Glutaraldehyde-Polymerized血红蛋白:寻找改进的性能作为氧载体在出血模型

文摘

基于血红蛋白(Hb)氧载体(HBOC)几十年来一直探索治疗出血。在我们之前的充值的测试中,HBOC较低在体外prooxidant反应(加入过氧化物酶或血清白蛋白为此)显示可衡量的,但小改善氧化应激相关参数。在这里,这样的测试处在出血设置;绵羊的血红蛋白也首次测试在这种环境下,基于在体外数据显示其改进性能与牛Hb对氧化和nitrosative压力代理。事实上,绵羊的Hb执行比牛Hb存活率,动脉张力,免疫学、组织学。另一方面,与充值模型,在nonheme过氧化物酶rubrerythrin以及牛血清白蛋白与Hb共聚提高HBOC的性能,在目前出血模型显著rubrerythrin失败HBOC成分(不同的免疫反应),而血清白蛋白似乎不可行,如果其来源(即是一个不同的物种。,牛血清白蛋白票价明显比鼠血清白蛋白,HBOC输血的老鼠)。的作用的矩阵是处在溶解(PBS和gelofusine和等离子体)指出。

1。介绍

Hemoglobin-based氧载体体)几十年来被提出和测试用于治疗出血。为准备这些,聚合与戊二醛最经常采用的技术之一;事实上,牛血红蛋白聚合与戊二醛目前批准的有限的人类使用在两个国家,虽然没有其他HBOC据我们所知目前批准临床使用其他地方(1- - - - - -12]。试图改善hemoglobin-glutaraldehyde聚合物被广泛报道,包括共聚与抗氧化剂组件(白蛋白、血红素和nonheme氧化物酶,超氧化物歧化酶,和小的抗氧化剂)或与其他蛋白质意味着与血液组件(纤维蛋白原和碳酸酐酶)、封装、和调制矩阵/解决方案HBOC溶解(1,2,9,10,12- - - - - -21]。其他方法,不涉及戊二醛(或涉及它作为辅助),包括衍生化与惰性高分子重量有机聚合物(如聚乙二醇)、聚合与其他双功能试剂,替代牛血红蛋白与其他血红蛋白(人类或其他生物包括植物),甚至与其他蛋白质(蚯蚓血红蛋白)甚至无蛋白的方法(oxygen-encapsulating乳剂、氟化烃和heme-based树枝状分子)(8,20.,22- - - - - -24]。

我们之前报道的一系列生理参数的评价大鼠注射少量的血液代用品候选人基于血红蛋白(25]。这些候选人大多是纳米尺度的缩聚物/聚合物,如所示色谱和光谱测量7,13,26- - - - - -29日]。一般来说,他们都显示明显不同prooxidative反应在体外和在活的有机体内在充值鼠模型各自处在被注入在相对少量的出血。我们的假设是,少prooxidant Hb衍生品/聚合物将显示病理生理的负面效应。所有候选人似乎彼此的行为基本相似的生化和免疫学参数,虽然少redox-reactive的被发现导致过度积累低铁的器官和大量的过剩顺物种的血液。具体来说,表现最好的两个人是共聚物与Hb重组nonheme铁过氧化物酶rubrerythrin (Rbr,来自脱磷孤菌属寻常的(27])和共聚物的Hb与牛血清白蛋白(BSA)。重要的是,没有注意到病理变化的生化和生理参数,包括免疫的,为这两个处在监控,尽管他们使用的蛋白质从广泛不同的生物25]。这里,数据等的影响血液代用品候选人在出血性Wistar鼠报告强调动脉张力(不是这组处在之前报道),存活率(意外小100%相比以前充值模型),以及与这些强烈的免疫反应。绵羊的血红蛋白添加和Hb源提供了选择,鉴于其承诺最近的表现在体外测试(30.];据我们所知,这是第一个在活的有机体内报告的ovine-based HBOC。同时,两种矩阵为溶解HBOC(等离子体和gelofusine)在替代以前使用PBS。

