肽Mimicrying SARS冠状病毒刺突蛋白与SARS患者血清人类蛋白质之间反应

抽象

分子拟态，定义为通过从不同的基因或蛋白质分子共享相似的结构，是一种用于病原体感染宿主细胞的通用策略。严重急性呼吸道综合征（SARS）是由SARS冠状病毒（SARS-COV）一个新的人类呼吸道传染病。SARS-CoV钉（S）蛋白在病毒进入细胞的重要作用。在这项研究中，基于与人类蛋白质的序列同源性选择来自S蛋白11种的合成肽。肽D07的两个（残基927-937）和D08（残基942-951）由SARS病人的血清识别。针对这些肽结合人肺上皮细胞A549的蛋白质小鼠超免疫血清。另一种肽D10（残基490-502）刺激A549增殖和分泌IL-8。目前的结果表明，所选择的S蛋白的区域，与人体蛋白质共享序列同源性，可能在SARS-CoV感染的重要作用。

1.简介

严重急性呼吸道综合征（SARS）是一种新出现的传染病，这是在2002年在中国首次报道，并在2003年迅速蔓延世界各地的[1,2]。该疾病是由液滴和紧密接触传送。患者出现持续发烧，干咳，胸部X线逐步改变，和淋巴细胞一旦感染。虽经治疗，大约10-15％的病人会在急性呼吸窘迫死于[3.- - - - - -6]。一种新的冠状病毒（SARS-CoV的）从SARS患者[分离7- - - - - -9]。SARS-CoV是一种带包膜的正链RNA病毒。SARS-CoV的基因组长度约为29,727个核苷酸。该序列在硅上作了注释[10]。在硅片注释蛋白质利用比较基因组学的研究表明，SARS病毒属于冠状病毒的新组。

根据SARS冠状病毒的基因组序列，可以预测，有几种结构蛋白可通过SARS-CoV的产生包括钉（S），包膜（E），膜（M），核衣壳和。刺突蛋白是在冠状病毒的结合和融合到宿主细胞[非常重要11,12]。SARS冠状病毒的S蛋白具有长度1255个氨基酸和23个潜在的N-连接糖基化位点。在SARS-CoV的S蛋白的氨基末端包含的，其通过内质网运输共翻译过程中可能除去疏水性氨基酸组成的短型1信号序列。羧基末端包括一个跨膜结构域和胞质尾区富含半胱氨酸残基组成。多数蛋白（残基12-1195）是病毒颗粒，其可分为氨基末端S1和羧基端S2域的外部。的S1结构域（残基12-672）结合于宿主细胞受体，血管紧张素转化酶2（ACE2），而S2结构域负责膜融合[13- - - - - -15]。针对S1结构域的单克隆抗体能阻断受体结合和含有针对SARS-CoV的强效的中和活性[16]。然而，从S2域衍生的肽还可以抑制SARS-CoV感染[12]。

分子拟态，其被定义为通过从不同的基因或由它们的蛋白质产物的分子共享相似的结构，是用于病原体感染宿主细胞的通用策略和已经被提出作为一个致病机制的自身免疫性疾病[17]。因此，病原体的分子模拟物区域的识别可能有助于理解由该病原体引起的疾病。目前，还不清楚是否SARS-CoV的蛋白S和人类肽之间发生分子模拟。我们已经接近使用计算机来分析SARS冠状病毒的刺突蛋白的序列，并选择与人体蛋白质共享序列同源性的区域这个问题。潜在区域的选择标准包括抗原性分析和表面可接近性。在这项研究中，我们发现与人类蛋白S蛋白共享序列同源性的几个地区。合成肽，其代表了这些区域，合成，以了解他们在SARS-CoV感染的作用。

2。材料和方法

2.1。肽预测与合成

在美国国家生物技术信息中心(Md, USA)公开可用的人类和冠状病毒基因组序列被用于矽肺诊断。采用预测免疫原性、二次结构预测、蛋白质拓扑分析和疏水性的算法来设计测试肽。基于Kolaskar和Tongaonkar开发的算法计算免疫原性病毒肽[18]。该算法是基于从实验中已知的抗原性表位的氨基酸残基的出现构成的表。该方法的所报告的精确度是约75％[18]。在刺突蛋白的硅片二级结构分析进行基于PHD [19]和捕食[20.]算法。蛋白质拓扑结构预测是基于由TMHMM [开发的算法21]。肽的疏水性基础计算的算法HMOMENT [22]。S蛋白和人类基因组数据库之间相似性检索通过使用BLASTP执行的处理23[英语背诵文选在N端或c端添加额外的氨基酸残基，使疏水性氨基酸含量保持在50%以下。具有高疏水性的多肽很难在生化实验中进行测试，因为大多数的体外测试都是在缓冲液中进行的。此外，平均每5个氨基酸中就有一个带电荷的残留物。多抗原多肽合成巨细胞公司(美国加州山景城)。此外，缓激肽和血管紧张素I (Ang I)购自Sigma(圣路易斯，美国)。

