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国荣顾,Weizhong Cheng Chenling姚明,小君,朝阳,安德鲁·拉奥劳伦斯日圆,马修·Ku Jianyu饶, ”定量蛋白质组学分析等压标签的相对和绝对定量识别Lumican作为一个潜在的急性主动脉壁夹层形成的标志”,生物医学研究的国际, 卷。2011年, 文章的ID920763年, 10 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1155/2011/920763
定量蛋白质组学分析等压标签的相对和绝对定量识别Lumican作为一个潜在的急性主动脉壁夹层形成的标志
文摘
急性主动脉夹层(AAD)是一个严重的血管疾病。目前诊断依赖于临床和放射手段而血清生物标志物是缺乏。本研究的目的是为油气识别潜在的血清生物标志物使用等压标签进行相对和绝对定量(iTRAQ)的方法。总共有120份血清样本收集的三组:AAD患者(),患者急性心肌梗死(AMI,)和健康志愿者(),而每组的前10样本用于iTRAQ分析。使用iTRAQ方法,共有174个蛋白被鉴定为AAD的病人和健康受试者之间明显不同。其中,46个蛋白质增加超过两倍,整个120例使用血清样本进行全面的分析表明,Lumican水平显著增加相对于控制和AMI样本。此外,Lumican水平与时间从发病到入院AAD但不是AMI样本。使用iTRAQ方法,我们的研究表明,Lumican可能潜在AAD-related可能协助诊断AAD的血清标志物。
1。介绍
急性主动脉夹层(AAD)已成为治疗的疾病由于新治疗方法的最新进展的心脏和动脉疾病的管理;然而,快速发展和经济诊断方法仍然是一个挑战。可变性在疾病的显示常常模糊诊断和成像技术如计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)和食道超声仍禁止由于成本和可用性。主动脉夹层仍然是一个频繁的目标法医学的诉讼指控的故障诊断对治疗医生和医院(1]。一些进展的生化诊断AAD已经在过去的十年里2,3];一些急性期蛋白质和凝固参数确定增加AAD的病人,但是这些是特异性的生物标志物对于广告,因为他们可能也会异常表达的其他疾病如急性心肌梗死(AMI)条件。
最近定量蛋白质组学分析,等压标签进行相对和绝对定量(iTRAQ),已经开发和利用来确定各种疾病生物标志物条件(4,5]。这个化学标记方法涉及到稳定的同位素标记试剂胺,然后可以可靠地检测到质谱,从而允许各种蛋白质定量比较多路复用方式。有人建议适合生物标志物的发现在一个广泛的体液和组织,包括血清和血浆(5,6]。用这种方法,我们希望找到的潜在生物标记释放主动脉媒体的干扰,可以提供足够的诊断特异性和时间窗口法。
2。材料和方法
2.1。样品
这项研究包括共有30个人和90例健康(60操弄,30 AMI)。所有的患者都选择以连续的方式从2009年7月到2011年11月复旦大学附属中山医院(上海,中国)。iTRAQ分析第一20例(10 AAD和AMI)和10个健康的人。所有患者后72小时内提出一集的胸部和/或背部疼痛持续5分钟以上。AAD的诊断证实了计算机断层造影(CTA)。证实了AMI患者心电图(ECG)、心肌肌钙蛋白T (cTNT)测试。所有的病人给他们研究的知情同意。协议是中山医院的伦理委员会批准。
对于每一个研究主题,全血样品立即收集在BD海温管真空采血管(双相障碍诊断,普利茅斯,英国)承认,在4000转离心10分钟后在室温下。血清被冻结并存储在整除−80°C到分析。
2.2。血清c反应蛋白和肌红蛋白测试
体外5.1 FS自动生物化学分析仪(强生(Johnson & Johnson);美国加州)用于血清c反应蛋白(CRP)测试,和Cobas e411免疫测定分析仪(罗氏公司;德国曼海姆)被用于血清肌红蛋白(肌)测试。然后,结果被解释根据测试的国际临床化学联合会(IFCC)推荐的方法。分析整个血液样本的离心后立即执行。
2.3。iTRAQ样品制备:强阳离子交换色谱(SCX)
