BCA 生物无机化学与应用 1687 - 479 x 1565 - 3633 Hindawi 10.1155 / 2020/1634270 1634270 研究文章 高吞吐量的方法来解开新的Vanadium-Based化合物的作用机制 鲁兹锥体 Mosquillo m .的卡 1 Smircich 巴勃罗 1 2 秘鲁首都利马 Analia 3 耶尔克 塞尔吉奥。 4 5 Scalese 冈萨洛 6 马查多 Ignacio 7 甘比诺 Dinorah 6 https://orcid.org/0000 - 0003 - 2679 - 8244 Garat Beatriz 1 https://orcid.org/0000 - 0002 - 5084 - 7619 Perez-Diaz 莱蒂西亚是 1 Keramidas Anastasios 1 Laboratorio de Interacciones分子 Facultad de Ciencias 大学de la那时 蒙得维的亚 乌拉圭 universidad.edu.uy 2 Departamento de Genomica 皇家研究院Investigaciones Biologicas克莱门特Estable 蒙得维的亚 乌拉圭 iibce.edu.uy 3 失去de Bioquimica y Proteomica Analiticas 巴斯德研究所de蒙得维的亚 蒙得维的亚 乌拉圭 pasteur.edu.uy 4 Biotecnos 技术和科学 蒙得维的亚 乌拉圭 5 生物技术部门 天主教大学的穆尔西亚 穆尔西亚 西班牙 6 区域Quimica Inorganica Facultad de Quimica 大学de la那时 蒙得维的亚 乌拉圭 universidad.edu.uy 7 区域Quimica Analitica Facultad de Quimica 大学de la那时 蒙得维的亚 乌拉圭 universidad.edu.uy 2020年 11 4 2020年 2020年 2 8 2019年 21 12 2019年 3 1 2020年 11 4 2020年 2020年 版权©2020 m .的卡Mosquillo et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

治疗恰加斯病、寄生虫病引起的 鲁兹锥体,一直是基于两种药物,使用苄硝唑和硝呋莫司,虽然经过长时间的描述的有毒副作用的处方。在这项工作中,我们研究一个新的潜在antitrypanosomal药物基于钒,这里叫V四世O (5 brsal) (aminophen)。我们发现了一个很好的集成电路50值,(3.76±0.08) μ米,在CL布雷纳指出epimastigotes。细胞死亡机制的分析使我们能够排除机制的含义根据早期细胞凋亡或坏死。复苏化验显示trypanostatic效应,伴随着细胞形状和肠胃蠕动。的吸收主要与不溶性部分推导了寄生虫通过钒决定。寄生虫转录组的想法一致,没有剧烈的变化检测治疗后6 h。相反,蛋白质组学分析发现参与不同的蛋白质的调制过程,如能源和氧化还原代谢,运输系统,排毒通路,核糖体蛋白质合成,蛋白酶体降解的蛋白质。总的来说,这里的结果提出了引导我们建议V四世O (5 brsal) (aminophen)施加trypanostatic影响 t . cruzi影响寄生虫不溶性蛋白质。

 Nacional de Investigacion e Innovacion通讯社的记者 ANII FMV_1_2014_1_103957 POS_FMV_2015_1_1005183 项目Desarrollo de las Ciencias Basicas,乌拉圭 1。介绍

恰加斯病是由原生动物寄生虫引起的 鲁兹锥体这主要是传播吸血锥蝽臭虫的哺乳动物宿主。它也可以先天地传播,母婴感染,通过输血和器官移植或因摄入受污染的食物。目前,大约有800万人感染,每年10000人死亡,大约2500万人生活在危险区域,主要是拉丁美洲的农村地区 1]。恰加斯病仍然是该地区最重要的寄生虫病,被世界卫生组织认可的20个被忽视的热带疾病。尽管恰加斯病流行在拉丁美洲,正在获得越来越多的关注,由于其传播nonendemic国家(美国、加拿大、西班牙、澳大利亚和日本等)( 2]。拉丁美洲的移民在不知情的情况下被感染的人,缺乏控制输血、器官移植可能构成了疾病蔓延的原因。

