保护作用的细胞毒性T淋巴细胞在Filovirus出血热

文摘

感染许多新兴病毒、出血热等疾病引起的丝状病毒,马尔堡(MARV)和埃博拉病毒(EBOV),留给主持人很短时间内鼠标保护性免疫反应。在致命的情况下,控制病毒复制和病毒诱导的免疫失调太严重的克服,和死亡率通常是与缺乏显著的免疫反应有关。接种疫苗在动物身上的研究展现出一个免疫球蛋白和中和抗体反应与保护协会糖蛋白抗原与致命的生存挑战。最近,研究filovirus出血热已建立的动物模型诱导filovirus-specific强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应可以促进完整病毒清除。在本文中,我们描述分析用来发现CTL反应后接种疫苗或生活filovirus感染动物模型和人类的临床试验。不幸的是,小数据收集了关于CTL反应从被感染的人类幸存者,主要由于疾病的低频率和无法执行这些研究领域。化验和技术的发展可以使这些研究发生在未来爆发。

1。介绍

的丝状家庭包含两个属,Ebolavirus和Marburgvirus。的Marburgvirus马尔堡病毒属包含一个单一的物种:维多利亚湖(LVMARV)。的Ebolavirus属的四种埃博拉病毒(EBOV):扎伊尔EBOV (ZEBOV),苏丹EBOV (SEBOV)、莱斯顿EBOV (REBOV)和科特迪瓦EBOV (ICEBOV)。在乌干达最近爆发之后,提出了种EBOV(五分之一1]。

丝状病毒包膜,nonsegmented,负链RNA病毒。病毒粒子组成一个核心ribonucleocapsid周围复杂的脂质包膜来自宿主细胞的质膜。7 ~ 19 kb非传染性的基因组编码结构蛋白与基因顺序如下:3′领袖,核衣壳蛋白(NP),病毒粒子结构蛋白(VP) 35 (VP35),一个矩阵VP40蛋白、糖蛋白(GP),两个额外的结构蛋白VP30, VP24, L依赖RNA的RNA聚合酶蛋白,5′拖车(2]。VP24和VP35显示作为干扰素拮抗剂(3]。研究采用重组复制系统表明,转录/复制MARV需要三四个蛋白(NP、VP35 L),而转录/复制EBOV要求所有四个蛋白(4]。EBOV和MARV病毒编码I型跨膜糖蛋白(GP)负责绑定和病毒进入宿主细胞,是唯一已知蛋白质位于病毒粒子的表面和感染细胞,保护性抗体的可能目标。

丝状病毒引起人类急性出血热严重,高死亡率。疾病发病突然,开始发烧,乏力,发冷、食欲不振、肌肉酸痛、头痛。这些可能是紧随其后的是腹痛、恶心、呕吐、咳嗽、喉咙痛、关节痛、腹泻、和死亡发生出血,休克。斑丘疹的皮疹通常发展5到7天的疾病。死亡率在疫情范围从25%到90% (5,6]ZEBOV引起广泛的病理学和有死亡率最高。病毒是遍布全身的,但浓度最高的肝、肾、脾和肺。丝状病毒主要在单核吞噬细胞(复制7,8)和诱导生产感染细胞的促炎细胞因子(9),这或许可以解释淋巴器官的损害。

filovirus感染暴发的无法预测,尽管越来越多的证据表明,蝙蝠等,也许原则中,天然水库和/或向量(s) (10,11]。包括人类痛苦这些疾病造成疾病流行,病毒也有潜在的意外来自流行地区的进口。此外,丝状病毒是稳定的,可以感染性气溶胶、口腔和结膜路线(8,12- - - - - -16]使他们一个生物武器问题。支持性护理仍在自然或治疗病人感染的唯一选择故意疾病暴发。因此,重要的是要开发疫苗和疗法可以预防,曝光后,或治疗的设置。

2。Filovirus疫苗和疗法

有几个有希望的候选疫苗被证实具有免疫原性和有效性在疾病动物模型。这些平台包括委内瑞拉马脑炎病毒样(三角)复制子(VRP),腺病毒5 (Ad5),水泡性口炎病毒——水疱性口炎病毒(-)为基础的疫苗,和病毒样颗粒(一种)17,18]。在早期的研究中,传统的方法是尝试filovirus疫苗减毒或灭活病毒的准备工作;然而,保护灵长类动物模型显示变量和温和的成功加上回复突变体的风险或不完整的失活导致这些方法被接受为未来人类使用(19- - - - - -27]。遗传、virus-vectored和亚单位疫苗已近年来评估。早期出版物报道部分完成防止病毒的挑战在啮齿动物基因枪管理包含GP基因DNA质粒,但是提供不完整保护额定马力(19,28,29日),但最近,Geisbert等人展示了完整的保护MARV使用DNA疫苗的方法(30.]。纯化glycoprotein-based候选疫苗在豚鼠迄今显示适度的成功虽然质量、效力和纯度这些蛋白质制剂是不清楚的28,31日,32]。基于矢量的方法包括replication-incompetent v字形的病毒经由replication-incompetent adenoviral (Ad5)载体疫苗,以及生活重组virus-based方法使用水泡性口炎病毒(VSV)或副流感病毒显示重大承诺在啮齿动物和额定马力模型(23,26,33- - - - - -43]。候选疫苗,到目前为止,已经发现免疫原,通常是糖蛋白,建立了最小有效剂量,最重要的是证明疗效filovirus猕猴模型高度敏感的疾病。在几乎所有情况下成功的疫苗接种,协会与filovirus-specific免疫球蛋白与保护已被确定(44]。