iTRAQ试剂购买从应用生物系统公司(美国福斯特城)。14从血清样本干扰高度丰富的蛋白质被使用安捷伦多个关联删除液相色谱(LC) column-Human 14(火星)(日本岛津公司,京都,日本)。一百微克每提取使用丙酮沉淀−20°C和悬浮在20μL解散缓冲区(美国应用生物系统公司,培养)。减少和烷基化后,每个样本与胰蛋白酶消化(w(胰蛋白酶):w(蛋白质)= 1:20)在一夜之间37°C。胰蛋白酶的肽被贴上iTRAQ试剂如下:正常对照组组被贴上iTRAQ 113年,AMI组贴上iTRAQ 114和AAD贴上iTRAQ 115组。肽是汇集和脱盐Sep-Pak休假C18(美国水域,米尔福德)。肽混合物稀释了KH缓冲区包含10毫米2阿宝4在25%乙腈(ACN) pH值2.6。肽的分离20广告高效液相色谱法(HPLC)系统(日本岛津公司;日本京都)配备polysulfoethyl一列(2.1毫米×100毫米、5 u, 200;巢集团Southborough质量)。缓冲B是350毫米的成分氯化钾,KH 10毫米2阿宝4,25% ACN pH值2.6。分离进行了使用0 - 80%的线性二元梯度缓冲区B在缓冲区200的流量μL / min 60分钟。分数被合并成20组。
2.4。质分析
每个SCX分数被旋转真空浓缩器干下来,溶解在缓冲C (ACN甲酸0.1%,5%,95%水),并分析了Qstar XL(应用生物系统公司;促进城市,美国)。高效液相色谱梯度是5 - 35%缓冲D (ACN 95%, 0.1%甲酸)缓冲C 300 nL /分钟的流量为70分钟。分析调查扫描获得女士从m / z 400 - 1800 4前体为MS / MS选择从m / z 100 - 2000。
2.5。Lumican证实的ELISA分析
Lumican的确定的ELISA分析使用的工具执行CUSABIO生物科技有限公司,生产后的建议(CUSABIO生物技术有限公司,武汉,中国)。
2.6。数据分析
所有在SPSS 12.0统计分析(SPSS Inc .芝加哥,美国)。结果平均数±标准差。比较分析的多个组进行一维方差分析或Mann-Whitney /克鲁斯卡尔-沃利斯检验。被定义为统计意义。肽和蛋白质鉴定是由搜索MS / MS谱对使用本地蛋白质飞行员2.0.1 SwissProt数据库软件。只有肽与置信区间的值不低于95%(未使用ProtScore > 1.3)被用于蛋白质识别编译和随后的定量计算。褶皱的变化2 >或< 0.5被设置为截止值指定显著差异蛋白表达法组和正常对照组。
2.7。黑豹分析
黑豹数据库被用来阐明细胞组件,生物过程,与每个人相关的分子功能蛋白(http://www.pantherdb.org/)。
3所示。结果
3.1。研究对象的临床特征
AAD患者的临床特征,总结了AMI患者和正常对照组在桌子上1。没有年龄分布的差异和性别组成三组涉及ELISA分析()(和0.378,分别地)或iTRAQ分析(和0.873,分别地)。没有从发病到入院时间差异法和AMI组()。
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| 一个一维方差分析;b卡方检验;cMann-Whitney测试。 |
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3.2。由iTRAQ确定蛋白质的功能分类
共有174个蛋白质与置信区间值不低于95%的确认(未使用ProtScore > 1.3)。然而,在手动复查MS / MS数据彻底峰的峰,155(89.08%)的蛋白质相对定量的一个或多个肽。15蛋白质没有可量化的肽,可以确定,和四个蛋白肽与置信区间值小于95%。
总共174个蛋白质使用豹分类系统分类,哪些为各自类别根据其分子的蛋白质功能。主要的群体包括:信号分子(13%)、酶调节器(12%)、传输/载体蛋白(11%)和蛋白酶(10%)。其他组织包括:结构蛋白(1%)、细胞粘附分子(1%)、细胞骨架蛋白(3%)、细胞外基质蛋白(2%),和细胞连接蛋白(1%)。
