高通量的方法解开的作用机制的一个新的vanadium基化合物鲁兹锥体

摘要

治疗南美锥虫病，由寄生虫引起鲁兹锥体，一直以来基于对两种药物，硝呋莫司和苄硝唑，尽管延长了处方之后描述的毒副作用。在这项工作中，我们研究了基于钒一个新的预期抗锥体虫药，这里命名为V⁴O (5 brsal) (aminophen)。我们找到了一个好的IC₅₀值(3.76±0.08)μ男，在CL布雷纳epimastigotes。细胞死亡机制的分析，使我们能够排除基于早期凋亡或坏死机制的含义。恢复测定揭示一个trypanostatic效果，并伴有细胞形状和运动性的改变。大多与寄生虫的不溶性级分关联的摄取是通过钒确定推导出。Concordantly, no drastic changes of the parasite transcriptome were detected after 6 h of treatment. Instead, proteomic analysis uncovered the modulation of proteins involved in different processes such as energy and redox metabolism, transport systems, detoxifying pathways, ribosomal protein synthesis, and proteasome protein degradation. Overall, the results here presented lead us to propose that V⁴O(5Brsal)(氨基酚)对锥虫有抑制作用克氏锥虫影响寄生虫不溶性蛋白质。

1.介绍

南美锥虫病是由原生动物寄生虫引起的鲁兹锥体由吸血锥蝽臭虫主要传输到哺乳动物宿主。它也可以发送先天，从被感染的母婴，输血和器官移植或通过受污染的食物摄入。目前，大约有800万感染者，万只每年死亡，以及生活在危险区约25万人，拉丁美洲[主要是农村地区1]。南美锥虫病仍然是该地区最重要的寄生虫病，并被世界卫生组织列为20种被忽视的热带病之一认可。虽然南美锥虫病在拉丁美洲流行，它已经得到越来越多的关注，因为它传播给非流行国家（美国，加拿大，西班牙，澳大利亚和日本，等等）2]。在不知情的情况下受感染的人从拉丁美洲移民，以及缺乏对输血和器官移植的控制，可能是这种疾病传播的原因。

目前化疗是基于两个近50岁的老药：苄硝唑和硝呋替莫。二者均显示严重的副作用，在慢性期有争议的功效，并在一些地区耐药性的发展。因此，需要新的毒性更小，更有效的药物。虽然许多天然和合成的化合物已被测定对酶活性克氏锥虫，只有少数人拥有先进的临床试验，但均告失败[1，3，4]。在过去的几十年中，无机药物化学领域已表明它开发准金属基药物寄生虫病的治疗[容量五-11]。此后，钒已成为一个金属与用于医疗用途的显着的潜在胰岛素增强和抗肿瘤化合物[12-14]。最近，一些努力，一直致力于为未来的钒剂的开发被忽视的寄生虫病[7，15]。

寻找活动反对克氏锥虫，我们小组设计oxidovanadium（IV）基化合物，包括聚吡啶配体（NN）与DNA嵌入容量[16-23]。特别是，37一族结构相关的[V⁴O(L-2H)(NN)]配合物，包括水杨醛衍生物的氨基脲类作为coligands大号已被证明是根据它的亚微摩尔的半最大抑制浓度有为（IC₅₀）范围和相比于哺乳动物细胞中的高选择性。其中，5-溴水杨醛缩氨基脲衍生物，[V⁴O (L-2H) (NN)],在那里大号5-溴化烯醛是氨基脲，NN是5-氨基-1,10-菲罗啉，这里命名为V⁴O（5Brsal）（aminophen）为简单起见（图1)，站了出来，显示了一个IC₅₀值为0.27μM于克氏锥虫(Tulahuen 2株epimastigotes)，使用J774巨噬细胞选择性185 [20]。

以V的溶液的稳定性⁴O（5Brsal）（aminophen）朝向溶剂分解和/或氧化先前通过电子顺磁共振（EPR）和V-51核磁共振（NMR）[研究20]。仅部分氧化，导致[V^VØ₂（5Brsal-2H）（溶剂）]，则aminophen heteroligand的位移后，观察到。这种新的V（V）的物种被证明是对非能动克氏锥虫，游离氨基酚IC增高20倍₅₀对寄生虫比原来的V值⁴O（5Brsal）（aminophen）物种[19，20]。此外，V⁴O（5Brsal）（aminophen）显示出比aminophen一个97倍更高的选择性[20]。因此，完整的初始V⁴O（5Brsal）（aminophen）化合物被认为是活性种。