目前,没有医疗干预批准治疗filovirus感染人类和当前护理支持医疗标准(如补液、输血、抗生素预防继发感染)(45]。多种方法已经被测试和演示部分完成保护杀伤力在非人灵长类动物模型包括治疗coagulopathic素质利用线虫抗凝蛋白c2(一种组织factor-initiated血液凝固的有效抑制剂)(46]或重组人体活化蛋白C(广泛的coagulation-modulating活动)(47),免疫调节剂等人体活化蛋白C (47)治疗性疫苗(48- - - - - -50],gene-specific抗病毒药物(51- - - - - -54]。VSV病毒系统已经被证明可以提供高度可靠的保护当管理在曝光后设置和非人灵长类动物可能诱发特异性的天生的刺激和特异性免疫(48- - - - - -50]。抗病毒药物如核和phosphodiamidate吗啉代寡聚物,直接抑制EBOV或MARV复制似乎也导致候选人基于成功治疗高致命性filovirus感染疗效研究在额定马力51- - - - - -54]。在所有情况下,峰值降低病毒载量与更有前途的结果在人类和额定马力(51,55]。

在这次审查中,我们总结了近期调查的结果对EBOV细胞反应和其重要性从致命的filovirus生存挑战。理解这些病毒引起的保护性免疫反应和免疫病理可能filovirus疫苗的发展平台和关键潜在filovirus-infected个人曝光后治疗策略。

3所示。全球Filovirus感染后免疫反应和免疫相互作用

3.1。Filovirus感染期间受损的先天免疫反应

先天免疫系统识别并有效地消除病毒感染的基石;微生物的快速检测和随后激活宿主先天免疫反应的关键是开发有效的适应性免疫入侵的病原体。抗原递呈细胞包括单核细胞、巨噬细胞和树突细胞(dc)是中央在激活先天免疫和适应性免疫的起始。抗原递呈细胞驱动免疫反应的诱导细胞因子和趋化因子;抗原呈现;与B、T和NK细胞;和直接细胞毒性活动对靶细胞(56,57]。几个关键观察支持先天免疫的重要作用filovirus感染。

首先,幸存者filovirus感染早期血清趋化因子和短暂的上升,表明先天免疫系统感应(58- - - - - -63年]。在最近的一次和相对较大的研究EBOV-infected个人,nonsurvivors开发极高水平(5 - 1000 x)的促炎细胞因子(il - 1βIL-1RA il - 6,引发,IL-15 IL-16)和趋化因子(MIP-1α,MIP-1β,MIF MCP-1 IP-10 GRO -α和eotaxin)发病后不久就开始上升,持续到最后抽样死前2 - 3天内(63年]。感染单核细胞和巨噬细胞可能是炎症反应的主要介质产生的细胞因子和趋化因子的分泌增加内皮细胞层的渗透率,导致休克诱导(9,64年]。有趣的是,幸存者和non-survivors不不同血清水平的适应性免疫的重要监管机构如干扰素-α干扰素-γ,il - 12、IL-17或肿瘤坏死因子(63年]。一直与这些发现,丝状病毒编码干扰素拮抗剂VP24 VP35,阻止干扰素生产和抑制下游干扰素信号(65年]。

第二,丝状病毒逃避免疫系统通过阻止DC的成熟,先天和适应性免疫的基石66年,67年),以及编码多个病毒蛋白,加入逃避干扰素反应(了65年])。这些数据表明,EBOV可能会阻止DC成熟后感染,从而抑制活化的淋巴细胞和消除那些最有可能的子集的一个有效的应对病毒。EBOV和MARV容易感染和快速复制在抗原递呈细胞如单核细胞、巨噬细胞和DCs导致生产大量的子代病毒(9,64年,66年- - - - - -70年]。EBOV-infected猕猴,循环HLA-DR +细胞数量的增加10倍的血液感染后表明DCs可能传播病毒感染后全身贩卖从感染的网站(71年]。尽管循环,增加数字DCs被丝状病毒感染不成熟或成为激活,因此,未能引起适当的NK - B -,在感染后T细胞反应(66年,67年]。单核细胞和巨噬细胞的活动也可能提供,虽然响应的单核细胞和巨噬细胞在filovirology filovirus感染是一个分歧的问题(9,64年,66年,70年]。当然,抗原呈递细胞功能障碍的下游的影响是深远的,明显缺乏适应性免疫指出filovirus感染死亡病例。

