文摘

Dihydroorotase (DHOase)拥有一个双核的金属中心两个锌离子被转译后的桥接carbamylated赖氨酸。DHOase催化的可逆环化N[氨基甲酰天冬氨酸(CA-asp) dihydroorotate (DHO)第三步嘧啶核苷酸的生物合成的途径,是一个有吸引力的目标潜在的抗癌和抗疟药化疗。晶体结构的配体DHOase显示灵活循环扩展向活性部位当CA-asp绑定(循环模式)或远离活性部位,促进产品DHO释放(环模式)。DHOase结合的产品,如抑制剂5-fluoroorotate DHO (5-FOA)在一个类似的模式。在目前的研究中,我们报告DHOase的晶体结构酿酒酵母2.5 (ScDHOase)包裹着5-FOA决议(PDB项7 ca0)。ScDHOase股份结构相似大肠杆菌DHOase (EcDHOase)。然而,我们的多元结构显示ScDHOase绑定5-FOA与EcDHOase不同。5-FOA结扎ScDHOase的锌原子的活性部位。此外,5-FOA绑定到ScDHOase通过循环模式。我们也为绑定5-FOA ScDHOase通过定点诱变和荧光猝灭法。基于这些线条的分子证据,我们讨论了这些不同的绑定模式是否物种——或者crystallography-dependent。

1。介绍

Dihydroorotase (DHOase)是一种锌金属酶催化的可逆环化N[氨基甲酰天冬氨酸(CA-asp) dihydroorotate (DHO)第三步嘧啶核苷酸的生物合成途径的1,2]。这个途径的药物抑制可能提供了一种方法来针对癌细胞,疟疾寄生虫和病原体经历快速增长(1- - - - - -4]。在哺乳动物中,DHOase的活动中发现三功能性的酶,CAD,还有活动[氨基甲酰磷酸合成酶(CPSase)和天冬氨酸transcarbamoylase (一个TCase) [5]。然而,重要的变化在不同的物种(图1(一))。在真菌、CPSase和ATCase存在在一个双功能蛋白,Ura2,这是一个包含缺陷DHOase-like域类cad的多肽为(6]。在大多数原核生物,CPSase、ATCase DHOase分别表示和独立运行7]。铜绿假单胞菌ATCase共价associates的DHOase-like多肽ATCase活动(8]。Aquifex aeolicusDHOase (AaDHOase)是活跃的只有当包裹着AaATCase [9]。因此,建立精确的差异DHOase物种间相当大的兴趣。

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图1
DHOases的比较。(a)的基因产物之间的前三个嘧啶生物合成的反应是不同的物种。高等真核生物的人类CAD由DHOase CPSase, ATCase域融合共价。细菌DHOase、CPSase ATCase函数分别。然而,CPSase ATCase活动酿酒酵母存在于一个双功能蛋白,Ura2。Ura2是一个包含一个类cad的多肽为缺陷DHOase-like域。(b)序列比对的灵活的循环。参与催化的氨基酸是红色的。序列组成,这些灵活的长度循环是明显不同的。

根据已知的氨基酸序列和系统发育分析,两大组DHOases进行分类(10]。这两种DHOases共享一个低水平的蛋白质序列标识(少于20%)。AaDHOase,炭疽杆菌DHOase (BaDHOase)和DHOase域(huDHOase)人类CAD的I型DHOases(约45 kDa),是进化的古老而大于II型同行(约38 kDa),比如从真细菌、真菌和植物。最近的结构分析表明,huDHOase应该被重新归类为III DHOase类型(11由于独特的属性。

类型II DHOase大肠杆菌(EcDHOase)是第一个确定的结构(12]。解决复杂晶体结构表明,衬底CA-asp和产品DHO被发现在不同的活跃的网站(12]。进一步的结构性工作表明,一个灵活的循环扩展向活性部位当CA-asp注定(循环模式),或移动远离活性部位,促进产品DHO释放(环模式)(13]。诱变的研究发现的重要性两个刺残留物(T109和T110)在催化[灵活循环14]。然而,序列组成和这个循环(图的长度1 (b))BaDHOase和huDHOase是明显不同的15]。此外,huDHOase嵌合体轴承EcDHOase灵活循环是不活跃的,表明不同的物种间催化特异性16]。因此,这个循环的盖子在活性位点DHOase应该选择性抑制剂设计的主要目标。