目前化疗是基于两种近50岁的药物:使用苄硝唑和硝呋替莫。两个显示严重的副作用,有争议的功效在慢性阶段,和耐药性发展在某些地区。因此,需要新的毒性更小更有效的药物。尽管许多天然和合成化合物已经化验活动 t . cruzi,只有少数人拥有先进的临床试验但没有成功 1, 3, 4]。在过去的几十年,无机药物化学领域已经证明其能力发展潜在金属药物治疗寄生虫病( 5- - - - - - 11]。自那时以来,已成为金属钒的医疗使用潜力增强胰岛素和抗肿瘤化合物( 12- - - - - - 14]。最近,一些努力一直致力于发展钒潜在代理人对被忽视的寄生虫病( 7, 15]。

寻找活动对 t . cruzi,我们组设计oxidovanadium (IV)的化合物包括polypyridyl配体(NN)与DNA插入能力( 16- - - - - - 23]。特别是,一个家庭的37 [V结构相关四世O (L-2H) (NN)复合物,包括水杨醛缩氨基脲衍生品coligands l原来是有前途的基于其submicromolar half-maximal抑制浓度(IC50)范围和高选择性与哺乳动物细胞。其中,导数,5-bromosalicylaldehyde将缩胺基脲乾燥(V四世O (L-2H) (NN)],在那里 l和NN 5-amino-1 5-bromosalicylaldehyde将缩胺基脲乾燥,10-phenanthroline,名叫V四世O (5 brsal) (aminophen)简单(图 1)、突出显示一个集成电路50值为0.27 μ米在 t . cruzi(Tulahuen 2株epimastigotes)和185年选择性使用J774巨噬细胞( 20.]。

V的分子式四世O (5 brsal) (aminophen)。

V的稳定的解决方案四世O (5 brsal) (aminophen)对溶剂分解和/或氧化曾研究了电子顺磁共振(EPR)和核磁共振(NMR) V-51 [ 20.]。只有部分氧化导致[VVO2(5 brsal-2h)(溶剂)],位移后aminophen heteroligand,被观察到。这个新的V (V)物种被证明是一般 t . cruzi、自由aminophen显示twenty-time更高的集成电路50价值比原来的寄生虫V四世O (5 brsal) (aminophen)物种( 19, 20.]。此外,V四世O (5 brsal) (aminophen)显示97倍的选择性高于aminophen [ 20.]。因此,完整的初始V四世O (5 brsal) (aminophen)化合物被认为是活跃的物种。

在这里,我们研究了钒化合物的作用方式为潜在的代理 t . cruzi(CL布雷纳指出应变)。我们分析了相关的细胞死亡机制和寄生虫复苏的反应。此外,钒实验的寄生虫与寄生虫大分子及其协会决定。最后,进行了蛋白质组学和转录组策略来识别假定的途径影响或可能的分子靶点。据我们所知,这是第一个 组学研究这些特点进行金属潜在代理 t . cruzi。

 2。材料和方法 2.1。第四试剂和V <一口> < /一口> O (5 brsal) (Aminophen)合成

配体合成5-bromosalicylaldehyde将缩胺基脲乾燥和特征之前报道的克分子数相等的5-bromosalicylaldehyde和氨基脲( 24]。的合成(V四世O (L-2H) (NN)]复杂,暂停在乙醇中,先前与氮气,0.375更易 l0.375、0.375更易5-amine-1 10-phenanthroline,更易与[V四世O(中航商用飞机有限公司)2乙酰丙酮),中航商用飞机有限公司表示,在加热回流下氮4 h,和红棕色固体形成的过滤,用乙醇和乙醚洗净,并以C、h、N元素分析和傅里叶变换红外(FTIR)和电子顺磁共振光谱学之前报道( 20., 22]。

 2.2。寄生虫和细胞培养

t . cruziepimastigotes (CL布雷纳指出应变)保持在28°C的脑心浸液(BHI)中补充10%胎牛血清和每三天就过去了。

 2.3。体外测定<斜体> < /斜体>反<斜体>鲁兹锥体< /斜体>活动

反 t . cruzi活动确定后之前报道的方法( 25- - - - - - 27]。简单地说,一个11.25毫米V四世O (5 brsal) (aminophen)的解决方案是在二甲亚砜(DMSO)。Epimastigotes计算使用纽鲍尔室,1×106寄生虫/毫升孵化在96 - 200年板 μL BHI包含16 μmv四世O (5 brsal) (aminophen)。最初的寄生虫密度在时间0 ( 一个0和寄生虫扩散经过五天的孵化 一个5在595 nm)测定吸光度。抑制扩散计算考虑车辆控制寄生虫潜伏在DMSO溶液的扩散,仅由以下方程:%寄生虫扩散= ( 一个5− 一个0)/ (5度−一0 c)×0100,5度和一个0 c对应的光学密度控制文化5和0天,分别。在所有情况下,DMSO从未超过0.04%的最终浓度。剂量反应曲线构建和集成电路50价值决定使用GraphPad Prism 6.00版本Windows (GraphPad软件)。结果的平均值±SD(标准差)的六个独立的生物复制。

