二羧酸Pt(IV)前体药物的自组装能影响其细胞摄取吗?

摘要

在不同的水溶液中，已经评估了二羧酸铂(IV)前药物自发自组装的可能性以及它们在癌细胞中摄取的后果。四种铂(IV)配合物，即(OC-6-33)-二乙酰二胺二氯铂(IV)，王牌， (OC新思维)-diamminedibutanoatodichloridoplatinum (IV),但， (OC新思维)-diamminedichloridodihexanoatoplatinum (IV),十六进制, (OC新思维)-diamminedichloridodioctanoatoplatinum (IV),10月，分散在i) milliQ水，ii)磷酸盐缓冲盐水和iii)含有胎牛血清(FBS)的完整细胞培养基(RPMI 1640或DMEM)。用动态光散射(DLS)对样品进行分析，测量可能存在的纳米粒子的大小和分布。电势表明了所得聚集体的稳定性。对于这个系列中最亲脂的化合物，10月而且程度较轻十六进制，已经观察到纳米级聚集体的形成，特别是在测试的最高浓度(10μM).细胞培养基对这些纳米颗粒具有分解作用，主要是由于它们的白蛋白含量，能够通过非共价(疏水)相互作用与有机链相互作用。为10月，在吸收试验使用的最高浓度(10μM)，被动扩散和自组装纳米粒子的内吞作用的结合使得细胞吸收高于仅存在被动扩散的情况。在细胞松弛素D预处理A2780卵巢癌细胞摄取的研究中，观察到具有统计学意义的内吞抑制作用10月．在这些实验条件下，摄取和亲脂性之间的关系变得几乎是线性的而不是指数。自10月抗癌前药在纳米摩尔浓度下具有活性，在纳米摩尔浓度下，其在培养基中的聚集几乎被消除，这一现象不应显著影响其抗增殖活性。

1.介绍

靶向和免疫疗法代表了癌症治疗的新路线图，以获得低全身毒性的高疗效[1]．然而，传统的细胞毒性药物(尤其是dna损伤药物)对几种侵袭性实体瘤仍具有不可估量的临床价值。在这些细胞毒性药物中，有三种铂(II)配合物已获得全球批准，即顺铂、卡铂和奥沙利铂。此外，奈达铂、庚铂和洛铂已分别在日本、中国和韩国获区域批准[2]．最后，非常亲脂的铂络合物米利铂在日本被批准用于肝细胞癌的脂化治疗[3.]．这些Pt(II)类药物的结构如图所示1．有趣的是，顺铂仍然是一些临床试验的主要成分(注:在世界各地的nih注册的涉及顺铂的临床试验可以通过使用搜索工具获得http://www.clinicaltrials.gov/）.遗憾的是，基于Pt(II)的药物有许多缺点，包括低生物利用度和稳定性，严重的副作用，固有或获得性耐药性[4]．

为了克服这些缺点，铂(IV)配合物被提出作为铂(II)药物的替代品。它们表现出更高的动力学惰性，降低了不良反应的发生率，从而改善了一些副作用，使其适合口服。Pt(IV)配合物作为相应Pt(II)同属物的前药，在细胞中通过轴位配体的还原消除(受缺氧和肿瘤微环境的影响)而被激活，释放出活性Pt(II)配合物(图)2) [5，6]．

由于Pt(IV)前药物是通过氧化相应的Pt(II)同族物(通常用氯或过氧化氢)获得的，临床试验的前两个配合物是四铂(或奥马铂)，在轴位上有两个氯配体，和异丙铂，轴向带有两个羟基配体(图3.）.四铂表现出过高的全身毒性，而异丙铂活性较差。铂(IV)配合物的易还原性主要取决于轴向配体的性质，并以Cl顺序发生⁻>醋酸酯> OH⁻．因此，二氯配合物还原得太快，二羟基配合物还原得太慢，无法发挥最佳药理活性[7]．二羟基Pt(IV)合子的羧化过程提供了大量在适当的生物窗口具有还原电位的二羧酸配合物[8]．其中双醋ato前药satrapatin(或JM216)和LA-12进行了几次临床试验，遗憾的是到目前为止尚未获得完全批准。对其结构的检查(图3.)表明，这种双醋酸Pt(IV)前药物的高亲脂性，允许细胞有效摄取，通常是通过使用体积较大的胺作为载体配体(分别为环己胺和金刚胺)获得的。