2。材料和方法

2.1。试剂和仪器

标准试剂是相同的来源和股票如前所述的充值HBOC实验(25]。血红蛋白衍生物(绵羊的和牛glutaraldehyde-polymerized血红蛋白(27,31日],hemoglobin-BSA共聚物[7,14],hemoglobin-rubrerythrin共聚物(27)准备如前所述。大鼠血红蛋白从西格玛奥德里奇。Hb-BSA共聚物,一小部分分开使用FPLC(过程(14])的分子量高于单体是单独准备。Gelofusine(布劳恩Melsungen AG)使用未经稀释的矩阵和等渗的条件是处在维护。人类得到标准化的等离子体的输血即Chiricuta肿瘤研究所,也用作处在一个矩阵。磷酸缓冲盐是我们测试的第三个矩阵和处在准备根据规范协议为了获得最后的pH = 7.4。

2.2。实验动物

健康成年雄性Wistar鼠体重160±20 g,年龄24周,F1代,提供免费获取标准的鼠粮和水。老鼠被安置8 /笼和维护在一个光/温度控制房间光/暗周期12/12 h 22°C下恒定的温度。实验和动物福利进行了以下指令2010/63 /问题的指导方针。

2.3。研究设计

实验进行雄性Wistar鼠随机分成组,每组6 - 10的动物。组定义如下:C(控制,不受出血),H(控制出血:受到出血但不输血),请(受到出血等离子体处理),Hb (b) /请(出血、输血glutaraldehyde-polymerized牛血红蛋白在等离子体),Hb (b) / PBS(出血、输血glutaraldehyde-polymerized牛血红蛋白在PBS), Hb (ov) /请(出血、输血glutaraldehyde-polymerized牛血红蛋白在等离子体),HbRbr +请(出血、输血glutaraldehyde-polymerized牛血红蛋白在等离子体),HbBSA(出血、输血与高分子共聚物的重量分数牛血红蛋白、牛白蛋白在等离子体),Hb (ov) / PBS(出血、输血glutaraldehyde-polymerized绵羊的血红蛋白在PBS), HbRSA(出血、输血与共聚物的牛血红蛋白和鼠白蛋白),HbRbr / PBS(出血、输血与共聚物的牛血红蛋白和rubrerythrin), Gf(出血、输血gelofusine),和pHb (b) / Gf(出血、输血glutaraldehyde-polymerized gelofusine血红蛋白)。

通过静脉途径管理处在比例卷带血的积液在出血一个jeun深麻醉下如前所述。出血性地位是在麻醉诱导,通过血液渗出retroorbital丛,直到血容量的30% TBV(总血容量)的老鼠。retroorbital穿刺方法意味着使用肝素化retroorbital丛毛细玻璃管,轻轻地旋转管是先进的。静脉血液被收集在一个3.5毫升血液取样管。动物的血液动脉张力(毫米汞柱)监测每10分钟前两小时后管理HBOC每两个小时,然后在接下来的8个小时,然后又在24小时。血动脉张力监测是由Coda无创血压测量系统对啮齿动物(肯特科技公司,托灵顿校区,CT 06790年,安和苏阿)。最后,动物受到深度异氟烷麻醉和血液收集如前所述[25]。酸碱状态(pH值,阿宝₂,pCO₂,cHCO₃(ecf), (b)),离子如Na⁺K⁺,Ca^{2 +}glycaemia (Glu)、总蛋白(TP)内容,转铁蛋白(我国),乳酸(Lac),氧化应激(过氧化氢酶、硫代巴比土酸活性物质的浓度(TBARS)),肾功能(肌酐、尿素、尿酸、铁、磷酸)是根据我们之前的工作。免疫参数(IgA免疫球蛋白,IgM、C3和CRP)与一个immunoturbidimetric方法评估使用anti-IgA anti-IgG, anti-IgM特定抗血清(32]。全血计数也表现如前所述hemoglobin-based HBOC [25]。铁组织化学分析,肝脏,脾脏和肾脏被动物解剖,收集固定在中立的福尔马林溶液(10%)和帕尔分析染色法和常规评价(圆)25]。

2.4。统计分析

数据报告为均值±SEM,除非另有指示。高斯分布是检查Shapiro-Wilk正常测试。单向方差分析方差分析,其次是Bonferroni多重比较的测试程序,执行。统计学意义是 (95%置信区间)。统计值获得使用GraphPad Prism 5.0版本Windows (GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)。