 2.4。细胞死亡机制

细胞死亡机理分析都使用了死细胞凋亡工具包(热费希尔科学)。寄生虫是孵化24 h 1 x, 5倍和10倍IC50V的四世O (5 brsal) (aminophen),通过离心收获,用磷酸盐(PBS)和孵化15分钟与5毫克/毫升Alexa萤石®488膜联蛋白V (AV)和10毫克/毫升propidium碘(π),其次是dual-parameter分析使用一个Accuri C6 (BD生物科学)流式细胞分析仪。AV和π检测,533/30 nm信号检测器(FL1)和670 nm长通过信号探测器(FL3)使用,分别。两个独立的实验研究为每个V一式两份四世O (5 brsal) (aminophen)浓度,和10000年收购了在每一个事件。数据分析使用BD CSampler软件(BD生物科学)。参与寄生虫被用作控制。细胞凋亡和坏死积极控制寄生虫治疗2.5 h, h2O250 μ米和100 μM,分别。

 2.5。生活/死亡分析

与钙黄绿素是细胞生存能力评估(CA)和propidium碘(PI)(热费希尔科学)。参与寄生虫和寄生虫compound-treated被离心收获24 h后的孵化和resuspended 0.1毫升1 x PBS包含0.1毫米的CA和10毫克/毫升的π。样本在RT孵化60分钟,立即通过流式细胞术分析533/30 nm过滤(FL1) CA和670 nm长通滤波器(FL3)π。两个独立实验的荧光强度在10000年收购事件,和数据分析利用BD CSampler软件(BD生物科学)。

 2.6。形态学分析

扫描电子显微镜,1×106寄生虫在指数增长阶段,未经处理或治疗6 h和5 x集成电路50V的四世O (5 brsal) (aminophen),洗了PBS和4%多聚甲醛固定。样本然后用丙酮浓度的增加受到脱水(30 - 100%)和金色涂布用金属处理溅射涂布机SCD050 /徕卡。金属化后,样品在扫描电子显微镜观察(飞利浦XL30,埃因霍温)。

 2.7。复苏化验

复苏的化验 t . cruziepimastigotes进行如前所述[ 25, 28]。Epimastigotes孵化了4 h和1 x, 5倍和10倍IC50V的四世O (5 brsal) (aminophen)和转移到新鲜compound-free BHI洗。寄生虫扩散之后在595纳米热科学Varioskan®Flash多模24,48和72 h。计算相对增殖,治疗控制寄生虫。

 2.8。第四V <一口> < /一口> O (5 brsal) (Aminophen)吸收决心和高分子协会分析

钒吸收是由孵化寄生虫与V四世O (5 brsal) (aminophen)其次是电热原子吸收光谱法在热冰3500分光光度计(热费希尔科学)。Epimastigotes (1×107寄生虫/毫升)孵化24 h 1、5、10 x集成电路50钒的化合物。在指定的时间点,8×107寄生虫是通过离心收集的,洗了一次,在PBS resuspended钒量化。Noninternalized钒在上层清液也被确定。两个独立的实验进行的每个浓度三个评估。

确定协会钒与核酸(3×107寄生虫), 向导®GenomicDNAPurificationKit(Promega)和试剂盒试剂(生命技术)对DNA和RNA隔离,分别。蛋白质分析、寄生虫(4×107)resuspended 1毫升的寄生虫裂解缓冲包含10毫米Tris-Cl pH值7.5,1毫米EDTA, 1%的家伙,10%甘油、0.5%特里同, 完成™ProteaseInhibitorCocktail(罗氏);搅拌30分钟在4°C;和离心机在4°C 1 h 20000 g将可溶性与不溶性分数。相关的钒当时确定在每个分数。两个独立的实验进行分析决定和对于每一个样本,和两个钒决定在每一个执行。