来再确认iTRAQ试剂的定量的可靠性,血清c反应蛋白,Myo水平评估使用传统的生化和免疫测定测试和iTRAQ分析相同的标本。生化和免疫测定分析,c反应蛋白是41.31±32.76毫克/毫升,Myo AAD组为66.42±81.23毫克/毫升,在正常对照组,前者为5.88±1.42,后者为32.07±14.14毫克/毫升。c反应蛋白水平,Myo AAD患者高出7.03倍和2.07倍,分别比正常控制。使用iTRAQ, CRP, Myo的广告/正常对照组比率在9.12倍(表相似2)和1.47倍。CRP, Myo三组之间的比率是类似于生化和免疫测定或iTRAQ分析,证实iTRAQ分析的可靠性。
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| 一个未使用> 1.3意味着至少95%的信心;b肽和95%信心;广告:急性主动脉夹层;AMI:急性心肌梗死;反对:正常对照组。 |
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3.3。蛋白质有双重的微分表达式
总共155个蛋白质相对定量差异AAD患者与正常对照组相比,其中46个蛋白质增加超过两倍(表2),而36蛋白质减少超过双重AAD的病人(表中3)。在油气识别蛋白水平增加,有许多急性期反应物(CRP、Beta-2-microglobulin补充因素我),凝血标志物(结合珠蛋白、凝血因子V,凝血因子IX),和细胞组件(Lumican,微管蛋白β3链,纤连蛋白)。然而AMI患者相比,14的46个蛋白质显示小于2倍增加,包括补充组件9日补充因子1,血浆蛋白质C1抑制剂,搞笑Kappa链恒定区(表2)。有趣的是,一些急性期蛋白质如c反应蛋白仍在名单上,因为它显示两个条件之间的微分表达式。
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| 一个未使用> 1.3意味着至少95%的信心;b肽和95%信心;广告:急性主动脉夹层;AMI:急性心肌梗死;反对:正常控制。 |
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蛋白表达降低AAD患者与正常对照组相比,有很多的分子参与蛋白质代谢(Inter-alpha-trypsin抑制剂重链H2, Alpha-2-HS-glycoprotein),脂质代谢过程(载脂蛋白iv,载脂蛋白E,载脂蛋白我),凝血标志物(纤维蛋白原α链,凝血酶原)和细胞组件(Alpha-2-HS-glycoprotein,血小板反应蛋白- 1 (TSP-1))。AMI患者相比,8 36蛋白质没有达到2倍的微分表达式(表3)。
3.4。Lumican的ELISA分析血清浓度
基于iTRAQ发现我们选择以上两个目标,纤连蛋白和Lumican,标记的蛋白质可能与血管损伤,使用ELISA方法的验证。使用10广告和在初始分析正常样品我们发现统计显著区别AAD和正常个体被视为Lumican但不是纤连蛋白(数据没有显示)。因此,我们进行一个完整的验证研究只Lumican,使用整个收集的120个样本(见下表1)。法之间的统计显著差异,AMI,和正常个体的血清浓度Lumican (2.66±4.58 ng / mL广告组,0.69±0.34 ng / mL AMI组,和0.85±0.53 ng / mL在正常控制,)。油气地质和AMI的差异也达到统计学意义()表明这个标记的特异性AAD(图1)。我们进一步分析了相关性Lumican水平随着时间的推移从出现症状到入学。如图2,也出现了相关AAD集团(,),但不是在AMI组(,),进一步证实了特异性Lumican作为广告的一个标志。
4所示。讨论
iTRAQ分析是最近被用作可能更有效的生物标志物的发现方法比传统蛋白质组学方法。高重现性优化该技术对着手“审前调查”作为初步筛查潜在有用的生物标记物(6- - - - - -8]。作为一种内部验证,iTRAQ方法相比,c反应蛋白生化试验和Myo免疫测定。在我们的研究中没有明显差异的血清水平决定的不同的方法。因此,iTRAQ方法我们使用出现在这个初步分析适合相关蛋白的检测。