5-Fluoroorotate (5-FOA)是一个强大的产品,如抑制剂的DHOase疟疾寄生虫恶性疟原虫(17]。抑制了纯化EcDHOase 5-FOAK我值为31.8μ米(13]。绑定模式EcDHOase [13]和huDHOase [11)建立了5-FOA使用结构信息。在这些复杂的结构,DHOase结合5-FOA通过环形模式;即灵活循环不参与5-FOA的绑定。在目前的研究中,我们报告DHOase的晶体结构酿酒酵母2.5 (ScDHOase)包裹着5-FOA决议(PDB项7 ca0)。ScDHOase与EcDHOase共享结构相似。考虑到相同类型的酶,可以得出这样的结论:5-FOA绑定模式ScDHOase必须EcDHOase相似。然而,我们发现他们5-FOA绑定模式是非常不同的。我们也为绑定的5-FOA ScDHOase利用荧光猝灭和突变分析。

2。材料和方法

2.1。蛋白表达和纯化

ScDHOase是纯化使用先前描述的协议18,19]。简单地说,大肠杆菌BL21 (DE3)细胞与表达载体转化pET21b-ScDHOase,和过度的表达质粒与1毫米thiogalactopyranoside异丙酯引起的酝酿。可溶性的蛋白质纯化上层清液通过使用镍2 +亲和色谱法(HiTrap惠普;通用电气医疗集团生物科技),筛选了缓冲区(20毫米Tris-HCl、250毫米咪唑和0.5 M氯化钠,pH值7.9),和透析对透析缓冲区(20毫米Tris-HCl和0.1 M氯化钠,pH值7.9)。蛋白质纯度留在> 97%,确定使用sds - page (Mini-PROTEAN Tetra系统;美国CA Bio-Rad)。

2.2。定点诱变

ScDHOase突变体的生成根据QuikChange定点诱变工具包协议(Stratagene;拉霍亚、钙、美国),利用野生型质粒pET21b-ScDHOase作为模板。突变的存在在每个构造是由DNA测序验证。重组突变体蛋白纯化使用协议的野生型ScDHOase倪2 +亲和色谱法。

2.3。结晶实验

结晶之前,纯化ScDHOase集中到11毫克/毫升。ScDHOase包裹着的水晶5-FOA种植在室温下通过悬滴蒸汽扩散在16% PEG 4000和100毫米imidazole-malate, pH值6.8。ScDHOase的晶体是验证beamline TLS 15 a1的国家同步辐射研究中心(NSRRC;新竹、台湾)。

2.4。x射线衍射数据和结构的决心

本机和Zn-anomalous数据收集在beamline BL44XU在SPring-8 (Harima、日本)MX300-HE CCD探测器和在beamline TPS 05 a1 NSRRC(新竹、台湾)MX300-HS CCD探测器。数据集是索引、集成和扩展hkl - 200020.]和XDS [21]。初始阶段,密度修改和模型构建进行使用AutoSol程序(22凤凰)。迭代模型构建和结构优化进行了使用Refmac CCP4软件套件(23)和凤凰凤凰细化软件套件(24]。的初始阶段ScDHOase包裹着5-FOA测定通过分子替换软件Phaser-MR [25)通过使用单体的ScDHOase源自ScDHOase-malate复杂(18)作为搜索模型。后12个周期的模型细化,ScDHOase的最佳模式是利用计算真实空间平均省略|Fo|−|Fc|地图使用mapmask和maprot CCP4软件套件(23]。基于真实空间平均省略|Fo|−|Fc|地图,5-FOA位置确定。傻瓜是用于手工模型修正和密度分析(26,27]。5-FOA是0.95的密度符合价值使用密度符合分析的傻瓜。模型的立体化学的正确性验证了使用MolProbity [28]。原子坐标和相关结构因素与加入代码存入PDB 7 ca0。

2.5。离解常数的测定(Kd)

的Kd价值的纯化ScDHOase决心使用荧光猝灭方法如前所述dihydropyrimidinase (DHPase) [29日- - - - - -31日]。简单地说,一个整除的化合物添加到解决方案包含ScDHOase (1μ7.0米)和50 mM消息灵通的pH值。减少的内在荧光ScDHOase测量在280 nm和324 nm激发态25°C荧光光谱仪(日立f - 2700;日立高新技术、日本)。Kd使用以下方程得到:ΔF=ΔF马克斯−Kd(ΔF/(复合))。