第三,激活和维护自然杀伤(NK)细胞似乎是至关重要的防止致命filovirus感染(50,72年,73年];然而,NK细胞和其他淋巴细胞耗尽在filovirus感染人类和额定马力(55,59,60,71年]。消失的NK细胞和T细胞外围的人由于凋亡未知的机制,虽然Fas和FasL交互可能涉及(14,55,63年,74年]。NK细胞的潜在相关性与快速保护filovirus出血热、rVSV疫苗在曝光后引起的治疗在非人灵长类动物研究,观察(73年]。一种也能导致快速和强大的先天免疫反应在啮齿动物中注入一种挑战与EBOV(前1 - 3天72年]。注射一种招募了几乎两倍的数量在纵隔淋巴结和脾脏NK细胞与动物相比仅接收PBS (72年),这表明车牌区域政府诱发NK细胞增殖和/或贩卖淋巴组织VLP-pretreatment的老鼠缺乏功能性NK细胞(75年]或老鼠耗尽使用antiasialoGM1 NK细胞的抗体并没有从EBOV感染,保护与VLP-injected野生型C57Bl / 6小鼠(72年]。此外,过继转移NK细胞刺激的一种保护天真的老鼠对EBOV感染和保护先天免疫的机制需要穿孔素,但不是干扰素-γ,(72年]。最近,Wauquier等人提出了一个杀手的角色免疫球蛋白受体(吉珥)曲目的患者感染EBOV致命的结果。吉珥表面表达参与激活NK细胞和T细胞和NK细胞(63年,76年]。总之,这些数据点为NK细胞生存的一个关键的角色filovirus感染并建议NK细胞的杀伤“杀手”功能是一个重要的机制在促进生存从EBOV感染。

Subversion的先天免疫结合滞后在激活适应性免疫反应可能导致失控,传播,filovirus感染(66年- - - - - -68年]。

3.2。Filovirus B和T细胞的感染作用

受感染的人屈服于filovirus感染无法挂载大量细胞或体液免疫反应。在non-survivors、激活免疫细胞和分泌细胞因子和趋化因子在感染早期发现;然而,这些早期的细胞反应似乎减毒,不检测的死亡而促炎细胞因子和趋化因子的水平达到巨大的水平在一个致命的结果。死亡病例filovirus出血热相关联的标记缺乏可检测适应性免疫。出现症状后,一个巨大的CD4的损失⁺和CD8⁺T细胞发生。在疾病死亡病例,总值CD4的数量⁺和CD8⁺T细胞是大大减少non-survivors相比幸存者(6 - 10%和20 - 40%,分别地。(63年])。同样,在猕猴猕猴模型EBOV出血热、CD4细胞⁺和CD8⁺淋巴细胞数量迅速减少60 - 70%在第一在感染后4天(71年)和T淋巴细胞亚群的表型分析表明缺乏一个健壮的感染的免疫反应。在非人灵长类动物模型中,CD8细胞凋亡⁺感染的T细胞观察2天内。类似的发现在nonsurvivor和非人灵长类动物,屈服于filovirus人类感染病例显示增加的表达CD95 (Fas)表明细胞凋亡的机制涉及Fas / Fas-L级联(63年,71年,77年]和Fas和FasL的upregulation和小道都观察到filovirus-infected pbm或单核细胞的细胞(78年]。有趣的是,CD20的数量⁺B淋巴细胞在血液里似乎没有显著改变filovirus感染后使用非人类灵长类动物感染模型尽管明显缺乏特异性免疫球蛋白在非人灵长类动物和nonsurviving人类患者(55,71年]。

EBOV幸存者,显然早期和调节炎症反应迅速,后跟一个检测T细胞反应增加标记显示激活的细胞毒性T细胞(CTL) [55,58,63年]。同时检测T细胞反应,早期和瞬态IgM会增加EBOV幸存者的EBOV-specific IgG水平(55,58,79年]。幸存者开发快速免疫反应,可能明确循环EBOV早,表明迅速感应适当的免疫反应在人类从filovirus感染会导致生存55]。

机械的研究关于B和T细胞的作用是困难的在非人灵长类动物模型;因此,许多研究B和T细胞的作用防止致命filovirus疾病进行使用要求提供mouse-adapted EBOV的小鼠模型(应变致命疾病(80年])。两个CD4⁺和CD8⁺在血液和脾脏T细胞耗尽EBOV感染的老鼠,显然是由于细胞凋亡,类似于人类和非人类灵长类动物;然而,随后的研究表明,T细胞功能保持在剩余的细胞尽管数量巨大的损失(81年,82年]。功能性CD8的数量⁺T细胞在晚期阶段生成的感染可能太低,控制病毒滴度高,尽管他们是充分的转移到新被感染的动物控制疾病和感染造成的损害可能过于严重时克服自适应免疫系统可以挂载响应(82年]。淋巴细胞凋亡的机制使用的小鼠模型研究了EBOV看来,内在和外在的凋亡通路发挥作用,正如由感染各种基因敲除小鼠模型(83年]。与额定马力EBOV模型,小鼠感染mouse-adapted EBOV循环B细胞急剧下降尽管在感染后脾脏B细胞的数量保持不变(81年]。古普塔等人证明CD8的至关重要的作用⁺T细胞的初始间隙中小学感染后病毒(84年]。在这项研究中,他们还表明,CD4细胞⁺T细胞和抗体被要求立即保护但在B细胞和CD4的缺失⁺T细胞,病毒抗原检测后晚期感染和发病率也是死后很长时间内观察到正常时间(84年]。这些鼠标数据显示,虽然直接控制filovirus感染可能通过CD8⁺和CD4 T细胞,B⁺T细胞是重要的长期控制病毒复制的(并可能清除)。