 2.9。转录组和蛋白质组分析

总RNA分离出寄生虫(1×109),未经处理的,处理5 x集成电路50V四世O (5 brsal) (aminophen)在6 h,使用试剂盒(生命技术)试剂后,制造商的指令(每一个三个独立的副本)。PoliA + RNA pair-end测序在Macrogen使用Illumina公司执行TruSeq™RNA样品制备设备v2和HiSeq 2500 ( http://www.macrogen.com)。Trimmomatic [ 29日)是用于获得优质序列映射到读取 t . cruzi基因组(29日版 http://tritrypdb.org)使用领结2在非常敏感的模式 30.]。每个基因序列读取的数量决定使用htseq-count [ 31日]。差异表达基因决定使用DESeq2包( 32]。

总蛋白质从寄生虫(1×109),未经处理的,处理5 x集成电路50V四世O (5 brsal) (aminophen)在6 h,被孤立的孵化与裂解缓冲(7 M尿素,2 M硫脲,4%的家伙)30分钟在4°C,离心机在4°C 1 h 20000 g将可溶性与不溶性分数,并分析了LC串联质谱法(质/ MS)(三个独立的副本)。简单地说,20 μg的每个样本解决预制4% - -12%梯度凝胶(NuPAGE, MES系统,表达载体)。每个通道被切断和加工质谱分析根据之前报道协议( 33]。肽样本分离成nano-HPLC系统(EASY-nLC 1000,热科学)配备一个反相柱(PepMap™, RSLC,使用C18, 2 m, 100 a, 50 mm×15厘米,热科学)使用梯度从50%到100%的乙腈0.1%甲酸250 nL /分钟的流量。肽分析在LTQ Velos nano-ESI线性离子阱仪器(热科学)在数据依赖收购模式(前十)与动态45的排除列表。为蛋白质组学数据分析进行了使用PatternLab软件(版本4.0.0.84)。原始文件搜索target-decoy数据库生成的 鲁兹锥体(应变CL布雷纳指出)序列从UniProt下载( http://www.uniprot.org),应用以下参数:胰蛋白酶与完整的特异性蛋白水解酶,蛋氨酸氧化作为变量修改、半胱氨酸carbamidomethylation固定修改,800 ppm的公差测量前体 m / z。PatternLab大约面积比例的维恩图和T-Fold模块被用来定量分析数据( 34- - - - - - 36]。

 2.10。实时聚合酶链反应

定量rt - pcr(存在)使用SensiFAST SYBR Hi-ROX工具包(Bioline)进行10 ng / μL (cDNA获得每个转录组的RNA生物复制品使用随机引物和上标二世(生命技术)。特定的引物设计与OligoPerfect引物设计工具从热费希尔科学( https://www.thermofisher.com)。threonyl-tRNA合成酶基因被用作内部放大控制,由于其转录水平不存在差异的治疗和控制寄生虫根据获得的转录组数据。包含引物的反应进行了最终浓度为0.4 μ米的退火温度60°C StepOnePlus实时PCR系统。所有的反应都是在重复执行。获得的数据被处理StepOnePlus™软件v2.3和RNA的相对价值的确定是由2−ΔΔCT方法( 37]。

 3所示。结果 3.1。增长的抑制机制V第四<一口> < /一口> O (5 brsal) (Aminophen) t <斜体> cruzi < /斜体> Epimastigotes

作为第一步研究V的抗增殖作用机理四世O (5 brsal) (aminophen) t . cruziepimastigotes,我们分析了生长抑制曲线,确定了集成电路50(3.76±0.08) μ米,在CL布雷纳指出应变(图 2)。