3所示。结果与讨论

DHOase活动存在于所有生物的生物合成嘧啶核苷酸,但是系统发育和结构分析揭示至少有三个不同的DHOase形式(2,11]。在细菌和酵母,DHOase单功能的和属于II型酶。真核DHOase, ScDHOase进化之间的联系可能是一个革兰氏阴性细菌DHOase (II型)和高等真核DHOase CAD (III型)的领域。因此,EcDHOase原核生物和真核生物之间的重要差异ScDHOase值得调查。

3.1。结晶

我们试图结晶结晶筛选ScDHOase-5-FOA复杂,但没有形成晶体。ScDHOase形成晶体只有在苹果酸的存在(18]。因此,我们5-FOA孵化的水晶ScDHOase-malate复杂而获得成功ScDHOase-5-FOA复杂的晶体。ScDHOase复杂的晶体属于空间群P21与细胞的尺寸一个= 85.47,b= 88.59,c= 103.57。的晶体结构ScDHOase包裹着5-FOA解决分辨率(表2.51)。

表1
数据收集和细化统计数据。
3.2。晶体结构与5-FOA ScDHOase复杂化

晶体的不对称单元包含四个crystallography-independent ScDHOase单体(图2(一个))。每个ScDHOase单体的全球架构显示TIM-barrel结构和由15α螺旋线,12β表2锌离子,和1 5-FOA分子。赖氨酸残基(K98)仍然carbamylated不管5-FOA绑定。dimetal中心(锌α/锌β他(即ScDHOase含有4中)。,H14, H16, H137, and H180), 1 Asp (i.e., D258), and 1 carbamylated Lys (i.e., Kcx98) was still self-assembled. The structure revealed a long flexible loop in each subunit which extended toward the active site when 5-FOA was bound (Figure2 (b))。使用凤凰的入住率细化执行。完善软件(24]。5-FOA入住率的每个单元都是0.74 - -0.78。可能产生的部分占用5-FOA替换或扰动的苹果酸母液(18]。两个刺残留物,Thr109 Thr110 EcDHOase,重要的稳定过渡态但不与5-FOA互动(13),也守恒ScDHOase (Thr105和Thr106)。然而,这两个用力推残留与5-FOA透露我们的复杂结构。

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图2
结构与5-FOA ScDHOase复杂化。(a)的带状图ScDHOase-5-FOA复杂的四聚物。每个单体不同颜色。两个锌离子在活性部位的黑色球体。(b)的结构比较活跃的站点ScDHOase四聚物。这些5-FOA-bound状态的叠加结构显示灵活循环循环在每个亚基构象。(c)平均真实空间的立体视图忽略|F o|−|F c|地图(绿色网格,波状外形的3σ)5-FOA ScDHOase。绑定5-FOA(青色)和ScDHOase(浅蓝色)所示。的羧基5-FOA结扎锌原子(灰色球体)。(d)复合省略地图(蓝色网格,波状外形的1σ)5-FOA ScDHOase。绑定5-FOA(绿色)和ScDHOase(浅蓝色)所示。两个锌原子显示为灰色球体。
3.3。5-FOA绑定模式

绑定模式EcDHOase [13]和huDHOase [11]5-FOA也建立了利用结构信息。在这些结构中,5-FOA绑定到DHO活跃的网站在一个类似的模式。然而,我们的包裹显示ScDHOase绑定5-FOA(数据结构2 (c)和2 (d)从EcDHOase和huDHOase)不同。确认绑定模式不同,我们比较他们的密度值的绑定5-FOA ScDHOase使用傻瓜。5-FOA观察到的绑定模式EcDHOase和huDHOase精制使用傻瓜中的刚体真实空间细化为ScDHOase平均省略地图。密度的适应值绑定5-FOA ScDHOase平均省略的地图是0.95。当使用的姿势5-FOA EcDHOase和huDHOase密度的适应值绑定5-FOA ScDHOase是0.81。基于这些结果,我们排除这样一种可能性,即5-FOA绑定模式必须类似于ScDHOase EcDHOase huDHOase。

加强的结论ScDHOase绑定5-FOA不同于EcDHOase huDHOase,我们还检查了平均RMSZs(配位几何指标)5-FOA ScDHOase在我们的复杂结构(PDB项7 ca0;1.58的键长和键角的2.02),而与报道huDHOase 5-FOA结构绑定(PDB项4 c6m;债券长度的4.12和6.11的键角)和EcDHOase (PDB项2 eg8, 3.0的键长和键角的4.58)。基于这些价值观,提出5-FOA绑定模式ScDHOase通过复杂的结构是合理的和明显的。