在这里，我们研究了这种钒化合物的作用方式作为对前瞻性剂克氏锥虫（CL布雷纳应变）。我们分析所涉及的细胞死亡机制和寄生虫恢复响应。另外，钒的由寄生虫及其与寄生虫大分子关联摄取量进行了测定。最后，蛋白质组学和转录战略是，以查明受影响的推测途径或可能的分子靶标。据我们所知，这是第一次组学关于对基于金属的预期代理执行的这些特性研究克氏锥虫。

2。材料和方法

2.1。试剂和V⁴O (5 brsal) (Aminophen)合成

的5-溴水杨醛缩氨基脲配位体的合成和表征如先前由5-溴水杨醛和氨基脲[的等摩尔混合物报道24]。对于[V的合成⁴O(L-2H)(NN)]络合物，一种乙醇悬浮液，经氮气净化，0.375 mmol大号5-胺-1,10-菲罗啉的0.375 mmol⁴O（ACAC）₂乙酰丙酮),中航商用飞机有限公司表示,在加热回流下氮4 h,和红棕色固体形成的过滤,用乙醇和乙醚洗净,并以C、h、N元素分析和傅里叶变换红外(FTIR)和电子顺磁共振光谱学之前报道(20，22]。

2.2。寄生虫和细胞培养

克氏锥虫epimastigotes（CL布雷纳株）在补充有10％胎牛血清的脑心浸液（BHI）培养基中维持在28℃和每三天通过。

2.3。的决心体外反鲁兹锥体活动

反克氏锥虫活性是按照以前报道的方法测定的[25-27]。简单地说，一个11.25毫米V⁴O（5Brsal）（aminophen）溶液在二甲亚砜（DMSO）中制备。Epimastigoteswere counted using the Neubauer chamber, and 1 × 10⁶寄生虫/ mL的在200中的96孔板中温育 μL BHI最多包含16个μmv⁴O (5 brsal) (aminophen)。在时间0时的初始寄生虫密度（一个₀）和孵化后五天寄生虫增殖（一个_五)在595 nm处用吸光度法测定。单独用DMSO培养基孵育对照寄生虫，计算其增殖抑制率，计算公式为:%寄生虫增殖=(一个_五-一个₀)/ (_5C−一_0℃)×0100，其中_5C和A_0℃分别为对照培养第5天和第0天的视密度。在所有情况下，DMSO都没有超过0.04%的最终浓度。建立了剂量-响应曲线，并进行了IC分析₅₀值使用GraphPad Prism 6.00版本的Windows（格拉夫派得软件）确定。Ťhe results are presented as averages ± SD (standard deviation) of six independent biological replicates.

2.4。细胞死亡机制

使用死亡细胞凋亡试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行细胞死亡机制分析。分别在1倍、5倍和10倍的培养基中孵育24小时₅₀V的⁴Ø（五Brsal)(aminophen), harvested by centrifugation, washed with phosphate-buffered saline (PBS), and incubated for 15 min with 5 mg/mL Alexa Fluor® 488 annexin V (AV) and 10 mg/mL propidium iodide (PI), followed by dual-parameter analysis using an Accuri C6 (BD Bioscience) flow cytometer. For AV and PI detection, a 533/30 nm signal detector (FL1) and a 670 nm long pass signal detector (FL3) were used, respectively. Two independent experiments were performed in duplicate for each V⁴O(5Brsal)(氨基酚)浓度，各获得10000个事件。数据分析使用BD CSampler软件(BD Bioscience)。未处理的寄生虫被用作对照。细胞凋亡和坏死阳性对照，用h处理寄生虫2.5 h₂Ø₂50 μ米和100μ男，分别。

2.5。生活/死亡分析

细胞活力用钙黄绿素AM（CA）和碘化丙啶（PI）（赛默飞世尔科技）来评估。Nontreated parasites and compound-treated parasites were harvested by centrifugation after 24 h of incubation and resuspended in 0.1 mL 1x PBS containing 0.1 mM of CA and 10 mg/mL of PI. Samples were incubated for 60 min at RT and immediately analyzed by flow cytometry with a 533/30 nm filter (FL1) for CA and a 670 nm long pass filter (FL3) for PI. The fluorescence intensity of two independent experiments was acquired for 10,000 events, and the data were analyzed using BD CSampler software (BD Bioscience).

