由游动的epimastigotes视频显微镜和定量分析epimastigotes个人的距离的。每个寄生虫的时间轨迹分解成距离,速度,和旋转角度促进一个更详细的量化矢量分析,和一个全民也进行分析。

2。材料和方法

2.1。寄生虫

Epimastigotes从t . cruziCL-Brenner应变特征明显(应变和参考菌株基因组计划)在肝脏灌注培养胰蛋白示介质(点燃)含10%胎牛血清(的边后卫)和0.1毫克/毫升氯高铁血红素在28°C。对所有实验,这些寄生虫是生长在均质条件和采样用于实验在48小时在对数生长阶段。股票文化成长每4天使用1×10⁶寄生虫作为初始接种体保证均匀性和主动能动性的寄生虫。

2.2。视频显微镜和运动性化验

寄生虫被贴上carboxy-fluorescein succinimidyl酯(CFSE)绿色荧光染色(分子探针,尤金或)如下。Epimastigotes (5×10⁶在指数期增长洗1 x PBS和染色1毫升的PBS的0.5毫米CFSE在黑暗中在室温20分钟。与1 x PBS三洗后,10μL滴epimastigotes (5×10⁶/毫升1 x PBS)被放置到盖玻片上,和寄生虫被允许自由移动。彩色寄生虫的能动性视频拍摄通过反向激光共焦显微镜(徕卡SP5、DM 16000、钼)和一个488纳米荧光激发过滤器和一个HCXPLAPOλ蓝色63 x 1.4 NA石油目标。捕获的图像和分析使用LAS AF软件(徕卡应用程序套件先进的荧光Lite/ 1.7.0构建1240徕卡微系统)。捕获的图像在时间序列模式10帧/秒的速度并记录在10秒/样品。

2.3。图像处理和测量数据的统计处理

活性测定,标记细胞的运动测量和分析使用Image-Pro + V 6.0媒体控制论程序。轨迹分析,我们返回数据集和代表了寄生虫,水平和垂直坐标,分别在时间后,记录的开始。轨迹分析的第一步是计算连续两次之间的距离,和。对于这个计算,我们使用以下知名从矢量分析公式,我们实现的MATLAB 7.1: 因为所有的连续点之间的时间间隔是1秒长,每个距离数值等于相应的速度。一旦所有瞬时速度对于一个给定的寄生虫了,平均个人寄生虫速度和相应的速度直方图计算。接下来,两个连续的位移之间的角度和为每个寄生虫使用下列方程计算(还实现一个自定义的MATLAB 7.1例程): 在哪里和在位移由寄生虫旅行的距离和分别为,是由 从矢量分析的定理,它可以证明逆时针旋转,否则。一旦所有的角度寄生虫轨迹计算,计算相应的直方图和重复所有的寄生虫的过程进行了研究。因为所有直方图近似对称,对于每一个轨迹,我们进一步计算角度的绝对值的平均值作为一个错综复杂的测量相应的轨迹。

3所示。结果

3.1。自由游动的能动性分析Epimastigotes

的运动自由游动的epimastigotes分析了用视频显微镜、和视频处理Image-Pro + V 6.0媒体控制论项目研究细胞运动性的痕迹。图1说明了细胞的能动性和鞭毛殴打t . cruziepimastigotes。寄生虫是高度能动的,表现出极大的可变性的运动和轨迹,由交替时期的转化细胞运动特征,下跌和关闭(数字1(一),1 (b),1 (c)),导致不同的距离范围内旅行的细胞(图1 (d))。发起的主要波形是可拉长的击败的鞭毛和传播基地,导致细胞向前推进。在自由游动的epimastigotes中细胞运动不是阻碍,波振幅明显并没有改变整个自由鞭毛(图2),如观察到利什曼虫主要(22]。这个可拉长的击败偶尔中断在短时间内根部长到指尖波跳动导致前鞭毛的重新定位,然后结束这种寄生虫的身体没有明显落后的能动性(图1 (e)浅蓝色的区域,图3和视频1)。这些数据表明t . cruzi显示一个细胞向前推进tip-to-base鞭毛波传播,已经报道了利什曼虫和非洲锥虫(20.,22]。