对于ScDHOase,羧基的5-FOA结扎锌原子(图3(一个)),而不是与带正电的侧链的交互Arg18在EcDHOase(图3 (b))和huDHOase(图3 (c))。的绑定5-FOA ScDHOase采用相反的方向与EcDHOase和huDHOase。此外,灵活的循环在每个单元ScDHOase都参与5-FOA的绑定(图2 (b))。两个刺残留物(Thr105和Thr106) ScDHOase绑定中发挥了至关重要的作用。对于EcDHOase(图3 (d))和huDHOase(图3 (e)),灵活的循环是不参与5-FOA的绑定。尽管类似的活性部位,5-FOA绑定姿势的构象和催化循环的ScDHOase 5-FOA绑定(通过循环模式)不同于那些EcDHOase(图3 (f)通过环)和huDHOase(模式)。我们的结论是,ScDHOase 5-FOA绑定和抑制机制的不同于EcDHOase huDHOase。

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图3
新的5-FOA绑定模式。(a)与5-FOA ScDHOase的活性部位。(b)的活性部位与5-FOA EcDHOase (PDB项2 eg8)。5-FOA到活动网站的绑定模式非常类似于DHO。(c)的活性部位与5-FOA huDHOase (PDB项4 c6m)。相比之下,绑定5-FOA ScDHOase采用相反的方向相比,在EcDHOase和huDHOase的活性部位。(d) EcDHOase环绑定模式。(e) huDHOase环绑定模式。灵活循环EcDHOase和huDHOase没有参与5-FOA的绑定。(f)的叠加ScDHOase EcDHOase复合物。 Despite having a similar active site, the 5-FOA binding pose and the conformation of the catalytic loop of ScDHOase differ from those of EcDHOase.

根据我们的结构、Arg18 Asn43, His262, Thr105, Thr106, Lys230 ScDHOase参与5-FOA绑定(图4)。ScDHOase 5-FOA绑定模式在某种程度上类似于绑定模式EcDHOase 2-oxo-1, 2, 3, 6-tetrahydropyrimidine-4, 6-dicarboxylic酸(HDDP) [13]。EcDHOase绑定HDDP通过循环模式。同样,绑定HDDP EcDHOase利用其羧基与锌原子和稳定灵活的循环。像ScDHOase-5-FOA复杂,Thr109和Thr110 EcDHOase绑定HDDP起到了至关重要的作用。


图4
5-FOA ScDHOase绑定模式。Arg18、Asn43 His262、Thr105 Thr106, Lys230 ScDHOase参与5-FOA绑定。
3.4。绑定和突变分析

荧光猝灭法用于确定离解常数(KdScDHOase绑定到5-FOA(图)5(一个))。KdScDHOase突变体R18A(图5 (b))和T106A(图5 (c))也决定通过荧光猝灭确认与5-FOA ScDHOase相互作用的强度。淬火是指复杂的形成过程,减少蛋白质的荧光强度。ScDHOase显示强烈的内在荧光峰值波长为324 nm兴奋时280海里(图5(一个))。5-FOA滴定到ScDHOase解决方案时,内在的荧光蛋白质逐渐熄灭。在200年的μM 5-FOA ScDHOase的固有荧光,ScDHOase-R18A,和ScDHOase-T106A就熄了78.2%,75.9%,和64.6%,分别为(表2)。添加5-FOA导致红移的ScDHOase发射波长(∼11.5 nm;λ马克斯从324.0到335.5海里)。添加5-FOA也导致红ScDHOase-R18A变化(∼10.0 nm;λ马克斯从324.5到334.5 nm)和ScDHOase-T106A (∼5.5 nm;λ马克斯从328.0到333.5海里)。的λ新兴市场由5-FOA ScDHOase-T106A转移(5.5海里)明显低于ScDHOase(11.5海里)。这些观察表明,ScDHOase、ScDHOase-R18A ScDHOase-T106A 5-FOA可以形成一个稳定的复杂,分别;然而,这些ScDHOases的结合亲和力是不同的。通过滴定曲线(图确定5 (d)),KdScDHOase值、ScDHOase-R18A ScDHOase-T106A绑定到5-FOA分别为83.8±1.5,143.6±2.1,114.8±3.7μM,分别。我们也比较了绑定亲和力ScDHOase的抗癌药物5 -氟尿嘧啶(研究者用)和5-aminouracil (5-AU)。基于Kd值,复杂的力量形成遵循以下顺序:ScDHOase-5-FOA > ScDHOase-R18A-5-FOA > ScDHOase-T106A-5-FOA > ScDHOase-5-FU > ScDHOase-5-AU [18]。因此,ScDHOase首选5-FOA的绑定(表2)在研究者用和5-AU [18]。