识别差异表达蛋白质,在很多研究中,截止点设定在20%至50%的平均方差(7,9,10]。然而,这种方法可能会导致寻找特异性低的标记(2,3]。我们因此拨款增加分界点在100%血清水平方差AAD患者和正常人之间的候选蛋白。因此,只有两个低于或高于正常对照组变化被认为是重要的。在我们的研究中,共有155个蛋白质有一个相对区别AAD患者和健康志愿者。因此,较高的特异性,这些候选蛋白AAD更可能是潜在的生物标记物。
的显著增加蛋白质,有许多急性期反应物,如Beta-2-microglobulin (P61769),这可能表明AAD增加炎症反应的患者。CRP (P02741),发现一种蛋白质升高患者症状或广告和腹主动脉瘤破裂,也确定了使用iTRAQ [11,12]。c反应蛋白是一种非特异性生物标志物与油气地质和长期预测不良事件(13),它可以用来监控进化的假腔内血栓形成14]。不幸的是,c反应蛋白也产生在冠状动脉斑块15),急性心肌梗塞16),等等。这些急性期反应物代表广义的海拔高度对血管损伤反应,这样,非特异性生物标志物。此外,许多蛋白质识别与凝血和纤溶系统相关联。其中,十增加血清水平(如P00450-Ceruloplasmin, P02751-Fibronectin, P00738-Haptoglobin…),和十二个降低了血清水平(例如,P02671-Fibrinogenα链,P00751-Complement系数B, P00734-Prothrombin…)。的病理生理机制的出现这些蛋白质可能解释为从解剖主动脉壁组织因素的释放然后外在凝血系统的激活17- - - - - -19]。此外,血小板可以激活血管壁损伤,激活凝血级联的,或通过激活因素从刺激内皮细胞和血小板释放(如ADP、凝血恶烷、血管性血友病因子)。它也已经发现,血小板功能受到影响二次急性大量消费在假腔AAD病人凝血病(20.,21]。
在过去的几年里,细胞外基质(ECM)成分等血管壁的弹力素已被证明在主动脉高架解剖;然而,这样的增加小于两个(3]。我们的研究发现9细胞外基质成分与大于两个差异蛋白,其中包括羧肽酶(P22792) Lumican (P51884),纤连蛋白(P02751)、血浆铜蓝蛋白(P00450)和血小板反应蛋白- 1 (TSP-1 P07996)。纤连蛋白是一种多态和多功能糖蛋白,广泛的角色在组织损伤22- - - - - -25]。TSP-1,这是一种细胞外蛋白参与细胞间和cell-to-matrix沟通,可以刺激或抑制血管平滑肌细胞和内皮细胞的迁移。它被称为等离子体标记外周动脉疾病(26]。
Lumican在间质胶原分布矩阵在整个身体。在冠状动脉缺血性病变,它是由血管平滑肌细胞过表达(VSMCs) [27和还在主动脉平滑肌细胞合成28]。在iTRAQ分析中,患者的血清水平Lumican AAD高出1.29倍和3.63倍在AMI患者和正常对照组,分别。有趣的是,随着iTRAQ分析,区别AAD的水平和AMI Lumican小于纤连蛋白(表2使用ELISA方法),但最初的验证显示,只有Lumican在广告和AMI样本显著增加。虽然可能会有各种理由来解释两者之间的研究方法的变化,它在生物标志物的研究强调了验证的重要性。发现Lumican表达式与AAD发病仅承认在但不是在AMI样本进一步证实了这种蛋白质与AAD的特异性。
临床蛋白质组学方法提供了一个激动人心的平台识别有用的蛋白质生物标记物。作为一个初始步骤我们研究发现潜在候选蛋白患者的血清生物标志物AAD iTRAQ技术。然而,生物标志物的终极发展提供足够的诊断敏感性和特异性AAD需要多个验证和临床试验,其中可能包括非蛋白标记。不过我们的研究结果提供初步的候选生物标记列表应该进一步验证,单独或组合。
5。结论
在这篇文章中,我们发现iTRAQ技术是一个合适的方法检测的新的潜在的血清蛋白标志物AAD的病人。使用iTRAQ方法,我们的研究发现,Lumican可能是一个潜在的有趣的新广告的血清标志物,并进一步验证这个标记可以帮助AAD的临床诊断。
确认
这项研究是由上海科学技术委员会(114119 a9000)。作者还要感谢化学与生物医学科学研究所的复旦大学,中国人民共和国,为项目提供支持。
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