3所示。结果与讨论

动脉张力(在)监测实验之前,之后立即撤军的血液(代表∼∼2.5毫升,有关动物的体重总血容量的30%,除对照组,C,而只有0.5毫升检索用于生化指标),然后90分钟,然后又在24小时。表1显示了这些实验的存活率,而图1显示在上述时间点值的演变。

在所有组除了控制和Hb (b) / PBS,以减少出血后平均60 - 70毫米汞柱。在对照组中,一个可能会注意到,尽管出血没有执行,而不是一个低数量的血液生化分析检索,动物确实显示下降(∼25 mmHg)约在同一时间点的其他组织并接受治疗。这表明下降的一部分,在所有实验群体不仅是由于大量失血,而且由于固有应力诱导的实验。

在变化引起的治疗范围从−26毫米汞柱(只有Hb (b) / PBS显示这样的进一步减少,但这与一个更小的减少引起的出血)+ 31毫米汞柱组显示100%的存活率和从37 +到+ 80组生存率较低。人们普遍知道高血压是不受欢迎的副作用HBOC [33];事实上,我们发现在这里也增加∼40 - 80毫米汞柱后立即输血与贫穷的存活率。相比之下,最后的区别(24小时)和初始不再提供相关性与生存或主要差异组。

标准化的等离子体单独恢复75%的存活率(没有出血,治疗)100%;同样的不是真的gelofusine当单独管理,没有HBOC。这些利率是伴随着轻微的下降在治疗后,略有增加在最后的时间点是自己看到了,请与相反的Gf(后者符合以前的观测(34])。可以得出这样的结论:这些设置下,gelofusine本身并不是一种有效的治疗出血,尽管其医疗适应症正是血浆置换在严重失血的情况下。

血清白蛋白曾提议在处在可能有用的成分,由于其保护性氧化还原效果在体外,后来证明某种程度上产生影响在活的有机体内在充值模型(25]。在以前的实验中,血清白蛋白当共聚与血红蛋白降低血红蛋白的prooxidant反应在体外(表现在自然氧化率以及大量的自由基和high-valent铁与氧化应激模型中生成反应物种,过氧化氢)以及在活的有机体内(表现在减少大量的血红蛋白和自由基在充值的老鼠实验)(25]。因此,血红蛋白共聚与牛血清白蛋白的样本相同的工作在以前充值成功实验(与100%的存活率和减少氧化应激标志物在那些先前的实验(25])是用于本研究。此示例,HbBSA,导致出血实验非常贫穷的存活率(25%)。考虑,血清白蛋白闻名免疫原性反应,第二个共聚物制备,鼠血清白蛋白(RSA)采用相反的牛。对于此示例,HbRSA,存活率是恢复到75%。这些结果表明,如果血清白蛋白在此类实验中使用,其来源必须匹配的物种是在执行输血。

细菌nonheme过氧化物酶,rubrerythrin,以前也防止prooxidant反应hemoglobin-rubrerythrin共聚物相比,一个简单的Hb聚合物用戊二醛。尽管前面的积极在体外和在活的有机体内充值结果(25,27),HbRbr共聚物导致目前的实验非常贫穷的存活率(50%在PBS, 0%;在请,没有显示);这些利率与显著增加值后立即治疗和免疫和组织学分析下面讨论。因此Rbr必须排除HBOC作为一个可行的因素。这个巨大的失败的原因可能是免疫反应(Rbr以来意想不到的低浓度成分,但证实了数据所示)或过度/不受控制的过氧化物酶活性,导致血液中的氧化还原平衡(在这种情况下,低浓度的Rbr需要)。

图1还显示在前90分钟的进化与HBOC治疗后,出血。温和的处理后的对照组,通过提取血液生化分析,但没有发生大规模的出血,显示了一个下降的第一个10分钟左右,然后保持稳定,没有恢复到原始值在前90分钟。车辆控制,请和gelofusine表现不同:同时请减轻了情况(并显示略有增加的实验),gelofusine导致更大的变化,也许解释缺乏对照组改善生存率。