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图5
荧光滴定与5-FOA ScDHOase。(a)的荧光发射光谱ScDHOase 5-FOA不同浓度(0 - 200μM;0、10、20、50、75、100,125,150,175,200μ米)。减少固有荧光的蛋白质为324 nm激发态荧光光谱仪在280海里。ScDHOase显著的荧光发射光谱强度与5-FOA淬火。(b)的荧光发射光谱ScDHOase-R18A 5-FOA不同浓度(0 - 200μ米)。(c)的荧光发射光谱ScDHOase-T106A 5-FOA不同浓度(0 - 200μ米)。ScDHOase-R18A和ScDHOase-T106A单独显示强烈的内在荧光峰值波长为324.5在280 nm和328 nm兴奋。(d)整除的5-FOA添加到酶解决方案确定K d。K d是通过以下方程:Δ吗F=ΔF 马克斯−K d(ΔF/ [5-FOA])。数据点平均2 - 3决定10%的误差范围内。
表2
绑定参数ScDHOase 5-FOA。

减少的内在荧光ScDHOase测量荧光光谱仪(日立f - 2700;日立高新技术、日本)。Kd使用以下方程得到:ΔF=ΔF马克斯−Kd(ΔF/ [5-FOA])。

3.5。结合5-FOA通过循环模式

尽管进化趋异(图1),一个重要的灵活循环作为一个盖子DHOase催化和底物的活性部位内绑定是守恒的大肠杆菌(13]人类[11]。5-FOA、产品像抑制剂结合的活性部位EcDHOase以类似的方式通过环形DHO绑定模式(数据2和3);即循环不与配体相互作用或与其它活性部位(13]。尽管非常相似的活性部位,ScDHOase绑定5-FOA通过使用不同的机制。通过循环模式,绑定5-FOA ScDHOase采用相反的方向,由EcDHOase相比。我们还观察到ScDHOase 5-AU,研究者用,苹果酸通过循环模式(18]。到目前为止,我们还没有找到ScDHOase结合配体的环形模式。ScDHOase能否结合配体通过环形构造仍然是未知的。鉴于ScDHOase的灵活的循环是最长的在这些DHOases(图1 (b)),他们可能在某种程度上不同的绑定机制(图3)。也许,这个循环的构象变化ScDHOase没有必要由于位阻。这些不同的绑定模式是否物种——或者crystallography-dependent应该阐明实验。

循环绑定模式也见于DHPase [29日,32,33)和尿囊素酶(ALLase) [34]。DHOase [1],DHPase [35- - - - - -37],ALLase [38,39]环酰胺水解酶家族的成员32,40]。这些metal-dependent酶催化的环酰胺键的水解底物5 -或六元环嘌呤和嘧啶代谢的(1,32]。守恒的酪氨酸残基位于一个动态循环DHPase [30.,33)稳定的四面体中扮演着重要的角色在水解底物的过渡态,崩溃的过渡态,形成产品,发布产品。因此,这些循环的动态循环酰胺水解酶抑制剂的设计可能是一个合适的药物目标(30.,41]。结构分析还需要DHOases破译的体系结构和功能不同。

4所示。结论

复杂晶体结构与抑制剂5-FOA ScDHOase确定分辨率2.5揭示了一个新的绑定模式。尽管ScDHOase股票与EcDHOase结构相似,他们似乎绑定5-FOA不同。我们也为绑定的5-FOA ScDHOase利用荧光猝灭和突变分析。通过循环模式,守恒的刺残渣坐落在一个灵活的循环ScDHOase 5-FOA绑定的至关重要。结构分析表明,DHOase物种之间的内在差异灵活循环可能5-FOA绑定模式的决定因素。进一步的研究可以直接关注确定为什么DHOases需要的不同灵活循环催化在进化过程中发展。

数据可用性

原子坐标和相关结构因素与加入代码存入PDB 7 ca0。所有的数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关这项研究的出版物。

确认

作者承认同步加速器辐射的蛋白质结晶学的生物技术国家核心设施项目,科技部,台湾,提供实验设施和技术服务。这项研究是由科学技术部支持,台湾(大多数108 - 2320 b - 040 - 010 c . y . H。,大多数109 - 2622 - e - 025 - 006 e . s . L。,和107-2923-B-213-001-MY3 and 108-2311-B-213-001-MY3 to C. J. C.), and also in part by grants from NSRRC to C. J. C..