3.2。自由游动的Epimastigotes旅行不同的距离范围

定量分析细胞活性的荧光epimastigote人口的痕迹表明,寄生虫的平均速度范围从1μ米/ 10秒到400μ米/ 10秒(图4)。寄生虫的比例最高(30%)在最大速度(400μ米/ 10秒),而接下来的比例最高epimastigotes(21%)至少旅行速度(1μ米/ 10秒)。其余epimastigotes旅行这两极之间不同距离速度不同(20%的意向μ米/ 10秒,41-60 14%μ米/ 10秒,7%,61 - 90μ米/ 10秒,8%在81 - 100μ米/ 10秒)变量水平没有显示一个特定的模式。尽管平均速度的差异可能是由于不同细胞运动和细胞连接到显微镜幻灯片,所有的寄生虫有剧烈的运动,和鞭毛波的振幅和频率是恒定的。

3.3。矢量分析寄生虫轨迹

自由游动的的时间轨迹epimastigotes通过液体介质被分解成距离,速度和旋转角度,以促进更详细的定量比较。矢量分析被应用于描述的速度和旋转角度每个寄生虫使用自定义的所有单个的轨迹MATLAB 7.1常规,平均行为epimastigote人口的决心。

数据显示速度的速度寄生虫可以用麦克斯韦玻耳兹曼分布描述,表明epimastigotes接受Brownian-like运动。宽parasite-to-parasite变异性在平均速度()表明,除了布朗运动,鞭毛跳动的能动性也有助于epimastigotes(图5)。

如图6、旋转角度分析表明,角变化大约是对称的整个范围从180−180度自由游动的寄生虫。这一发现表明,没有偏好寄生虫旋转的方向,这表明高度的特性转化。随着转动角度直方图并不是平的,而是表现出不同的偏见寄生虫,寄生虫的运动并不是完全随机的,现象是高度依赖于寄生虫的行为。较小的角度通过定向运动过程中产生定向漂移,而大角度旋转和翻滚阶段生产当鞭毛不连贯的定向运动。自由游动的寄生虫运动的旋转角度直方图显示峰值集中在小角度,表明几乎直线路径,很少有突然的变化方向。这种行为显然是观察当速度和旋转角度进行分析(图7)。相同的对称行为观察分析了随机选择的寄生虫,和平均角变化不同距离的旅行,甚至对于寄生虫。

总的来说,这些结果表明,epimastigotes从相同的人口来自相同的细胞培养和暴露在相同的环境条件不遵循一个单一的运动模式。

4所示。讨论

尽管,运动性trypanosomatids对生存很重要的过程,完成生命周期,和寄生虫感染,所涉及的分子机制仍知之甚少。

最近出版的完整基因组序列t . cruzi,t . brucei,l .主要(23- - - - - -25),锥虫鞭毛蛋白质组的研究19,20.],这些生物体的基因可操纵性的可行性已经阐明一些分子的关键角色参与寄生虫能动性和鞭毛的功能。然而,目前知之甚少能动性和鞭毛殴打过程的一般特征,并深入定量描述的假设可能缺乏测试。“Tritryps”定量分析鞭毛的殴打和自由游动的能动性属性只有报告t . brucei(20.,21),l .主要(22]。

用视频显微镜和矢量寄生虫轨迹的分析,我们发现漂流epimastigotes的能动性t . cruzi特点是(a)一个大变化的交替运动和轨迹的平移运动,下跌,寄生虫和关闭;(b)向前蠕动造成tip-to-base鞭毛波传播;(c)对称旋转角表示高度的特性转化;(d)鞭毛跳动引导epimastigote能动性;(e)零星的不对称根部长到指尖跳动代表纤毛击败trypanosomatid鞭毛和产生细胞的定向漂移。

至于其他trypanosomatids epimastigotest . cruzi游泳非常积极在培养基中的任何方向主要与前结束。寄生虫蠕动分析提出了工作表明,细胞模式类似于之前报道了痕迹t . brucei(26,27],击败发起的鞭毛提示类似报道利什曼虫(22),t . brucei(20.]。这个属性的trypanosomatid鞭毛是独特的与其他生物相比,击败从近端发起的鞭毛。在这些生物,相信弯曲形成和持续规律的振荡取决于局部interdoublet滑动阻力,通常授予鞭毛的结构基础,称为基体。同样,在锥体虫,建议他们可能有一些提示启动或限制结构提供抗紧身上衣滑动的方式类似于基体。这个附件结构被发现短膜虫属deanei,匐滴虫属megaseliae,锥虫属brucei,利什曼虫主要(28];因此,这种结构也可能出现在t . cruzi需要,尽管未来实验演示这一特点。