4所示。从Filovirus感染免疫机制的保护

4.1。体液反应和抗体保护Filovirus感染的作用

被认为重要的体液反应一直对病毒感染的保护性免疫,事实上,所有这些疫苗证明提供100%额定马力免受致命的挑战已经证明能够驱动filovirus-specific免疫球蛋白(44]。Ad5重组疫苗,生存可以可靠地预测当一个接种额定马力达到一定的免疫球蛋白浓度测定,表明这可能是一个潜在的预测标志的保护(85年]。车牌区域的疫苗,接种B cell-deficient老鼠不山抗体反应和不免受致命filovirus挑战86年)和类似的免疫球蛋白g抗体GP和保护之间的关系从挑战VLP-vaccinated额定马力是观察ZEBOV和MARV(未发表的观察)。

大量的精力都集中在抗体的被动转移来实现保护和展示的明确要求中介免受filovirus感染的抗体。被动转移含有抗体的血清或纯化免疫球蛋白特定EBOV或MARV在啮齿动物疾病模型(可以提供保护87年- - - - - -90年];据报道偶尔在额定马力模型(27,85年,91年- - - - - -93年]。可能是假设无法日期一再证明保护额定马力使用免疫抗体疗法是治疗剂量和频率限制,尽管细胞组件可能保护的关键是抗体疗法的一部分还是诱导自然感染后。血清抗体研究集中在诱发的多克隆抗体或单克隆抗体EBOV或MARV GP (87年- - - - - -90年]。为其他病毒蛋白抗体特定一直在挑战失败在啮齿动物的研究(94年,95年]。

成功保护后免疫治疗后,新创被动转移动物的免疫反应观察。最明显的特异功能的T细胞反应的诱导其他病毒蛋白没有出现在原始的被动转移剂据报道强调保护的T细胞反应的作用即使在被动转移(96年]。在这些模型中,抗体可能提供了控制病毒复制新创功能和特异性T细胞反应产生限制和清除病毒感染。研究正在进行中,以更具体地说,彻底评估抗体治疗方案在额定马力模型和评估后续治疗宿主的免疫反应。

4.2。作用的T细胞在保护效力Filovirus出血热

诱发的保护的一个关键作用是确定车牌区域的T细胞疫苗接种的α/β- t细胞缺陷小鼠和进一步完善CD8的绝对要求⁺T细胞通过β2 m-deficient老鼠[86年]。此外,多个CD8⁺CTL epitope-specific反应EBOV和MARV老鼠已确定(86年,96年,102年),表中进行了概括1和2。深入研究小鼠的CD8 T细胞反应、小鼠接种VRP包含每个EBOV抗原(医生、NP、VP24 VP30, VP35, VP40;所有病毒蛋白除了聚合酶(96年])和CD8⁺T细胞特定的病毒蛋白被发现利用接种小鼠的脾细胞流式细胞仪检测细胞内细胞因子。CD8的过继转移⁺细胞毒性T细胞进行使用由肽细胞扩大引发刺激,这些研究证明它有能力保护天真的老鼠从EBOV挑战。麦夫GP和NP-specific CD8的转移⁺T细胞也可以提供保护天真的致命感染小鼠(102年]。重要的是要注意,在这些研究中其他CD8⁺T细胞表位特异性反应被发现但不证明保护;然而,这些非功能性CD8⁺反应不太可能证明体外溶解性活动(96年]。这些研究表明过继转移的功能特异性CD8⁺T细胞反应可以在啮齿动物疾病模型提供保护。重要的是,初步数据也表明T细胞在病毒清除的作用在额定马力immunodepletion接种动物(91年]。通过目标T细胞表面抗原CD3马伯毒素共轭,FN18-CRM9,耗尽CD3传播⁺T淋巴细胞> 85%相对于水平开始,猕猴接种疫苗和治疗无关的免疫球蛋白g而不是那些动物接种ZEBOV GP-expressing腺病毒和CD3的枯竭⁺T细胞使用FN18-CRM9幸存下来,一个关键的角色使用这种基于腺疫苗[T细胞的保护91年]。自从CD8⁺对ZEBOV T细胞反应是观察猕猴与这种基于腺疫苗接种,作者运用CD8α有效地清除CD8 chain-specific抗体,cM-T807⁺细胞从血液、脾、淋巴结和肝脏。在这项研究中,四个五cM-T807以前处理和接种疫苗的猕猴屈从于ZEBOV同时所有天真的控制动物死亡,接种疫苗,而不是immunodepleted所有幸存下来。中可观察到显著降低保护cM-T807 immuno-depleted接种动物相比不是immunodepleted和接种疫苗;然而,一个扩展的时间死(运输大亨)观察比较immunodepleted时,接种猕猴(运输大亨天10 - 14)和两个天真的动物(运输大亨的第8天)。在一起,这些数据表明,CD8⁺T细胞是一个关键组成部分保护由GP-expressing重组腺病毒疫苗在ZEBOV挑战的背景下,但可能还有其他免疫机制(91年]。