V的效果四世O (5 brsal) (aminophen) T。 cruziepimastigotes增殖。

寄生虫是生长在28°C 5天BHI V的浓度表示四世O (5 brsal) (aminophen)。每个点代表的意思是六个独立实验相关的标准误差。

发现如果细胞死亡机制,如早期细胞凋亡或坏死细胞凋亡参与了后期,我们进行了流式细胞术分析荧光探针AV标志和π如前所述 25- - - - - - 27]。AV的缺失和/或π阳性细胞与1 x孵化后,5倍或10倍IC5024 h表明细胞凋亡和坏死过程引发的V四世O (5 brsal) (aminophen)治疗(图 3(一个))。类似的结果6和12 h的孵化。确定治疗寄生虫死亡或增长被逮捕,现场/死执行试验使用荧光钙黄绿素。如图 3 (b),细胞酯酶活性没有影响(1 x集成电路50)或略有下降(5倍和10倍IC50)。此外,体内没有激烈的形态变化(5 brsal) (aminophen)治疗寄生虫可以通过扫描电子显微镜观察到当使用5 x集成电路50(图 3 (c))。然而,倾向于缩短细胞体和一个清晰的能动性观察(图中未显示)的损失。

细胞死亡机制和形态分析V四世O (5 brsal) (aminophen)治疗T。 cruziepimastigotes。(一)流式细胞术分析寄生虫,未经处理的V(控制)和处理四世O (5 brsal) (aminophen)表示为24小时浓度(1 x集成电路505 x集成电路50,10 x集成电路50),贴上膜联蛋白V和propidium碘。点情节代表无标号寄生虫(左下广场),早期凋亡膜联蛋白V标记寄生虫(左上广场),和晚期凋亡/坏死膜联蛋白V /碘化propidium双标记寄生虫广场(右上)。(b)流式细胞术分析寄生虫,未经处理(黑线)和孵化vanadium-based化合物24 h 1 x集成电路50(灰线),5 x集成电路50(固体填充黑线),10 x集成电路50(固体填充灰色线),用钙黄绿素标记点(左面板)和propidium碘(右面板)。(c)的扫描电子显微镜图像代表控制治疗寄生虫(左图)和epimastigotes处理5 x集成电路50V的四世O (5 brsal) (aminophen) 6 h。获得的图像与飞利浦XL30扫描电子显微镜(放大10000倍)。

考虑到这些结果证明古典细胞死亡机制并不参与寄生虫的生长抑制V四世O (5 brsal) (aminophen),我们调查trypanostatic效应的存在通过复苏化验所描述的凯斯勒( 28]。潜伏期后,足以引起细胞死亡机制,类似的寄生虫经济复苏资料观察治疗和治疗寄生虫浓度测试(图 4)。这个结果证实了一个trypanostatic V的作用机制四世O (5 brsal) (aminophen)由于血吸虫的生长抑制存在的化合物,但寄生虫可以恢复增长。

T的恢复实验。 cruziepimastigotes V处理四世O (5 brsal) (aminophen)。寄生虫的生长暴露4 h为0,1 x, 5倍和10倍IC50V四世O (5 brsal) (aminophen)复合后删除之后,光学密度的措施在指定的时间点(595海里)。扩散决定相对于时间为零。每个实验进行了一式三份,每个点的平均值和标准偏差表示。

 3.2。钒在<斜体> T吸收。cruzi < /斜体> Epimastigotes对待V第四<一口> < /一口> O (5 brsal) (Aminophen)

为了提前了解trypanostatic作用的分子机制,我们估计钒的含量实验的寄生虫。如图 5(一个)、寄生虫表现出剂量依赖性钒吸收值为0.50,1.18,和3.51 nmol 1 x, 5倍和10倍IC50V的四世分别为O (5 brsal) (aminophen)。值得注意的是,这种寄生虫吸收只达到平均2.4%的钒在孵化混合物(总钒:15 nmol 1 x集成电路50)。这种低吸收阻碍钒的分析详细的亚细胞分布与寄生虫有关。

吸收和高分子协会的V四世O (5 brsal) (aminophen) T。 cruziepimastigotes。(a)的强烈约束和/或实验钒compound-treated寄生虫。寄生虫和3.76孵化 μM (1 x集成电路50),11.28 μ米(5 x集成电路50),37.6 μ米(10 x集成电路50V的)四世O (5 brsal) (aminophen),通过电热原子吸收光谱法测定钒。(b)总额的百分比钒与DNA, RNA。(c)测定钒与可溶性和不可溶性总分数。钒含量通过电热原子吸收光谱法测定6 h后的孵化5 x集成电路50。提出了两个独立实验的平均值及其相关标准偏差。

考虑到配体的容量内插入核酸( 19),寄生虫DNA和RNA的独特的协会进行了分析。尽管低钒的值与寄生虫有关核酸(8.9×105 µg V / µDNA和6.46×10 g6 µg V / µg RNA)的观察与DNA(图 5 (b))。