此外，还可以使用脂肪酸(FAs)，以增加亲脂性，从而维持基本的顺铂骨架(即从oxoplatin开始，图)4，为羧化反应)。这提供了一些优势，因为起始材料(顺铂)很容易获得，而且它的作用机制(一旦Pt(IV) -Pt (II)还原后释放)也比较清楚。对于非常均匀的一系列FAs Pt(IV)配合物，其效价(1/IC₅₀)与电子因子(即它们在Pt原子上的还原电位或电荷)和亲脂因子(即辛醇与水对数之间的分配系数)的关系是相当令人满意的P_{o / w}，或者更简单地说，分子量或羧基链的长度)[9，10]．后两个参数对Pt(IV)芯的电子密度影响不大。相反，由于这种Pt(IV)结合的主要(如果不是唯一的)细胞摄取机制是被动扩散，它们的细胞摄取结果与羧基链的长度成正比，这决定了对数P_{o / w}［11]．在有希望的假设中，使用这些二羧酸铂(IV)配合物作为口服单分子抗肿瘤前药物(每个操作系统)，每个碳链的长度应受到限制(C₂- c₈）;否则，它们的水溶性降低，胃肠道吸收效率降低，从而降低它们在循环血液中的峰值浓度[12，13]．另一方面，已经合成并测试了大量含羧酸配体的铂(IV)配合物，包括高分子量的[14或多不饱和脂肪酸[15]，以及几种有机药物(具有活性羧基偶联，如COX抑制剂阿司匹林和氟比洛芬[16- - - - - -18])。所有这些极亲脂性的Pt(IV)在水溶液中自发地结合自组装，这改善了在体外细胞摄取，增加了被动扩散的非常有效的内吞过程所经历的相应的纳米聚集体。这些纳米粒子通常被隐藏或插入聚乙二醇化材料，以增加其稳定性、溶解性和可控释放特性[19- - - - - -22]．

在此背景下，我们研究了单纯二羧酸是否以顺铂为基础王牌，但，十六进制,10月(图4)，最初作为单分子抗增殖前药进行试验[12，能够在水溶液中自组装生成无载体纳米结构，以及这种可能的现象在临床前测试的实验条件下是否有任何意义。

2.材料和方法

铂(IV)配合物(OC新思维)-diacetatodiamminedichloridoplatinum (IV),王牌， (OC新思维)-diamminedibutanoatodichloridoplatinum (IV),但， (OC新思维)-diamminedichloridodihexanoatoplatinum (IV), (十六进制, (OC新思维)-diamminedichloridodioctanoatoplatinum (IV),10月，根据已发表的程序由奥索铂制备[12，23，24]．简单地说，在DMF中，oxoplatin的悬浮液与过量的合适的酸酐反应(for王牌，但,十六进制)或酰氯(用于10月的解国际清算银行(carboxylato) pt (IV)复杂。降低溶液的体积，加入乙醚沉淀产物。通过常用的分析技术(如元素分析、高效液相色谱、ESI-MS和多核磁共振)对配合物的纯度进行了表征和测定。

在10mm KNO中进行动态光散射(DLS)和ζ电位分析_3.(经过0.5 M的HCl预处理和离心后)在37°C与Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd.， Malvern, UK)在固定的173°散射角，使用He-Ne激光和DLS软件的Windows(版本6.11,Malvern, UK)。溶液的制备和相应的DLS测量由两个独立的操作人员至少进行三次，以调节操作过程对结果的影响。图表中所报告的每个值都是至少6个测量值的平均值。

2．1．溶液的准备

四种配合物的母液在DMSO中制备，稀释至1mm。将这些溶液的等量稀释在以下水溶液中:i) milliQ水(H₂O)， ii)磷酸盐缓冲盐水(PBS)， iii) RPMI 1640细胞培养基，或iv) Dulbecco 's Modified Eagle培养基(DMEM);细胞培养基中添加10% v/v胎牛血清(FBS)。对于每个溶液，分别制备浓度为0.1、0.5、1、5和10的5个样品μM和固定的1.0% v/v的有机助溶剂添加适量的纯DMSO。最后，用三种含1.0% v/v DMSO的PBS溶液10月(0.1μM)单独，牛血清白蛋白(BSA, 35μ单独和两种化合物的混合物。