节拍起始点其他比鞭毛,报道l .主要和t . brucei,是很难评估的t . cruziepimastigotes因为高速视频显微镜是不习惯在这工作。然而,可以发现除了tip-to-base鞭毛波,epimastigotes还展示了另一种类型的击败传播在相反的方向(根部长到指尖,纤毛跳动的特征)在一个小得多的频率和在一个高度不对称模式。这纤毛击败开始自发的起始,打断了主要tip-to-base节拍,生产突然暂停观察几乎没有运动。然后,短时间间隔的根部长到指尖波之前指出寄生虫三周tip-to-base鞭毛击败了很少的平移运动和明显的改变epimastigote取向,恢复细胞运动向前发展。这个开关鞭毛和纤毛之间打报告t . brucei(20.),l .主要,c . deanei,c .下方(22),而c . oncopelti(29日]。这些结果表明,这些生物可以维持至少两种类型表明,他们可能能够维持其他类型的节拍时在不同的微环境在其生命周期。

运动和轨迹的变化t . cruziepimastigotes符合暴跌,中间,和持续的能动性模式中观察到t . brucei。这些运动模式细胞伸长的结果与细胞刚度,这已被证明影响不仅鞭毛速度还寄生虫运动的方向(21]。在t . brucei血液中形式,鞭毛沿着身体细胞,导致复杂的身体变形在游泳,游泳更直的细胞表现出更多的定向和细胞总位移似乎更倾向。因此,定向运动的优势t . cruziepimastigotes可能导致更高的更直的细胞,可能是因为他们的鞭毛沿着短细胞体和因为nonextensive寄生虫变形区域观察到细胞游泳。

最近的分析结构组织的再生能源t . cruziepimastigotes鞭毛在直接与弯曲状态(5)表明,再生能源根据基因丝的运动变化。再生能源是由离散纤维结构以格状阵列与三个不同的域(中间,近端和远端),它提出了三个领域可能一起工作。根据这一提案,近端域被压缩时,远端或相反的域是拉伸交替模式在鞭毛跳动。中间域将遵循这一动态的运动,在弯曲状态,纤维将靠近5]。因此,不同的运动模式观察epimastigotes游泳期间可以表明中间域能够改变其位置近端和远端之间的细丝,允许切换鞭毛和纤毛跳动。这个领域的运动将交替转化细胞的周期运动,翻滚,寄生虫和关闭,导致epimastigotes随之而来的重新定位。运动性的不同模式的机制协调仍然是未知的,但再生的小部件(30.)可以参与电机、锚定或连接器蛋白质在不同的运动方式。然而,未来的生物化学和遗传学研究将是必要的,以确定的类型,功能,可能参与这些蛋白质的鞭毛击败。

对称和等于振幅波通过鞭毛的定向运动t . cruzi报道的promastigotes epimastigotes相似l .主要,也有一个免费的鞭毛,只是附加短区域的细胞(22,31日]。定量分析的旋转角度和分离研究寄生虫位移和鞭毛跳动,使用相应的固定和叠加图像,显示,如利什曼虫,t . cruzi没有显示的变化振幅波旅行从尖端到基地。相比之下,在t . brucei,向近端振幅降低,可能是由于鞭毛的附件以及大部分的细胞(20.]。为了验证这个假设,未来实验比较epimastigotes的鞭毛殴打与血液和metacyclic trypomastigotest . cruzi将是有用的。

trypanosomatid鞭毛是完全不同于基于回转马达的细菌鞭毛(32和更复杂的比大多数其他microtubule-based真核鞭毛(33,34]。t . cruzi,像其他两个“Tritryps”的基因组序列已经确定,可以转基因功能研究,很容易成长和转变为文化,其能动性是其生命周期的一个重要组成部分。由于这些原因,“Tritryps”正在成为非常有吸引力的模型对鞭毛函数的分析和研究人类遗传病基因与鞭毛运动性的缺陷。因此,能动性和鞭毛殴打的定量描述t . cruzi报道这项工作提供了一个有用的平台未来的基因实验测试寄生虫能动性和鞭毛函数假设。

总之,我们的定量活性分析结果提供洞察鞭毛击败美国锥体虫和提供新的细节很重要,然而知之甚少,能动性的模式t . cruzi。

确认

这项工作由CONACYT赠款支持。42862年和60152年授予r . g . Manning-Cela批准号55228知道m . Santillan和赠款。128461年从CONACyT也没有。从PAPIIT IN203909授予美国Martinez-Calvillo(自治)。g . Ballesteros-Rodea收到CONACYT博士奖学金(墨西哥)。我们感谢伊凡Galvan指导在共焦显微镜分析。

补充材料