Hb (b) /请组表现相对类似请,有一个明显的不同之处,在某些低至50个人的值被记录在* 10 ~ 30分钟,与值低至60维护一些人即使在90分钟;出现如此低的值明显后请组和有限的少个人。进一步区别请和Hb (b) /请样品可能在初始治疗后。平均值是相似的,Hb (b) /请组包括个人价值高达180和140毫米汞柱在这个时间点。在一起,这些差异可能指向一个早期的风险增加高血压和后来glutaraldehyde-polymerized牛乙肝引起的低血压。Hb (b) / PBS组显示了更好的值(以及更好的生存结果,cf。表1比Hb) (b) /请;然而,即使在患者值低至30 - 50毫米汞柱和高达140 - 190毫米汞柱。Hb (b) / Gf组,显示存活率比Hb (b) /请和等于Hb (b) / PBS,仍是极端值低于50 ~ 190毫米汞柱(与类似的趋势,值得注意的是,在广发集团),表明这三个测试矩阵,PBS是安全的使用时结合glutaraldehyde-polymerized牛血红蛋白。

相比之下,牛血红蛋白,绵羊的血红蛋白导致温和平均变化在前90分钟,要么请或PBS矩阵。在上面讨论的两个牛样的情况下,PBS似乎承受那么极端值:30 - 50毫米汞柱以及160 - 200毫米汞柱个体值的Hb (ov) /请集团,而对于Hb (ov) / PBS组极端值是60和130毫米汞柱(一个额外的值在一个个人高达160t= 90分钟)。这意味着PBS比等离子体对这些安全矩阵与HBOC输血实验,绵羊的Hb比牛更安全的氧载体,一个结论,反映了一个来自牛Hb数据在前款规定的讨论。

HbBSA组,平均在幸存的个人往往高于其他团体和有强烈的变化,尤其是在前30分钟;值得注意的是,也有偶尔的极端值低至30毫米汞柱和高达200毫米汞柱这一组的成员。相比之下,HbRSA组显示明显更稳定的价值观随着时间的推移;这一组也没有个人价值低于80毫米汞柱,只有一个人显示值高于140毫米汞柱(170毫米汞柱)。这些数据加强结论血清白蛋白匹配接收生物可能是一个合理的选择在一个HBOC。不过,至少在目前的实验设置,HbRSA没有提供改善生存率的控制(治疗)组。

HbRbr / PBS组显示下降幅度最大的一个超过了90分钟。这是由于一些个人显示值低至30 - 50毫米汞柱在90分钟尽管最初合理值。在一个个体,最终的价值仍然是24小时50毫米汞柱,而其他三人死在24小时的时间点。这指出切断低血压症状引起HbRbr / PBS。

免疫参数(三个免疫球蛋白,与c反应蛋白和C3补体蛋白)在图所示2。出血单独诱发免疫球蛋白显著增加C3C,除了轻微下降,IgA没有IgM和CRP的变化。治疗和控制车辆,请或女朋友,减轻这些变化;请还显示免疫球蛋白低于H组,而女朋友显示了明显更高层次的免疫球蛋白。后者并不奇怪,考虑到大量的外国蛋白质(succinylated明胶)的女朋友。请还显示CRP水平略高于H组。

HbRbr突出明显增加搞笑和C3水平,因此免疫不相容的输血(不过,在充值模型中,HBOC更小的体积,没有这样的反应是说)(25]。两个组白蛋白另一方面表现主要是彼此相似,仅用免疫球蛋白g值增加水平类似于女朋友的样本,因此不太可能担心由于女朋友是标准治疗在人类医学和CRP和C3C轻微变化范围内已经在H组。

Glutaraldehyde-polymerized牛Hb目前批准的有限的人类使用并可能因此被视为一个合理的参考点相对可以接受HBOC材料(25]。Hb (b) /请集团IgA,免疫球蛋白,IgM非常接近对照组,在这方面,他们后面提供一种改善出血(H)以及请集团;CRP显示一个值H和控制之间的中间,而C3C要高得多。的另两个样本聚合牛Hb (pHb (b) / PBS, pHb (b) / Gf)显示在pHb (b) /请在免疫球蛋白(pHb (b) / Gf)或C3C(两个)或CRP()和免疫球蛋白(pHb / PBS (b))。然而,这些变化都高于正常的生理限制和大部分的这些差异没有统计学意义。此外,聚合绵羊的血红蛋白没有显著的增加对牛同行:IgA C3C略有增加,而免疫球蛋白、免疫球蛋白,和c反应蛋白略有减少对对照组和改进的H组的免疫球蛋白和C3C;例外是C3C Hb (ov) / PBS(但不是Hb (ov) / Pls),这显然增加了。