2．2.细胞吸收

A2780细胞(ICLC HTL98008, Interlab细胞系收集，Genova，意大利)在T25瓶中培养，直到80%左右汇合。然后，用配合物(10μ完全RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清)。在暴露结束时，用PBS洗涤细胞三次，用0.05% Trypsin 1X + 2% EDTA (HyClone, Thermo Fisher)从培养皿中分离细胞，并在新鲜的完全培养基中收获。使用自动细胞计数装置(Countess®，Life Technologies)测量每次计数的细胞数量及其平均直径。在细胞松弛素D抑制剂的实验中，在RPMI 1640中与10μM细胞松弛素D, 10μ在RPMI 1640中用Pt(IV)化合物处理2小时。处理过的细胞转移到硼硅酸盐玻璃管中，在室温下1100 rpm离心5分钟。上清小心地通过抽吸去除，大约200μL保留上清液以限制细胞损失。细胞微球在−20℃保存，直到矿化和铂含量测定。铂含量采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS, Thermo Optek X Series 2)测定。样品矿化通过添加70% w/w的HNO进行_3.，然后在60°C超声浴中孵育1小时。在ICP-OES测量之前，HNO_3.稀释至最终1.0% v/v浓度。1000mg·L铂标准原液⁻¹用1.0% v/v硝酸稀释，制校准标准品。为了获得对铂的最大灵敏度，对ICP-MS设置进行了优化。为定量测定，铂和铟的最丰富的同位素(用作内标)在m / z分别为195和115。在药物处理后的细胞中发现的铂水平，并随细胞数量(细胞铂摄取)而归一化，表达为ng Pt每10⁶细胞。

3.结果与讨论

在四种不同的介质中制备了Pt(IV)配合物的分散体:i) milliQ水(H₂O)， ii)磷酸盐缓冲盐水(PBS)， iii) RPMI 1640，和iv) DMEM细胞培养基，后两种培养基中添加10%胎牛血清(FBS)作为培养基在体外临床前实验(25]．样品由DMSO中的浓缩母液制备，在水溶液中稀释至五种最终浓度(0.1、0.5、1、5和10)μM)。每种溶液中DMSO的%保持在1.0% v/v。用动态光散射(DLS)分析了混合物的粒径(流体力学半径，d)和纳米粒子的分布(多分散度指数，PDI)。数字5显示了结果的压缩表示(参见图)S2- - - - - -S5、补充材料)。

在H₂啊,都王牌和但显示纳米粒子的存在d100nm，几乎与浓度无关。相反,十六进制和10月显示出较高的值d，随着配合物浓度的增加有增加的趋势。

盐(PBS)的存在反映了平均数d值在200和400 nm之间王牌，但和十六进制，用浓度来缓冲差异。只有在这种情况下10月是d和集中维护。

在有完整的细胞培养基RPMI 1640(也有DMEM，见图)的情况下S5，补充材料)，一个广义的，戏剧性的减少d被观察到。为王牌和但在所有浓度下，以及十六进制在浓度≤5μ米,d(RPMI 1640和DMEM单独含有d在20和40纳米之间)。相反,10月保存的值d在300和500 nm之间的最高浓度(1-10μM)，而纳米粒子的分解几乎完全在最低的位置d值下降到后台。

用PDI评价颗粒溶液的平均均匀性:PDI值≤0.1的样品被认为是高度单分散的，而0.1 - 0.4和> 0.4(高达1)分别表示样品是中度和高度多分散的[26]．本工作得到的PDI值在H范围内为0.8 ~ 1.0₂O, PBS为0.6 ~ 1.0，两种培养基均为0.3 ~ 0.5，无任何变化趋势。

不同混合物的zeta电位范围在+1到−16 mV之间，这与中性分子的聚集体的预期一致。根据经验，zeta电位在- 30 mV和+30 mV之间的纳米粒子被认为是静电不稳定的，由于主要的吸引范德华相互作用而易于聚集[27]．

完全细胞培养基对标题化合物聚集的显著影响(因此生成的纳米颗粒的相应DLS直径)可以根据Johnstone和Lippard的开创性工作进行解释，以顺铂为基础的不对称fa -琥珀酸- pt (IV)偶联物与人血清白蛋白(HSA)相互作用。这种非共价相互作用的强度随着脂肪尾的增加而增加:在分析的配合物中，C₂，对C来说相当紧张₁₆(考虑的最高链)。在后一种情况下，HSA-Pt(IV)加合物具有1:1的化学计量比，因此非常牢固，可以通过快速液相色谱分离[14]．HSA和牛血清白蛋白(BSA)之间有很大的相似性，后者是牛血清白蛋白的主要成分，而后者在使用的完全培养基(RPMI 1640和DMEM)中都代表10% v/v。因此，铂(IV)缀合物与牛血清白蛋白之间的相互作用应该能够将聚集形成的纳米颗粒进行分解。

为了明确显示BSA在纳米颗粒分解中的作用，我们记录了含PBS溶液的DLS图10月(0.1μM)单独，BSA单独(35岁)μ米)(25，以及两者的混合物。在400 nm处观察到DLS峰10月在有牛血清白蛋白存在的情况下，单分子移动约15 nm，这是可能的加合物BSA-的值10月非常接近单独BSA记录的值(约10 nm)，值与单体BSA的文献数据范围一致[28)(图6）.