2.2。非典型肺炎病人血清

2003年3月至6月，SARS病人血清由卫生署疾病控制中心收集。SARS的诊断是基于世界卫生组织(WHO)制定的临床标准。SARS-CoV患者通过实验室方法确诊，包括病毒抗原检测、RT-PCR和血清学方法。本研究收集了10例SARS患者恢复期(发病后≥20天)血清。健康个体的10份正常血清作为对照。

2.3。酶联免疫吸附测定（ELISA）

采用固相捕获技术，使用单独的肽包被板检测人类血清中的肽抗体。酶联免疫吸附试验板包被或不包被50片μ大号的肽（100 μ每孔用1％阻断克/毫升）的牛血清白蛋白（BSA）在0.05％吐温20中，在室温下1小时磷酸盐缓冲盐水（PBS）。测试血清样品稀释，并加入到平板中，在室温下2小时。孵育后，将ELISA板用0.05％Tween-20的PBS中为三次。由过氧化物酶辣根检测结合的抗体（HRP-）缀合的抗人免疫球蛋白抗体（Sigma Aldrich公司，圣路易斯，MO，USA）和过氧化物酶底物，TMB（Promega公司，麦迪逊，WISS，USA）。The absorbance was measured using the Vmax microplate reader (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, Calif, USA) at 450 nm. Antibodies against peptides in mouse sera were assayed by ELISA as in human sera except HRP-conjugated antimouse immunoglobulin antibodies (Sigma Aldrich) was used to detect bound antibodies.

2.4。细胞培养

在添加10%热灭活FCS、2 mM l -谷氨酸和50 ng/mL庆大霉素的DMEM中培养人肺腺癌细胞系A549和Vero细胞。细胞在CO中培养₂培养箱中在37^°下用5％CO₂在湿润的气息。对于免疫荧光显微镜观察，A549细胞的单层上实验前无菌玻璃载片培养。

2.5。小鼠免疫

6至8周龄雌性BALB / c小鼠在这项研究中使用。这些小鼠最初是从杰克逊实验室（缅因州巴港，USA）购买，并在实验动物中心，国立成功大学（台南）饲养。Synthetic peptides (1 mg/mL) were emulsified with complete Freund's adjuvant and injected intraperitoneally into BALB/c mice. Mice were boosted with the same peptide in PBS (50 μ克/小鼠）腹膜内灌注后两周。血清是从在不同时间间隔对小鼠的轴向丛收集并用于如上所述抗体的存在针对肽通过ELISA测试。抗体效价（大于4倍）对免疫肽的显著增加小鼠超免疫血清被发现作为升压后相比正常血清。

2.6。免疫荧光染色

用A549细胞培养小鼠抗肽D08的高免疫血清^°下进行1小时。一个fter washing three times with PBS, cells were incubated with 1 mL of 1 μg/mL fitc -偶联抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.， West Grove, Pa, USA^°下进行1小时，并用PBS再次洗涤。用荧光显微镜观察细胞的免疫荧光染色。

2.7。SDS-PAGE和Western blot分析

A549细胞裂解液中的蛋白按12% SDS-PAGE分离并转移到硝基板上，如前所述[24]。用HRP缀合的抗小鼠免疫球蛋白抗体（Sigma Aldrich公司）和底物中检测到由正常或肽D08超免疫的小鼠的血清识别的蛋白质。

2.8。细胞增殖

维罗E6 (）和A549细胞（）用不同剂量的合成肽进行孵育72小时来表示。使用商业XTT测定法（Roche Diagnostics公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国）检测细胞增殖。

2.9。引发试验

的IL-8产生通过根据制造商的说明书的商业ELISA试剂盒（R＆d系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）进行评估。简言之，将A549细胞（）单独培养或用不同剂量的肽48小时的。培养物上清液温育后，收集，加入到预涂覆的ELISA板，并在37℃培养2小时^°C.将板用洗涤缓冲液洗涤4次。结合的IL-8用HRP缀合的抗体和底物检测。发色是由的Vmax酶标仪（Molecular Devices公司，加利福尼亚州，美国）读取。IL-8的浓度根据标准曲线计算。

2.10。统计分析

数据表示为平均值±标准偏差（SD）。使用学生群体之间的差异显着性水平进行了分析Ť以及。的值P<0.05被认为是显著。

3.结果

3.1。寻找S蛋白的分子模拟区域

分析刺突蛋白的全部氨基酸序列，找出潜在免疫原性区域和区域共享序列同源性与人类蛋白质，其被定义为所述病原区域。如图1中，有4个致病区域。区域1（残基199-254），区域2（残基658-715），区域3（残基893-951），和区域4（残基1127至1184年）有共同的与羟基酸氧化酶，人自身抗原高尔基体，序列同源性Angrgm-52，以及pallidin，分别。在这些区域中，具有同源性的人类Angrgm-52区域3具有最高得分（具有34级％的同源性和保守取代的48％的相似性）。它与angrgm-52序列比较示于图图2（a）。此外，由于脱精氨酸缓激肽和Ang我是ACE2 [基板25，我们还比较了S蛋白与缓激肽(RPP)的序列GFSPFR）和血管紧张素I（DRVYIHPFHL），并发现残留490-502（GYQPYRS蛋白的VVVLSFEE）显示出与血管舒缓激肽的序列同源性由粗体字母这里和在图所示图2（b）。认同得分为27%;保守替代的相似度得分为36%。