2.6。形态学分析

扫描电镜为1×10⁶parasites in exponential growth phase, untreated or treated for 6 h with 5x IC₅₀V的⁴O（5Brsal），洗涤（aminophen）用PBS和用4％的多聚甲醛。然后将样品进行脱水随丙酮（30-100％）和浓度金涂覆在喷镀金属溅射镀膜机SCD050 / LEICA。金属化后，在扫描型电子显微镜（飞利浦XL30，埃因霍温）观察样品。

2.7。恢复试验

复苏的化验克氏锥虫如先前所述进行epimastigotes [25，28]。Epimastigoteswere incubated for 4 h with 1x, 5x, and 10x IC₅₀V的⁴O（5Brsal）（aminophen）中并用，并转移到新鲜的不含化合物的BHI。Parasite proliferation was followed at 595 nm in a Thermo Scientific Varioskan® Flash Multimode for 24, 48, and 72 h. To calculate relative proliferation, untreated control parasites were used.

2.8。V⁴O（5Brsal）（Aminophen）吸收测定和高分子关联分析

通过用V培养寄生虫来测定其对钒的吸收⁴O(5Brsal)(氨基酚)接着电热原子吸收光谱在热冰3500分光光度计(Thermo Fisher Scientific)。附睾(1×10)⁷在1,5和10x的IC中孵育24小时₅₀钒化合物。在指定的时间点，8×10⁷离心收集寄生虫，洗涤一次，重悬PBS定量钒。同时测定了上清液中非内化钒的含量。对三种评估浓度中的每一种进行了两个独立实验。

Ťo determine the association of vanadium with nucleic acids (3 × 10⁷寄生虫),向导®GenomicDNAPurificationKit（Promega）和TRIzol试剂（Life Technologies）中对DNA和RNA分离，分别使用。For protein analyses, parasites (4 × 10⁷)重悬于1ml的寄生虫裂解缓冲液中，该缓冲液含有10mm Tris-Cl pH 7.5, 1mm EDTA, 1% CHAPS, 10%甘油，0.5% Triton，和完成™ProteaseInhibitorCocktail(罗氏);4℃搅拌30分钟;2万g, 4℃离心1 h，使可溶性与不溶性分离。然后在每个馏分中测定了缔合的钒。所有分析测定和每个样品分别进行两次独立实验，每个样品分别进行两次钒测定。

2.9。转录组和蛋白质组分析

从寄生虫中分离得到总RNA(1×10)⁹），未处理的和与5倍IC处理₅₀V⁴Ø（五Brsal)(aminophen) during 6 h, using TRIzol (Life Technologies) reagent following the manufacturer’s instructions (three independent replicas for each one). PoliA + RNA pair-end sequencing was performed at Macrogen using Illumina TruSeq™ RNA Sample Preparation Kit v2 and HiSeq 2500 (http://www.macrogen.com)。Trimmomatic [29]用于获得良好的质量的序列读取被映射到克氏锥虫基因组（版本29，http://tritrypdb.org）在非常敏感的模式中使用蝴蝶结2三十]。序列的数目每基因读取用htseq计数[确定31]。差分被利用DESeq2包[确定表达的基因32]。

Ťotal proteins from parasites (1 × 10⁹），未处理的和与5倍IC处理₅₀V⁴Ø（五Brsal)(aminophen) during 6 h, were isolated by incubation with lysis buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS) for 30 min at 4°C, centrifuged at 4°C for 1 h at 20,000g to separate soluble from insoluble fractions, and analyzed by LC tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS) (three independent replicas). Briefly, 20 μ每个样品的g用预制的4%-12%梯度凝胶(NuPAGE, MES System, Invitrogen)溶解。每个lane都被切割并按照之前报道的协议进行质谱分析处理[33]。肽样本分离成nano-HPLC系统(EASY-nLC 1000,热科学)配备一个反相柱(PepMap™, RSLC,使用C18, 2 m, 100 a, 50 mm×15厘米,热科学)使用梯度从50%到100%的乙腈0.1%甲酸250 nL /分钟的流量。肽分析在LTQ Velos nano-ESI线性离子捕集仪(Thermo Scientific)中进行，该仪器运行于数据依赖采集模式(top 10)，动态排除列表为45 s。数据分析使用PatternLab for Proteomics software (version 4.0.0.84)进行。原始文件被搜索的目标诱饵数据库生成鲁兹锥体（菌株CL布雷纳）从UniProt的下载序列（http://www.uniprot.org），applying the following parameters: trypsin as proteolytic enzyme with full specificity, methionine oxidation as variable modification, cysteine carbamidomethylation as fixed modification, and 800 ppm of tolerance from the measured precursorM / Z。PatternLab的大约区比例维恩图和T-折模块被用于定量分析数据[34-36]。