尽管如此,使用一个简单的分离方法,首选协会与不溶性金属分数(90%以上的实验钒)观察(图 5 (c))。这一结果表明,V四世O (5 brsal) (aminophen)可能与膜相关的蛋白质相互作用。

 3.3。早期的反应使<斜体> T。cruzi < /斜体> Epimastigotes V第四<一口> < /一口> O (5 brsal) (Aminophen)治疗

识别关键分子以及可能的途径参与行动的模式的V四世O (5 brsal) (aminophen),我们研究的主要变化诱导使寄生虫的孵化与5 x集成电路50V四世O (5 brsal) (aminophen) 6 h。我们选择一个相对短的时间内只孵化研究早期响应触发具体的化合物,从而避免的发病率一般晚或/和间接机制。

转录组分析的变化,三个独立的生物复制为每个条件排序,以及至少700万paired-end序列读取被映射到参考 t . cruzi基因组使用领结2(表 S1)。很好的相关性观察复制(皮尔森相关系数 p > 0.99 )。比较转录组分析显示最小变化对mRNA稳态水平在治疗。实际上,从10951映射成绩单,少于100成绩单(0.008%)差异表达,考虑错误发现率为0.01。正如预期的那样,他们中的大多数(47%)编纂的假想蛋白没有已知函数或功能信息或域。

此外,只有2差异表达记录(假设的蛋白质编码)显示褶皱变化大于1.5(表 S2)。执行中存在某些基因(图确认转录组数据 S1)。一个优秀的这两种方法之间的相关性(转录组和中存在)为选定的一组基因(0.97 R Pearson)。分析蛋白质组的变化,一把猎枪的策略是化验分别确定可溶性和不可溶性蛋白的变化由于钒复合孵化。

不溶性蛋白的蛋白质组学分析分数显示共有248过多和110 V的弱势不溶性蛋白质四世O (5 brsal) (aminophen)寄生虫而控制治疗寄生虫(表 S3)。细胞色素P450 (TcCLB.506945.190)似乎是最表达下调不溶性蛋白质。有趣的是这种蛋白质参与调解(表解毒过程 S3)。在前过多不溶性蛋白质,我们发现两个乙酰转移酶的构成组件的丙酮酸脱氢酶复合体(TcCLB.509717.20 TcCLB.510105.170)和Glutathione-S-transferase / glutaredoxin (TcCLB.506443.70)。一些还原酶(TcCLB.506821.210 TcCLB.510819.4),氧化还原酶(TcCLB.507049.60 TcCLB.506485.80)和水解酶(TcCLB.503399.20、TcCLB.506931.10 TcCLB.506747.30)也出现在资料库的不溶性蛋白质分数治疗寄生虫以及一些核糖体蛋白质(表 S3)。

对于可溶性蛋白质,122出现弱势与105年只出现在未经处理的控制。值得注意的是我们发现一些ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白:TcCLB.506925.530、TcCLB.510943.80 TcCLB.507099.80),后两个参与药物驱逐机制( 38)。除此之外,其他一些蛋白质的丰度与解毒过程也修改(图 6)。此外,KEGG路径分析表明,V四世O (5 brsal) (aminophen)治疗影响蛋白表达的监管过程中,由于大量的蛋白质参与剪接体,生物合成的氨基酸(g,对丝氨酸,苏氨酸,他),氨酰生物合成,核糖体,蛋白酶体似乎改变了(表 S4)。更有趣的是,蛋白酶体蛋白质不溶性蛋白(表中也过多 S3)。最后,能量代谢似乎还受V四世O (5 brsal) (aminophen)治疗,许多蛋白质的丰度与碳代谢过程,如柠檬酸循环,糖酵解,糖质新生,磷酸戊糖途径,丙酮酸代谢,氧化磷酸化,修改(表 S4)。

示意图表示蛋白质的丰度(T)的变化。 cruziepimastigotes V处理四世O (5 brsal) (aminophen)。蛋白质是基于分组KEGG通路分布。黑色和灰色圆点表示蛋白质出现过多和V代表四世O (5 brsal) (aminophen)处理与未经处理的寄生虫,分别。