研究也表明CD4的不那么重要的角色⁺T细胞在保护filovirus疫苗(86年),不幸的是,CD4细胞的作用⁺T细胞中没有评估上述机械研究灵长类的沙利文et al。91年)现有工作的重点是CD4的识别⁺T细胞反应和他们的角色在EBOV和MARV感染,尤其是考虑到他们的优势在接种反应人类[103年,104年]。

5。关键作用对致命的CTL反应防护功效Filovirus疾病

5.1。识别小说CD8细胞毒性t淋巴细胞抗原表位被EBOV MARV-Specific CTL

的发现和识别特异性细胞毒性t淋巴细胞抗原表位主要是基于计算机算法或重叠的使用病毒蛋白的合成肽。防护能力的细胞毒性t淋巴细胞特异性抗原表位已经证明在被动转移研究中,疫苗接种,在分析postchallenge小鼠的免疫反应(82年,86年,96年,102年]。有趣的是,固体过继转移CD8的保护效果⁺抗原表位与裂解功能密切相关,主要基于铬释放化验。改进算法、低成本重叠肽和HLA绑定四聚体和其他类的使用我的方法会帮助人类和额定马力响应的评估。未来的工作将集中在使用这些工具和新兴的工具来识别CD8⁺和CD4⁺在老鼠和CD8抗原表位⁺和CD4⁺T细胞反应额定马力和人类。

到目前为止,四聚物和类似技术的使用提供了分析CD8的能力⁺T细胞病毒epitope-specific频率、表型和功能的能力体外扩张。然而,疾病与猕猴模型,这种强大的方法是有限的因为各种各样的原因。首先,大多数疫苗的工作集中在使用的猕猴猕猴(猕猴属fascicularis)动物模型,有限的定义Mamu主要组织相容性复合体一级分子在细胞化验使用。第二,恒河猕猴模型(解剖)有两个亚种,中国印度恒河猴和恒河,已被证明有不同的遗传背景和不同的疾病结果等病毒感染艾滋病毒(105年- - - - - -108年]。最重要的是,常见的试剂Mamu类(即我单用于其他疾病。艾滋病毒)在中国很少见到恒河亚种filovirus研究中使用。切换到印度恒河猴可能改变疾病,被认为与猕猴与恒河猴,将使未来的研究变得复杂,因为亚种可用性比中国更有限的恒河。因此,更好的定义Mamu类我单和发展共同Mamu类的细胞分析将是未来的研究来识别的关键重要的T细胞反应保护猕猴。

5.2。潜在的ctl在额定马力的Cocorrelate保护研究

不致命的感染或免疫主机生成复杂的响应,其中包括先天和适应性免疫系统的怀抱。filovirus疫苗,成功的疫苗接种产生保护性免疫反应保护动物免受致命病毒的挑战。虽然抗体反应和细胞反应监测在过去的研究中,分析这些反应是次要的目标评估候选疫苗在动物模型的疗效。虽然我们不确定B和T细胞反应的贡献在疫苗接种,集体数据显示,都是病毒所必需的间隙(44,85年,86年]。目前,已经把重点转移到推进相关的发现(s)和代理(s)化验接种疫苗后的免疫。这些步骤的关键推动疫苗通过美国食品及药物管理局“动物规则”许可并最终人类使用的疫苗(s) (109年]。

疫苗接种成功之后,适应性反应的糖蛋白包括体液免疫和细胞免疫反应(44]。在实验室现有的化验都依赖评估抗体滴度和细胞(CD4细胞的反应⁺和CD8⁺疫苗接种或病毒接触后T细胞反应)。评估抗体反应,病毒GP-specific IgG抗体滴度已经被量化评估抗原ELISA和评估这些反应在virus-neutralizing化验的功能85年]。在老鼠身上,回顾在大多数额定马力研究中,抗体滴度对EBOV GP和T细胞反应相关与成功的疫苗接种(96年]。然而,这些化验并不总是预测高效价nonprotective抗体反应已经观察到(未发表的观察)和nonneutralizing但描述了保护性抗体反应(87年]。因此,作为描述沙利文等。,T细胞反应,提出了从动物接种疫苗与抗体cocorrelate数据(85年]。