2.10。实时荧光定量PCR

使用SYBR Hi-ROX试剂盒(Bioline)进行定量RT-PCR (qRT-PCR)，检测时间为10ng /μ使用随机引物和Superscript II（Life Technologies）中从每个转录生物复制品的RNA得到的cDNA中的L.设计特异性引物与赛默飞世尔科技的OligoPerfect底漆Designer工具（https://www.thermofisher.com)。由于根据所获得的转录组数据，其转录水平在被处理寄生虫和对照寄生虫之间不存在差异，因此我们将threonyl-tRNA合成酶基因作为一个内扩增控制。以终浓度为0.4的引物进行反应μM在StepOnePlus实时PCR系统中退火温度为60℃。所有反应重复进行。所得数据用StepOnePlus™软件v2.3处理，RNA的相对值由2进行测定^-ΔΔCT方法(37]。

3.结果

3.1。V的生长抑制机制⁴O（5Brsal）（Aminophen）在T.克氏锥虫Epimastigotes

作为研究其抗增殖作用机制的第一步⁴O（5Brsal）（aminophen）上克氏锥虫并分析其生长抑制曲线，确定其IC值₅₀，(3.76±0.08)μM，在CL Brener应变(图2)。

寄生虫在28℃生长5天在BHI与V的指定浓度⁴O (5 brsal) (aminophen)。每个点代表六个独立实验的平均值与相关的标准误差。

为了发现早期凋亡或坏死/晚期凋亡等细胞死亡机制是否参与其中，我们使用前述的荧光标记探针AV和PI进行了流式细胞术分析[25-27]。温育后不存在AV和/或PI阳性细胞与任一1×，5倍，或10倍IC₅₀for 24 h suggests that neither apoptosis nor necrosis processes were triggered by the V⁴O（5Brsal）（aminophen）处理（图图3（a）)。Similar results were obtained for 6 and 12 h of incubation. To determine whether treated parasites were dead or growth arrested, a live/dead assay was performed using fluorescent Calcein AM. As shown in Figure图3（b），细胞酯酶活性不受影响（用1x IC₅₀）或略有下降（与5倍和10X IC₅₀)。此外，在体内（5Brsal）（aminophen）处理寄生虫没有急剧的形态学变化可以通过扫描电子显微镜使用5×IC时所观察到₅₀（数字3 (c))。然而，一种倾向，具有缩短的细胞体和运动性的清晰损失（未示出）进行了观察。

考虑到这些结果证明了经典的细胞死亡的机制不参与V的寄生虫生长抑制⁴O(5Brsal)(氨基酚)，我们通过Kessler描述的回收率试验研究了锥虫抑制作用的存在[28]。经过足够诱导细胞死亡机制的潜伏期后，在所有测试浓度下，未处理和处理过的寄生虫观察到类似的生长恢复情况(图)4)。这一结果证实了行动，为伏trypanostatic机制⁴O(5Brsal)(氨基酚)，因为在这种化合物的存在下，寄生虫的生长受到抑制，但在没有这种化合物的情况下，寄生虫可以恢复生长。

3.2。钒在吸收克氏锥虫表括约肌用V治疗⁴O (5 brsal) (Aminophen)

为了提前对理解trypanostatic作用的分子机制，我们由寄生虫估计钒摄取量。如图图5（a）对1倍、5倍和10倍的IC，寄生虫对钒的吸收呈剂量依赖性，分别为0.50、1.18和3.51 nmol₅₀V的⁴分别为O (5 brsal) (aminophen)。值得注意的是，疟原虫对钒的吸收量平均仅为培养混合物中钒的2.4%(总钒:1x IC为15 nmol)₅₀)。这种低摄取篮与寄生虫相关的钒的详细亚细胞分布的分析。