 4所示。讨论

这项工作的目的是评估行动的细胞和分子机制的新vanadium-based化合物 t . cruzi。扩散分析揭示了一个集成电路50的价值(3.76±0.08) μM,类似于一个参考药物硝呋莫司(2.8±0.2)μM [ 25, 26]。因此,V四世O (5 brsal) (aminophen)可以被可视化为有前途的抗增殖剂。

t . cruzi。值得注意的是,完全抑制与化验没有实现复合浓度(图 2)。要理解这个问题,我们决定调查这个化合物的作用方式更深入。

关于寄生虫生长的抑制机理,- AV和π标签显示细胞凋亡和坏死。此外,代谢活动的轻微减少,酯酶分析推导,以及缺乏特征形态的巨大变化,如细胞膜破裂或胞体增加( 38),表明增长逮捕现象而不是另一种细胞死亡机制的参与。相反,V trypanostatic模式的作用四世O (5 brsal) (aminophen) t . cruzi证实了复苏化验。

虽然比例复合实验的寄生虫(少于2.4%的总钒用于孵化)类似于获得其他知名金属抗增殖化合物如顺铂(3%)、铂(1%)、或pyrodach-2(0.1%)在三个不同的人类细胞系( 39),显著低于获得的其他金属化合物(超过20%) t . cruziepimastigotes [ 25, 26]。尽管如此,低V四世O (5 brsal) (aminophen)吸收足以发挥杀寄生虫药的效果。虽然这vanadium-based复合系列设计包括一个插入分子,和它的 在体外DNA协会报道( 19)在当前的 在活的有机体内检测只能检测到微量钒与核酸。不管怎样,这低量足以影响DNA复制占经济复苏化验中观察到抑制细胞生长的影响。另一方面,一个引人注目的与不溶性分数(90%)被发现。值得一提的是,本部分主要包含膜相关蛋白但还包括脂质和不同的官能团在蛋白质转译后的修改。

高通量分析最近只分析机制实现kinetoplastid耐药性和药物的作用方式 40, 41]。旨在深化研究V的分子作用机制四世O (5 brsal) (aminophen) t . cruzi,我们进行了早期改变转录和蛋白质组学分析,因为这种新颖的化合物治疗寄生虫。转录组分析显示一些差异表达成绩单(小于100,低于1%)的水平较低(他们中的大多数有差别,或者对这些日志2褶皱变化< 0.5),这可能是按照低 在活的有机体内协会的钒寄生虫核酸。尽管如此,这些变化的重要性不能被低估。例如,一个很小的修改给定的调节蛋白的表达可能导致全球效应的寄生虫如果参与代谢途径的关键。低钒化合物对寄生虫转录组的影响可以解释的优先 在活的有机体内与不溶性分数而不是核酸(图 5)。另一方面,我们发现,14%的总确定蛋白质(523 3638)不同丰富的治疗后,大部分都在不溶性蛋白质分数(68%)(图 S2)。3638总蛋白质检测的数量与先前的好协议 t . cruzi蛋白质组学分析,报告了2784年的标识( 42)和4920年的蛋白质( 43]。蛋白质组学只有在恰加斯病化疗研究分析naphthoimidazoles的作用方式与30个不同的丰富的蛋白质中发现epimastigotes [ 44]和61年trypomastigotes [ 45]。相反,我们的结果反映了V的多效性的分子的影响四世O (5 brsal) (aminophen)。的许多差异表达蛋白质不溶性分数已报告参与调停解毒过程。细胞色素P450值得注意的是他们中的一员,他减少了大量的寄生虫可以解释缺乏一个有效的解毒治疗反应( 46]。其他有趣的蛋白质差异表达出现包括乙酰转移酶、还原酶、水解酶。而转移酶的参与,氧化酶类,还原酶、水解酶改性的内化化合物已被报道( 47, 48),这些结果表明V的一个重要的角色四世O (5 brsal) (aminophen)开车去早期能源和氧化还原代谢紊乱。因为许多核糖体蛋白质差异表达在治疗寄生虫(表 S3),尽管最小协会mRNA(图的化合物 5),我们可以推测,翻译过程可能会受到影响。在减少可溶性蛋白质,我们发现ABC家族的转运蛋白的作用药物驱逐机制之前提出( 49]。通过这种方式,消除这种化合物可以减少,从而允许延长其trypanostatic效果。除此之外,在我们的蛋白质组学分析,蛋白酶体蛋白质过多出现在治疗寄生虫在可溶性和不可溶性蛋白质分数。蛋白酶体的最近研究作为疟疾有前景的药物的目标,利什曼病,恰加斯病,昏睡病 50, 51]。