5.3。CTL化验Filovirus疫苗研究的现状:衡量“好”的细胞免疫反应

没有评估ELISA抗体滴度,研究T细胞疫苗接种后反应预测out-bred人群使用时,特别是猕猴。这可能是由于测量的复杂性细胞免疫接种。测量细胞免疫反应是很困难的因为化验是非常艰苦的,乏味的,难以复制的,而且昂贵。同样,免疫原质量(多肽或蛋白质)用于分析至关重要,目前为丝状病毒知之甚少。与大多数体液检测、细胞分析通常执行体外,可能需要在体外刺激,自体靶细胞的制备,需要很难获得试剂和设备。此外,这些化验是最佳的性能标准新孤立、不冻存外周血单核细胞(PBMCs)。测量细胞反应的能力,最大化的化验一直利用评估效应CD8的函数⁺和CD4⁺T细胞。细胞反应的分析确定了各种方法包括T细胞增殖(化验(LPA)淋巴增生),铬释放化验,化验有关酶联免疫斑点)(酶联免疫吸附点,干扰素释放试验,细胞内细胞因子染色(ICC)化验。

到目前为止,LFA和铬释放化验仅限于评估免疫反应在啮齿动物和主要在老鼠身上。lfa跑车是独一无二的,因为它们允许CD4的评估⁺和CD8⁺或者当分离CD4⁺或CD8⁺T细胞增殖。在放射性(即。,thymidine) or nonradioactive molecules, which are incorporated into DNA during proliferation, a stimulation index can be determined for a protein or peptide antigen. Similarly, the chromium release assay is a means to measure specific lysis of target cells expressing antigen by CD8⁺T细胞;然而试验主要局限于研究与明确的MHC系统和主要分析接种in-bred小鼠的T细胞反应。

的两个主要分析利用猕猴有关酶联免疫斑点,基于icc已经化验。两个化验提供总T淋巴细胞反应的半定量分析或分析指标的T细胞激活细胞因子等生产体外从诱发T细胞或病毒感染后具体的反应。有关酶联免疫斑点或集成电路,在细胞因子产生的百分比(干扰素γ、2或TNF -α)CD8⁺或CD4⁺T细胞是(41,48,110年- - - - - -112年]。

有关酶联免疫斑点试验的被许多人认为是一个黄金标准监控特定的细胞免疫反应,尤其是在人类。分析可以检测单个细胞分泌分子主要细胞因子后接触特定抗原(112年- - - - - -114年]。总体分析是高度敏感的,量化,易于使用,适合高通量(115年]。干扰素的γELISPOT已广泛应用于其他疫苗的努力(即。,HIV, Tuberculosis) to assess the quantification and characterization of the CD8⁺T细胞反应(113年]。因此它有几个独特的优势包括以下(1),它提供了一个可靠的和合适的方法直接测量抗原T细胞与有限体外扩张的细胞试验期间,(2)它通常需要更少的细胞和可以利用冻存细胞,(3)已经提供类似的免疫反应相关评估猕猴和人类(116年),和(4)设备要求低,整体不如ICC化验技术上难以执行。尽管许多积极的属性分析,分析在啮齿动物的研究预测,但低于其他细胞化验。(96年]。此外,这个试验的预测能力在人类以来已经成为可疑的方法不准确预测在最近的艾滋病疫苗疫苗保护小道(117年]。有关酶联免疫斑点化验试剂和改进多维的潜力,双颜色有关酶联免疫斑点检测细胞因子(118年)可能会增加在未来这种方法的价值。

国际刑事法庭的方法已经在猕猴评估细胞反应的的主要方法。到目前为止,这些化验依靠三到四色流式细胞术。在这些化验,辐照病毒重组蛋白或重叠肽被用来刺激啮齿类动物或猕猴PBMCs体外(41,86年,96年,102年,119年,120年]。正如预期的那样,有许多“积极的”疫苗接种后反应,可能由于绝大激活特定和nonantigen-specific(即。,vector directed responses) lymphocyte responses generated after antigen exposure by the various vaccine platforms which often involve a viral vector or adjuvant. As described by Sullivan et al., we have also observed low CD4⁺和CD8⁺T细胞反应(试验检测的极限附近)或不一致疫苗接种后观察到的反应相同的猕猴([120年)和未发表的数据),因此,这些反应的可靠性受到质疑的反应很少持续观察升压接种疫苗后,挑战,或在康复的动物。传统的体外评估后的细胞免疫疫苗接种可能缺乏所需的灵敏度检测细胞免疫的相关决定因素和无法区分的功能属性(内存或效应表型)观察到的响应。此外,抽样血容量限制严重损害分析疫苗接种后可以实现的实验动物模型。out-bred模型的使用是更加困难比纯系小鼠的研究由于描述模型和内的各种一起进一步复杂化的缺乏监测细胞反应的试剂。例如,虽然有分析CD8易得的方法⁺in-bred小鼠T细胞反应与MHC类我四聚物分子技术,有有限的试剂用于猕猴监控病毒特异性细胞免疫。