考虑到配体的能力之内的核酸插层[19，并分析了其与寄生虫DNA和RNA的特殊关联。尽管钒值较低，但与寄生虫的核酸相关(8.9×10)^-5µg V/µg DNA and 6.46 × 10^-6µg V/µg RNA)，观察到与DNA的有利联系(图)图5（b）)。

然而，使用简单的分馏方法中，金属与不溶性级分的优选协会（90％以上的摄取钒的）中观察到（图图5（c）)。这一结果表明，V⁴O（5Brsal）（aminophen）可被与膜相关的蛋白质相互作用。

3.3。早期基因组反应克氏锥虫Epimastigotes V⁴O（5Brsal）（Aminophen）治疗

鉴定涉及在V的作用模式的关键分子以及可能的途径⁴O（5Brsal）（aminophen），我们研究了拥有5 IC孵化寄生虫引起的主要变化OMIC₅₀V⁴Ø（五Brsal)(aminophen) for 6 h. We selected a relative short time of incubation to study only the early response triggered specifically by the compound, thus avoiding the incidence of general late or/and indirect mechanisms.

用于转录的变化进行分析，三个独立的生物学重复进行测序对于每种条件，以及至少7000000配对末端序列读数被映射到参考克氏锥虫使用基因组蝶形2（表S1)。重复有很好的相关性(皮尔逊相关系数) )。比较转录组分析揭示了在治疗上的mRNA稳态水平最小的变化。事实上，在总共10951个映射转录物，小于100个转录物（0.008％）的差异表达，考虑到0.01的假发现率。如所预期的，其中大多数（47％）的编撰没有已知功能或功能性的信息或域假定蛋白。

此外，只有2个差异表达转录本(假想蛋白编码)的折叠变化大于1.5(表)S2)。对部分基因进行qRT-PCR以确认转录组数据(图)S1)。两者之间的良好的相关性接近，得到（转录和qRT-PCR），用于所选择的组的基因（R皮尔逊0.97）的。用于蛋白质组的变化的分析，猎枪策略测定，以单独确定由于钒化合物的温育可溶性和不溶性蛋白质的变化。

不溶性蛋白质级分的蛋白质组分析揭示了共248过多和110在V代表不足不溶性蛋白质⁴O（5Brsal）（aminophen）寄生虫，与对照未处理的寄生虫进行比较（表S3)。细胞色素P450（TcCLB.506945.190）似乎是最下调不溶性蛋白质。有趣的是该蛋白已经参与介导解毒过程（表S3)。在最上面的不溶性蛋白中，我们发现了构成丙酮酸脱氢酶复合物组分的两个乙酰转移酶(TcCLB.509717.20, TcCLB.510105.170)和一个谷胱甘肽- s -转移酶/谷胱甘肽(TcCLB.506443.70)。一些还原酶(TcCLB.506821.210, TcCLB.510819.4)、氧化还原酶(TcCLB.507049.60, TcCLB.506485.80)和水解酶(TcCLB.503399.20, TcCLB.506931.10, TcCLB.506747.30)在处理后的寄生虫的不溶性蛋白部分以及几种核糖体蛋白中也出现过高表达(表)S3)。

在可溶性蛋白方面，有122个出现过低表达，其中105个只出现在未处理的对照组中。我们发现了一些ATP结合的卡式转运蛋白(ABC转运蛋白:TcCLB.506925.530, TcCLB.510943.80, TcCLB.507099.80)，后两者参与药物释放机制[38]。此外，相关的解毒过程的一些其它蛋白质的丰度也被修改（图6)。此外，KEGG通路分析表明，该病毒可能存在⁴O(5Brsal)(氨基酚)处理影响蛋白表达的调控过程，因为涉及剪接体、氨基酸生物合成(Gly、Ser、Thr和His)、氨基酰基- trna生物合成、核糖体和蛋白酶体的蛋白质丰度似乎发生了改变(表)S4)。有趣的是，提及蛋白酶蛋白也是不溶性蛋白质所占比例过高（表S3)。最后，能量代谢似乎也受到V的影响⁴O(5Brsal)(氨基酚)处理，因为许多与碳代谢过程相关的蛋白质的丰度被修饰，如柠檬酸循环、糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢和氧化磷酸化(表)S4)。