人们很容易推测可能的直接抑制蛋白酶体的V四世O (5 brsal) (aminophen)可能导致蛋白酶体蛋白质生产的增加阻碍复合效应。过多的蛋白酶体蛋白质也可以解释为广泛的蛋白质的存在修改要求更积极的蛋白酶体降解。

,提供的数据支持的想法V的主要作用方式四世O (5 brsal) (aminophen)通过修改许多寄生虫蛋白质的丰度。而改变了蛋白质含量由V四世O (5 brsal) (aminophen)可能是由于其直接与蛋白质协会目标促进其降解或稳定化合物可能也特别影响蛋白质参与蛋白质的生产和退化过程,从而扩大影响。

 5。结论

总之,这项工作提供了一个全面的描述的细胞和分子反应 T。 cruziepimastigotes潜在新vanadium-based杀寄生虫药化合物。有趣的是,很好的集成电路50V的值确定四世O (5 brsal) (aminophen)达到通过trypanostatic的行动模式,适度影响细胞的形状和能动性。寄生虫早反应这种化合物显示在mRNA水平没有翻天覆地的变化。然而,蛋白质组学分析显示宽影响蛋白质丰度识别特定蛋白可能参与这种大规模的反应和药物代谢。结合使用方法允许我们识别受影响的过程,使驾驶很好抑制寄生虫增长即使在非常低的吸收水平检测。在全球范围内,这里的结果提出了构成贡献了解这种潜在的作用机制药物治疗恰加斯病。此外,他们提供一个洞察metallomics,蛋白质组学,和金属antitrypanosomal化合物的转录组,鼓励这初期的研究领域。

 数据可用性

转录组和蛋白质组数据用于支持本研究的结果中包括补充信息文件;原始数据也可以通过电子邮件通讯作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项工作是由报社Nacional de Investigacion e Innovacion (ANII)(批准号ANII FMV_1_2014_1_103957和POS_FMV_2015_1_1005183)和项目Desarrollo de las Ciencias Basicas,乌拉圭。

 补充材料

图S1:验证选择基因的转录组数据中存在。随机选择的表达修改成绩单从转录组数据分析了列表中存在比较治疗和治疗寄生虫和表达式的值(日志2FC rt - pcr)策划与转录组数据(日志2FC转录组)。图S2:确定不同的丰富的蛋白质 t . cruziepimastigotes V处理四世O (5 brsal) (aminophen)。可溶性(A)和不可溶性从未经处理的(控制)和(B)蛋白质治疗寄生虫进行了分析。图显示了一个火山情节生成蛋白质组学从PatternLab T-Fold模块。蛋白质中发现至少4复制的所有条件都作为单独的点,绘制相应的表示 p 值(日志2(p值))和褶皱变化(日志2(褶皱变化))。黑点代表蛋白质不满足褶皱变化和统计标准之间的微分表达式,因此被认为是不变的条件。深灰色的代表做满足折叠的蛋白质变化但不统计标准微分表达式。浅灰色圆点代表低蛋白质丰富的令人满意的褶皱变化和q值标准微分表达式而不是考虑进一步分析由于低光谱项的数量。最后,小白点对应于蛋白质满足所有统计过滤器和代表菌株之间的差异表达蛋白质。蛋白质小白点对应的详细信息,请参阅补充表S3。表S1:行数据统计从转录组分析的控制治疗寄生虫和V四世O (5 brsal) (aminophen)治疗寄生虫。表S2:从转录组分析的差异表达基因的列表。调节和表达下调成绩单V四世O (5 brsal) (aminophen)治疗寄生虫对控制治疗寄生虫所示。表S3:从蛋白质组学分析差异表达的蛋白质。调节和表达下调可溶性和不可溶性蛋白V四世O (5 brsal) (aminophen)治疗寄生虫对控制治疗寄生虫不同的标签所示。表S4: KEGG浓缩的代谢途径分析蛋白质在V使用字符串数据库修改四世O (5 brsal) (aminophen)治疗寄生虫。

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