图2还显示相关凝血参数。纤维蛋白原,急性期蛋白,是控制在H组相比翻了一番,按预期后创伤出血等。四个样本显示值H和对照组之间的中间,这是一个合理的期望HBOC候选人:请,Hb (ov) /请,Hb (b) / PBS和HbRSA。其余的样品中,纤维蛋白原水平甚至低于控制,稍微对Hb (b) /请,但明显的休息。后者样品(Gf, Hb (b) / Gf, Hb (ov) / PBS, HbBSA, HbRSA,和HbRbr),明确增加在aPTT(激活局部血栓形成质时间,相关的凝血和炎症和免疫反应(35]),纤维蛋白原减少。后者观察表明凝血失调可能会持续下去,甚至与一些HBOC候选人在治疗后24小时;不过的注意的是,没有一个HBOC执行比商用Gf(单独管理,没有HBOC)在这方面。最后但并非最不重要,图2也表明,相比之下与纤维蛋白原和aPTT、PT(凝血酶原时间)值显示明显减少变异性的样本。

表2显示组织收集的数据从肝、肺、肾组织。出血是引起轻微的枯氏细胞的增殖在肺肝和轻微的炎症。大多数HBOC候选人显示诊断比出血组。异常Hb (ov) /请只有轻微的炎症在肺和Hb (ov) / PBS的同样伴随着炎症(更小的)枯氏细胞增殖(肝脏)和肾tubuli病变。Hb (b) / PBS和Hb (b) /请组显示中度营养不良,在某种程度上也在Hb (b) /女朋友;轻微到中度肾小管损伤,轻微的肝坏死,和其他一些违规行为也明显的在这三个样本(Hb (b) / Gf可以说远比其他两个)。在这些HBOC绵羊的血红蛋白的良好的性能测试与之前是一致的在体外观察显示良好的弹性与氧化和nitrosative压力代理(30.]。

BSA和RSA样本,问题出现在某种程度上位于肝脏和肾脏。HbRbr组显示突出的组织病理学变化,符合低存活率和问题。HbRbr /请(0%的存活率,图中未显示)、强肝细胞营养不良,肝瘀,肺部水肿。HbRbr / PBS更温和的组织病理变化(颗粒变性的肝细胞、肝坏死,肾小管病变与水肿的变性)相比HbRbr /请在所有三种类型的组织。

如支持信息表所示S3血细胞比容和血红蛋白水平不受影响,任何有统计学意义的方式在任何的样品,除了增加Hb (b) /请和减少Hb (o) / PBS。这些变化很难理顺因为相同的蛋白质相比没有显著变化控制或出血组当矩阵切换(Hb (b) / PBS和Hb (o) /请)。事实上,Hb (b)在其他矩阵比等离子增加红细胞比容(不知道36这样做),也不是在当下组实验当溶解在PBS和也请单独导致Hct增加。总的来说,在一起和生存数据上面所讨论的,PBS显示为一个更好的矩阵牛Hb-based处在。Hb (o) / PBS, Hct和血红蛋白水平较低也不是减少尿素相比其他HBOC(表S5),没有其他生化参数改变,没有记者发现在肾脏的组织学分析。

如表所示S4(支持信息),血液pH值影响显著的方式只有在HbBSA样本(伴随变化,显示明显的酸碱失衡)。低失衡中看到一些其他的样品,这表明它们与BSA少本身比与Hb或生理失衡在有机体(参见下文)。此外,肾功能参数、肌酐和尿素,HbRbr样本显示显著增加(cf,支持信息表S5并符合组织学检查证明肾损害在桌子上2)。氧化应激标记(表S6)不发生显著的变化在大多数的样品;异常小减少谷胱甘肽过氧化物酶的女朋友和HbRSA样本;目前还不清楚如果这些减少是由于减少氧化应激或损耗GPX(谷胱甘肽过氧化物酶)由于氧化应激增加。