4.讨论

这项工作的目的是评估在新的基于钒化合物的作用的细胞和分子机制克氏锥虫。增殖实验显示的IC₅₀值(3.76±0.08)μM, similar to the one of the reference drug nifurtimox, (2.8 ± 0.2) μM [25，26]。因此,V⁴O(5Brsal)(氨基酚)是一种很有前途的抗增殖化合物。

克氏锥虫。值得一提的是，完全抑制未与测定化合物浓度下达到（图2)。要了解这个问题，我们决定更深入地研究这种化合物的作用方式。

关于抑制寄生虫的生长，负AV和PI标记的机理表明，既不凋亡也不坏死是参与。此外，代谢活性的轻微下降，从酯酶分析推导出，以及不存在的特性急剧形态变化，如细胞膜破裂或细胞体增加[38]，提出了一种生长停滞现象，而不是另一种细胞死亡机制的参与。相反，V的作用的trypanostatic模式⁴O（5Brsal）（aminophen）上克氏锥虫被回收试验证实。

虽然由寄生虫摄取的化合物的百分比（用于孵育的总钒的小于2.4％）类似于用于例如顺铂（3％），奥沙利铂（1％）的其它公知的金属的抗增殖化合物获得，或pyrodach-2（0.1％）在三个不同的人类细胞系[39]，它比采用其它基于金属的化合物（20％以上）中获得的那些显着下克氏锥虫epimastigotes [25，26]。尽管如此，低V⁴O(5Brsal)(氨基酚)摄取足以发挥抗寄生虫作用。虽然这个钒基化合物系列已设计包括插层分子，及其体外DNA协会有报道[19)在当前体内与核酸相关的测定法仅痕量钒可以检测到。无论如何，这种低量可以是足以影响DNA复制占恢复测定中观察到的细胞生长抑制效应。在另一方面，与不溶性级分（90％）一个惊人的关联被发现。值得一提的是该馏分主要含有膜结合的蛋白，但也包括在翻译后修饰的蛋白质的脂质和多样化的官能团。

高通量分析是最近才实施，以分析参与动质体抗药性的机制和药物[作用方式40，41]。旨在加深对V的分子作用机制的研究⁴O（5Brsal）（aminophen）上克氏锥虫，我们对早期改变的转录本和蛋白质进行了组学分析，因为这种新的化合物治疗了寄生虫。转录组分析显示一些差异表达的转录本(小于100，小于1%)具有低水平的上调或下调(大多数具有log)₂Fold change < 0.5), which may be in accordance with the low体内钒的关联与寄生虫核酸。然而，这些变化的重要性不可低估。例如，在一个给定的调节蛋白表达的非常细小的改动可能会导致寄生虫一个全球性的效果，如果它在关键的代谢途径参与。钒化合物对寄生虫转录的低的效果可通过其优选的解释体内与不溶性部分而不是与核酸的联系(图)五)。另一方面，我们发现，在处理后的总鉴定蛋白中，有14%(3638个蛋白中的523个)差异丰富，其中大部分在不溶性蛋白部分(68%)(图)S2)。检测3,638总蛋白质的数量与前面一致克氏锥虫蛋白质组学分析，已经报道的2784的识别[42]和4920种蛋白质[43]。蛋白质组学仅用于恰加斯病的化疗研究，分析萘吡唑的作用模式，在表腺中检测到30个差异丰富的蛋白[44]和61例trypomastigotes [45]。相反，我们的结果反映了V的多效分子效应⁴O (5 brsal) (aminophen)。许多不溶性部分的差异表达蛋白已经被报道参与介导解毒过程。其中细胞色素P450值得注意的是，其减少的丰度治疗寄生虫可以解释缺乏有效的解毒反应[46]。其它表达差异的有趣蛋白质包括乙酰转移酶、还原酶和水解酶。而转移酶、氧化酶、还原酶或水解酶参与内在化化合物的修饰已被报道[47，48，这些结果表明V的主要作用⁴O（5Brsal）（aminophen）开车到早期的能源和氧化还原代谢紊乱。由于许多核糖体蛋白在治疗寄生虫差异表达（表S3），尽管该化合物的mRNA的最小关联（图五），我们可以推测，在翻译过程中可能会受到影响。其中减少的可溶性蛋白，我们发现ABC家庭药物驱逐机制，其作用的运输已经先前提出的[49]。以这种方式，该化合物消除可减少，因此允许延长其trypanostatic效果。此外，在我们的蛋白质组学分析，蛋白酶体的蛋白过多出现在可溶性和不溶性蛋白质组分处理的寄生虫。蛋白酶体最近研究的颇具前景的药物疟疾，利什曼病，南美锥虫病和昏睡病[目标50，51]。