为了了解自组装纳米粒子的内吞作用是否在高浓度(10μ在没有和有细胞松弛素d的情况下，用每个标题Pt(IV)复合物刺激A2780卵巢癌细胞。结果显示，图中报道了Pt细胞的摄取情况7．

当纳米粒子遇到细胞时，通常通过内吞作用将其内化。内吞作用可分为胞饮作用和吞噬作用，前者涉及小泡内液体和分子的摄取，后者负责吞噬大颗粒。胞饮作用可依赖于网格蛋白涂层(网格蛋白介导的内吞作用)或不依赖于网格蛋白独立的内吞作用[29]．有多种方法来抑制不同形式的内吞作用，以确定准确的摄取机制。这不是本文的目的，我们已经采用了一种更简单的方法，即使用细胞松弛素D。这种细胞渗透性真菌毒素可以解聚肌动蛋白丝，因此可以用于研究肌动蛋白依赖的摄取机制。然而，这种毒素影响几乎所有的内吞途径，因为肌动蛋白聚合抑制剂对任何形式的内吞作用都有间接影响[30.]．

作为细胞松弛素D预处理的结果，细胞摄取的抑制是有限的或统计上显著的十六进制和10月，分别观察到。相反，行为王牌和但不受这种预处理的显著影响。

重要的是，这种效应在[10月) = 10μM，然而，在较低浓度下，细胞松弛素D对细胞摄取最亲脂复合物的影响可以忽略或没有影响(图8）.

Oldfield等人发现了测井曲线之间的非线性相关性P_{o / w}铂细胞摄取多种铂(IV)复合物。这种相关性被定义为“非线性上升趋势”。抛物线和指数关系在统计上都是有效的，但作者认为后者更现实[31，32]．本文研究的四种铂(IV)配合物表现出广泛的亲脂性:它们的对数P_{o / w}跨度约6个log单位(logP_{o / w}王牌=−1.92,但=−0.39,十六进制= 1.14,10月= 4.1) (11，12]．

作为对数函数的摄取的类似行为P_{o / w}(图7和9）.有趣的是，使用细胞松弛素D预处理抑制内吞作用后获得的摄取数据，相关性变得更接近线性(图)9）.这表明(至少对于这些Pt(IV)缀合物而言)，在高浓度(10μM)任何吸收研究都必须使用的，似乎涉及作为对数函数的吸收的“非线性上升趋势”P_{o / w}．

4.结论

总结本研究的结果，从报道的实验中可以得出以下结论:（1)在大多数亲脂化合物的情况下，已经观察到纳米级聚集体的形成，特别是在最高浓度的测试。然而，它们的特点是zeta电位低，导致稳定性低和高分散性。最重要的是，完整的细胞培养基(由于BSA的存在)具有分散纳米颗粒的作用。(2）在高浓度下，被动扩散(在分子水平上)和(更有效的)聚集体内吞作用的结合，使铂的吸收高于仅被动扩散的预期。然而，对于纳米浓度活性的化合物，如10月［12，33，这种作用不应影响观察到的抗增殖活性。的确，100 nM的浓度10月为50 × IC₅₀对顺铂敏感的A2780肿瘤细胞株（3）在研究亲脂性Pt(IV)配合物时，必须注意对生物试验结果的解释，因为根据实验条件，它们可以从单一分子转变为自聚集体。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章和补充材料文件中。

的利益冲突

作者声明，没有利益冲突可能会影响本文所报道的工作。

作者的贡献

Mauro Ravera和Elisabetta Gabano对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

作者感谢国际大学生物系统金属化学研究联盟(CIRCMSB, Bari)在年度会议期间提供了激发讨论的机会。这项研究是原创的，并得到了Università del Piemonte Orientale (UPO)的资金支持。

补充材料

详细的流体力学半径测量的动态光散射(DLS)的混合物研究王牌，但，十六进制,10月在水，PBS, RPMI 1640和DMEM溶液中。（补充材料）

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