表3显示总蛋白、转铁蛋白、葡萄糖和乳酸的水平。值得注意的变化是在转铁蛋白,增加在大多数的样品(可能是反应系统中多余的铁带HBOC)和减少HbRbr(可能由于损耗再次被过量的铁转铁蛋白)。也有明显降低葡萄糖水平HbBSA女朋友,这可能与酸碱失衡的酸中毒。乳酸水平,同时减少在H组,所有HBOC组略有增加,价值最高的女朋友。轻微酸中毒和减少存活率与其他解决方案相比(白蛋白)已报告之前和女朋友在医学试验37,38]。

如支持信息(表所示S7),铁含量较低的几乎所有组织(Gf,除了请HbRbr / PBS和pHb (b) / Gf)相比H组;后者依次显示预期水平低于对照组。这些小铁水平可能表明,在24小时内接种HBOC可能已经大多从血液中消除。还值得注意的是,表S8显示减少铁沉积在肝脏(也许意料当中)在H组,没有进一步的改变在大多数组织,除了明显的增加Hb (b) / PBS和Hb / Rbr,以及进一步降低集团的女朋友。其他离子(cf。表S7)不显示出显著的变化,除了在HbBSA钾,可能与酸中毒上面所讨论的问题。

4所示。结论

在一组glutaraldehyde-polymerized hemoglobin-based氧载体(HBOC)用于治疗出血性休克,牛Hb-based HBOC恢复了生存率100%(虽然效果也依赖于矩阵的HBOC溶解了PBS比标准化的等离子体或比gelofusine更好),与前面的数据(尽管gelofusine和等离子体观测与HBOC据我们所知的小说)。类似的HBOC生产绵羊的Hb(测试第一次,据我们所知,在出血性休克设置)执行比绵羊的,不仅在生存率方面,而且在组织病理学和免疫分析。这表明,绵羊的血红蛋白是最好的原材料HBOC发展(而不是牛Hb以前或目前人类Hb的供应是有限的,除非重组协议显示在大尺度上操作)。共聚的血红蛋白和血清白蛋白,以前倡导作为一个策略来防止氧化应激(白蛋白将吸收氧化等价物),现在发现只产生合理的结果当使用白蛋白来自同一物种。当用作co-component HBOC rubrerythrin(过氧化物酶,也曾倡导策略对氧化应激在HBOC副反应)导致激烈的存活率下降和总损失几个生理参数,严重的免疫反应,因此必须从列表中丢弃的有用的HBOC成分。

数据可用性

原始数据的研究可从作者。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

Anca d Farcas和弗拉德阿尔托马同样这项工作。增值税,ADF, BS,红外控制动物和执行测量。FS HBOC合成。取代,增值税、ADF和BS设计实验。所有作者回顾了手稿。

确认

这项工作得到了罗马尼亚教育部和研究(格兰特pn09 - 440213)增值税,ADF,红外,同样,FS,由“Babes-Bolyai”大学通过人力资源开发部门运营规划2007 - 2013年,欧洲社会基金共同投资的,在该项目POSDRU / 159/1.5 / S / 132400的标题“年轻成功researchers-professional发展在国际和跨学科的环境。“谢谢教授将曼Banciu (BBU),伊娃博士Fischer-Fodor (i Chiricuta肿瘤学研究所),Orsolya Sarpataki(数字式电压表)Ioana Bedecean(数字式电压表)和Răzvan Codea(数字式电压表)有益的讨论。

补充材料

表S1:血动脉张力(毫米汞柱)在治疗后的第一个0 - 90分钟HBOC,后出血。表S2:血动脉张力(毫米汞柱),并在24小时存活率。表S3:实验组和对照组的红细胞比容和血红蛋白值。值表示为±SEM。表S4:酸碱平衡控制,实验动物。值表示为±SEM。表S5:肾功能参数控制,实验动物。值表示为±SEM。表S6。氧化和nitrosative应力状态的控制和实验动物,用谷胱甘肽过氧化物酶和3-nitrotyrosine才能体现。 Values are expressed as mean ± SEM. Table S7: blood ion concentration of control and experimental animals. Values are expressed as mean ± SEM. Table S8. Iron deposits evaluation by Perls staining in liver. The evaluation of the histochemical reaction was done by Grover et al. (2015) method as follows: +/−, slight to absent reaction; +, slight reaction; ++, moderate reaction; +++, intense reaction.(补充材料)

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