这是诱人的推测，可能直接抑制蛋白酶体的V⁴O（5Brsal）（aminophen）可能导致增加的蛋白酶体蛋白质产生妨碍的化合物的效果。所述过表达的蛋白酶体的蛋白质可通过的需要更活性的蛋白酶体降解它们广泛蛋白修饰的存在也说明。

总之，数据这里提出，支持V的行动的主要模式的想法⁴O(5Brsal)(氨基酚)通过修饰许多寄生虫蛋白的丰度。而在V的驱动下，蛋白质含量发生了变化⁴O（5Brsal）（aminophen），可能是由于其与蛋白质靶促进它们的降解或稳定直接关联，所述化合物也可以是特别影响参与蛋白质的生产和降解过程，从而扩大了作用的蛋白质。

5.结论

总之，这项工作提供了细胞和分子反应的完整描述Ť。克氏锥虫展望了一种新的钒基抗寄生虫化合物。有趣的是，非常好的IC₅₀为V确定值⁴O（5Brsal）（aminophen）通过行动trypanostatic模式达到适度影响细胞的形状和运动。此化合物的寄生虫早期反应显示在mRNA水平没有剧烈的变化。尽管如此，蛋白质组分析揭示关于蛋白质丰度识别可能参与这种大规模的响应，并在药物代谢特异性蛋白广泛的效果。结合使用OMIC方法使我们能够识别驱动寄生虫的生长有很好的抑制，即使在检测到非常低的水平摄取受影响的过程。从全球来看，这里的结果呈现构成了贡献，了解这一潜在药物的作用对南美锥虫病的治疗机制。此外，它们有助于洞察金属组学，蛋白质组学，以及基于金属的抗锥体化合物转录，鼓励这种早期的研究领域。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的转录组和蛋白质组数据包括在补充资料文件中;原始数据也可以通过电子邮件发送相应的作者获得。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

这项工作是由国立通讯社德InvestigaciónËINNOVACIÓN（ANII）（批准号ANII FMV_1_2014_1_103957和POS_FMV_2015_1_1005183）和Programa德DESARROLLO德拉斯科学城Básicas，乌拉圭支持。

补充材料

图S1：用qRT-PCR的选择的基因的转录数据的验证。通过qRT-PCR分析随机选择的修饰转录物从转录数据列表中的表达进行比较未处理的和处理的寄生虫，和表达值（日志₂FC RT-PCR）进行针对转录数据作图（日志₂FC转录）。图S2：在判定差异丰富的蛋白质的克氏锥虫epimastigotes采用V治疗⁴O (5 brsal) (aminophen)。分析未处理(对照)和处理后寄生虫的可溶性(A)和不可溶性(B)蛋白。图中是蛋白质组学的PatternLab的T-Fold模块生成的火山图。在所有条件下至少4个重复中检测到的蛋白被标记为单独的点并绘制相应的图谱值(日志₂（p值））和倍数变化（日志₂(褶皱变化))。黑点表示既不满足折叠变化也不满足差异表达的统计标准的蛋白质，因此在不同条件下被认为是不变的。深灰色表示满足折叠变化但不满足差异表达的统计标准的蛋白质。浅灰色点代表低丰度蛋白，满足表达差异的fold change和q值标准，但由于光谱计数少，未考虑进一步分析。最后，白点对应于满足所有统计过滤的蛋白，代表菌株间差异表达的蛋白。有关白点对应的蛋白质的详细信息，请参阅补充表S3。表S1:对照未处理寄生虫和V的转录组分析的行数据统计⁴O（5Brsal）处理（aminophen）的寄生虫。表S2：从转录组分析差异表达的基因名单。V中的上调和下调成绩单⁴O(5Brsal)(氨基酚)处理的寄生虫相对于对照组未处理的寄生虫显示。表S3:蛋白质组学分析中差异表达的蛋白列表。可溶性和不溶性蛋白的上调和下调⁴O(5Brsal)(氨基酚)处理的寄生虫相对于对照组未处理的寄生虫显示在不同的标签中。表S4:利用STRING数据库对V中修改蛋白进行KEGG富集分析⁴O（5Brsal）处理（aminophen）的寄生虫。（补充材料）

参考

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