3.2。屏幕肽由SARS患者血清识别

十一肽（D01-D11，见表1），其代表那些致病区域合成以及缓激肽和Ang我进行测试，以查看是否那些肽可以通过SARS患者的血清所识别。将肽基于所述算法预测的免疫原性，二级结构，蛋白质拓扑，和疏水性而设计的。我们的目标是选择具有高免疫原性肽与蛋白质表面上的位置，并用疏水性低。所设计的肽序列，合成并用SARS患者血清的临床样品进行测试。相比于正常血清的结合SARS患者的血清结合到肽D01，D07，D08和的显著上升找到（见图3.)。

3.3。高免血清中抗D08交叉反应与A549细胞

为了测试合成肽D01、D07和D08是否能诱导抗体与人蛋白发生交叉反应，我们用这些肽免疫小鼠，使小鼠产生针对这些肽的高免疫血清。我们发现抗D08的高免疫血清可以通过免疫荧光染色与人A549细胞的细胞质区结合(见图)4)。使用Western blot分析，与正常小鼠血清相比，抗D08的高免疫血清可以识别A549细胞裂解液中的更多条带(见图)5)。此外，对D07，但不是D01超免疫血清，显示出相似的交叉反应性，以A549细胞作为针对D08超免疫血清没有（数据未示出）。

3.4。抗D10的高免疫血清与缓激肽发生交叉反应

为了测试是否合成肽D10，确实可诱发抗体缓激肽和Ang我交叉反应，我们用免疫肽D10小鼠产生抗这种肽的超免疫血清。针对D10抗体的显著增加D10超免疫血清被发现，这可以与缓激肽交叉反应，但不与血管紧张素I-包被的板（见图6)。

3.5。肽D10诱导A549细胞分泌IL-8及细胞增殖

为了了解D10是否具有与Ang I相似的生物学活性，我们用D10、Ang 1或对照肽D11培养Vero细胞和肺上皮细胞A549细胞。在D10和Ang I存在的情况下，Vero和A549细胞均诱导增殖，但未诱导对照肽增殖(见图)7)。此外，D10和Ang I也能诱导A549细胞产生趋化因子IL-8(见图)8)。

4.讨论

在这项研究中，我们已经确定了SARS-CoV的S蛋白共享序列同源性四个致病地区，具有不同的人类蛋白质。其中，致病性区域3（残基893-941）中，用Angrgm-52（GenBank登录号：AAL62340），其股序列同源性，一种新的基因在人肾小球系膜细胞中上调刺激由血管紧张素II，可能值得进一步调查。肽D07和该区域的D08是由SARS患者的这表明该区域是免疫原性的，并且可以通过免疫系统SARS-CoV感染期间被识别的血清识别。针对肽D07或D08鼠超免疫血清能够结合到S蛋白的重组S2但不S1域（未示出数据）。此外，针对D07或D08超免疫血清也界定于A549细胞的胞质区，并在A549细胞裂解物识别的几种蛋白质。这些结果表明，通过D07和D08表示区域是免疫原性的并可能诱发自身抗体。然而，需要进一步研究以了解这些区域的生物学功能及其抗体的SARS冠状病毒感染的发病机制中的作用。

除了D07和D08肽，我们也注意到代表残留S1域的490-502包括一些有趣的活动，D10肽。的D10肽，其共享序列同源性与缓激肽，是能够产生抗体与缓激肽交叉反应。此外，D10肽能刺激A549，以产生IL-8和增殖为昂我一样。这些结果表明，在S蛋白D10的区域可以结合至血管紧张素-I受体，ACE2，并且可能参与SARS冠状病毒的与ACE2的结合。这是与前一报告，这表明残留S1域的318-510可以结合ACE2 [一致25]并且是类似于冠状-229E的受体结合结构域，其是含有残基407至547 [片段内26]。因此，S1结构域的区域490-502可以涉及SARS冠状病毒的受体结合结构域。

总之，我们的结果表明SARS-CoV和宿主蛋白之间存在分子拟态。与SARS-COV宿主蛋白共享序列同源性的Motifs可能参与了SARS-COV与宿主细胞的结合和融合。针对这些motifs的抗体可能含有对SARS-CoV感染的中和活性，也可能参与了SARS-CoV诱导的免疫发病过程。如前所述，SARS-CoV和流感一样，可以通过分子模拟策略抑制宿主的皮质类固醇应激反应[27]。我们对S蛋白，它参与了病毒的模仿主题的研究，进入可以提供替代的方法来破坏感染SARS冠状病毒的，类似的病毒进入以往的研究[28,29]。

承认

这项工作是由格兰特no.NSC92-2751-B006-Y从国家科学委员会，台北，台湾的支持。

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