新的、更加精准的方法分析细胞免疫提供承诺更细节的T细胞表型和功能的评估。另一个新兴的方法来测量细胞反应是多参数流式细胞仪的使用。上述技术用于丝状病毒揭示细胞反应性病毒蛋白(s);然而数据缺少关键信息,可以区分“好”或nonprotective免疫力。因此,问题是相对容易获得数据的值(抗原)反应的剧烈程度和难度分析确定的敏感性和特异性免疫反应。后来方面一直难以评估在过去,可以昂贵的获得。分析响应的大小和质量最好的描述了王妃等人发展的多色流式细胞术方法评估T细胞频率和,更重要的是,T细胞质量在内存和效应细胞(121年,122年]。关键在于抗原T细胞的克隆扩张导致人口异构的抗原决定基/抗原特异反应。这些细胞不同considerabl功能能力和一些甚至可能缺乏功能由溶解性活动。因此,分析有关酶联免疫斑点或有限的ICS,“大小”的信息时,缺乏关键的功能信息。即使在细胞的功能子集,有各种不同功能的细胞可能与一些工作分解效应细胞和其他负责组织免疫反应(特定的细胞因子和chemo-attractant生产商),其他克隆促进扩散所需的克隆和其他免疫细胞反应。

不幸的是,我们理解这些不同的细胞功能子集还不清楚。因此,一个“好”疫苗细胞反应只能根据经验使用动物模型(s),然后翻译给人类使用。王妃等人开发的分析定义了一个方法,允许采样异质种群的抗原细胞和它们的相对功能的能力。Multiparametric流式细胞术方法允许同时T分析的几个参数(~四到五参数和增长122年])。这些参数通常与特定功能的能力。给定资料可以关联到保护T细胞反应相比,不受保护的人或动物。这项技术的使用使得异质细胞群体的评估与他们在HIV病毒载量。例如,在给定淋巴细胞轮廓建立了艾滋病病毒载量在长期non-progressors (LTNP)与不寻常121年]。在这些研究中,T细胞的一个子集multicytokine最大的生产能力与病毒抑制有关。化验,B和T细胞表型可以评估精度在单细胞水平上利用标记的血统,归航概要文件和内存表型。这种表型可以进一步定义如效应器功能配置,内存或可以表达多种细胞因子(即。肿瘤坏死因子-α、2和正-γ)。

在初始工作沙利文et al .,他们认为,类似的资料存在保护性反应丝状病毒(85年),这种方法可能是有用的在弥合临床前猕猴研究人类临床研究。虽然prechallenge血清抗体滴度(免疫球蛋白对全科医生的ELISA)有相当好的预测为几乎所有的疫苗在接种猕猴生存平台测试,使用多参数流式细胞术分析特定的细胞免疫表型和功能标记似乎增强疫苗接种后的预测能力保护(85年]。因此,使用额外的免疫相关,如细胞免疫检测可能是有用的在疫苗许可尤其是疫苗是评估在临床研究动物和人类的翻译保护物种之间可能会有所不同。类似于研究描述与rAd5-based疫苗,我们自己的研究与车牌区域,v字形replicon-based疫苗表明病毒特异性T细胞(CD4细胞的能力⁺和CD8⁺)产生两个或两个以上的细胞因子和免疫球蛋白浓度对病毒GP与保护性免疫相关(未发表的观察)。使用这种类型的化验检查以下讨论人类filovirus疫苗的反应。虽然能够利用新方法来评估细胞化验等多参数(> 10颜色)流式细胞仪和质谱分析方法评估细胞反应似乎是重要的监测prechallenge反应接种动物,使用这些类型的化验filovirus-challenged动物在许多高级别控制实验室技术限制。新的生物安全级别-(声波测井)4设施设计,优化分析,和小型化的设备应该允许测量细胞反应目前不切实际。

5.4。人类Filovirus疫苗研究:一个机会评估ctl的角色

由于filovirus出血热的本质,人类功效试验是不道德的。临床测试工作的主要目标filovirus疫苗的安全性和免疫原性不同剂量水平的候选人filovirus疫苗(85年]。FDA批准filovirus疫苗广泛(非紧急)使用在人类需要通过FDA许可“动物规则”指导有重要功效研究动物(自动额定马力最密切模仿人类疾病模型)与临床试验同时进行,从而使关联或代理中确定标记的保护动物与人类的候选疫苗的性能(85年,109年]。到目前为止,已经有两个出版物NIAID的疫苗研究中心,国家卫生研究院的有关临床试验的安全性和免疫原性DNA和adenovirus-based filovirus疫苗(103年,104年]。

filovirus疫苗的临床试验,27个受试者接种剂量研究有四层0,2、4、8毫克的DNA给出三次>[21天的间隔103年]。DNA疫苗是由三个质粒组件编码ZEBOV SEBOV GP或ZEBOV NP。疫苗通常welltolerated只有一个主题2毫克剂量组和两个科目8毫克剂量组没有得到所有三个注射。在所有接受埃博拉病毒的DNA疫苗,疫苗病毒特异性抗体反应观察;然而,并不是所有三个组件对象生成的抗体以免疫印迹和ELISA (103年]。所有的患者产生可检测virus-neutralizing抗体(103年]。T细胞反应进行了测试使用细胞内细胞因子染色有关酶联免疫斑点试验(ICS)和更强的反应比ZEBOV GP SEBOV GP和ZEBOV NP是最少的免疫原性。CD4⁺T细胞反应观察在审讯期间所有疫苗接种者;然而,CD8⁺T细胞反应观察较少(100%比30%),在一个较低的程度上103年]。在证明这个试验的结果令人鼓舞的安全性和免疫原性在人类中,DNA疫苗没有被证明对额定马力EBOV感染提供完整的保护。

在第二个临床试验,5 replication-defective腺病毒血清型(Ad5)疫苗表达ZEBOV和SEBOV GPs测试在31个人类志愿者与23日收到Ad5疫苗(104年]。三组患者服用两剂疫苗之一(2×10⁹或2×10¹⁰副总裁,例如“低”和“高”剂量,resp)或安慰剂给一次肌内天0和志愿者随访48周(104年]。温和的本地站点反应被发现在大多数患者接受疫苗(15 23和1 8安慰剂组)和轻微到严重系统性症状观察48% 23(11)的疫苗接种者25%(两个八有轻度全身反应)的接受安慰剂注射。疫苗接种后4周,58%和100%的低收入和高剂量疫苗接种者,分别是阳性抗体SEBOV全科医生,50%和55%的低收入和高剂量疫苗血清反应阳性的供ELISA ZEBOV GP。总体而言,抗体反应通过48周保持在低剂量组42% (SEBOV GP)和33% (ZEBOV GP)疫苗接种者和60% (SEBOV GP)和40% (ZEBOV GP)疫苗接种者的高剂量组。没有安慰剂组中观察到阳性抗体反应。先前存在的免疫Ad5似乎影响疫苗接种的结果,作为Ad5-seronegative对象有一个抗体滴度显著提高,以及反应率,相比Ad5-seropositive科目。有趣的是,有关酶联免疫斑点试验评估使用大量T细胞反应,稍高的回应率是观察低剂量的疫苗接种者相比,大剂量疫苗接种者(27%比25% SEBOV GP和45%比25% ZEBOV GP, resp)。在4周postvaccination。相比之下,GP-specific CD4反应被认为在42%和82%的疫苗接种者在低收入和高剂量组SEBOV GP和ZEBOV GP疫苗接种者的33%和64%。总的来说,CD8 T细胞反应明显低于8的CD4 T细胞反应和9%的低收入和高剂量疫苗接种者在检测CD8 T细胞反应SEBOV GP和0和27%的低收入和高剂量疫苗接种者有CD8 T细胞反应ZEBOV全科医生在4周后接种疫苗。T细胞反应的速率在疫苗接种者似乎不受现有免疫Ad5,虽然志愿者在T细胞反应的数量很低(104年]。

报告第一两个filovirus疫苗的临床试验显示能成功诱导filovirus-specific体液和细胞反应103年,104年]。分析用于检测T细胞反应EBOV疫苗的临床试验前两个是ICS有关酶联免疫斑点试验(流cytometry-based)和(103年,104年]。在这两种分析,大多数免疫原性组件是SEBOV GP。最普遍的反应CD4的发现⁺使用ICS测定T细胞,检测到。ICS试验似乎是更敏感的有关酶联免疫斑点试验相比,在更少的个人检测T细胞反应(103年,104年]。鉴于vaccine-mediated明显的重要作用的T细胞保护,使用T细胞分析在评估filovirus疫苗的免疫反应也将在人类临床试验和重要关键动物药效试验。这些高度技术性的挑战将是桥接和复杂的化验使用大型三期免疫原性研究,采集大量的样本在多个研究站点可能会需要。

6。结论和未来的发展方向

因为他们的杀伤力和其他关键属性描述丝状病毒作为生物武器的威胁,集中精力发展医疗对策已经针对EBOV和MARV感染(123年]。随着疾病的小鼠模型的发展80年,124年),检查和消耗的试剂特异性免疫细胞群在非人灵长类动物,和成功的疫苗和疗法,戏弄保护性免疫反应的能力已经开始(85年]。尽管体液反应病毒显然很重要,越来越多的证据表明filovirus-specific CD8⁺ctl是必要的病毒控制和间隙(86年,96年]。角色的T细胞在保护被评估为多个候选疫苗进行额定马力疗效试验,最终,在临床试验志愿者。尽管我们学会了很多关于的后果要么不足或健壮的CTL反应在各种动物模型接种疫苗或感染后,很少有数据可以从人类幸存者EBOV或MARV。T细胞与相关性分析必须开发未来人类临床研究。人体试验需要健壮的化验监测免疫反应的最终许可人类使用filovirus疫苗(s)。为此,进一步调查自然filovirus感染和免疫反应的活性免疫人类必须继续和扩展。

确认

作者感谢塞布丽娜Stronsky参考援助和支持。澳林格博士是美国支持的军队和国防威胁降低机构融资开发化验病毒感染后评估保护性反应。意见、解释、结论和建议是作者的,不一定是支持由美国陆军。

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