在稳定性和嗜热P450 CYP119的功能N末端和C末端多组氨酸标签的影响

抽象

生物催化剂抢手的药品和农业化学品的合成，由于其较高的区域选择性和对映选择性。中的生物催化剂，含血红素细胞色素P450（P450）是加氧一个有吸引力的靶标，因为它们催化的“未活化”以高效率碳 - 氢键氧化。CYP119是从acidothermophilic P450嗜酸热硫化由于其在高温和低pH下具有良好的催化活性，因此具有广泛的应用前景。然而，他的标签可以引起蛋白质结构和功能的改变。在这里，我们展示了他的标签对CYP119的影响。为此，在CYP119的N-末端或C-末端克隆His标记，并表达和分离His标记蛋白。对His标记的CYP119的热稳定性和过氧化物酶活性进行了测定，并与野生型CYP119进行了比较。结果表明，His标记的加入提高了CYP119的产率，简化了CYP119的分离，同时也影响了活性位点的电子结构和蛋白质的活性。我们表明，N-末端His标记的CYP119具有理想的性质和潜在的工业应用价值，但由于His标记影响活性位点血红素铁的电子性质，因此使用该蛋白的机理研究需要仔细解释。

一。介绍

酶催化反应具有较高的区域选择性和对映选择性。生物催化剂的这些关键特性，即酶，导致它们在药物和农药合成中的利用率增加。在生物催化剂中，含血红素的细胞色素P450（P450）加氧酶具有高效、高选择性催化碳氢化合物氧化的能力，是一个特别有吸引力的目标[1个–三]。事实上，色素P450目前使用在制药工业中的药物，如孕酮子宫和子宫颈癌和可的松的治疗过敏和炎症[所使用的处理中使用的合成4个]. 在自然界中，P450s参与疏水性底物的羟基化反应[5个]参与外源物质的代谢和关键信号分子的生物合成[6个]。

中的P450，嗜热那些最有潜力的应用，因为嗜热酶对突变，高温，高和低pH和有机溶剂更稳定。因此，从acidothermophilic古细菌酶CYP119嗜酸热硫化是个很吸引人的目标[7个–9个]。酸杆菌S.最适生长温度为83℃，pH值为2.4[10]。CYP119是最广泛研究的热稳定色素P450中的一个，和其分子结构通过X-射线晶体学测定[2个]。目前，用于CYP119的天然底物是未知的;然而，CYP119可以催化苯乙烯环氧化和氧化N个-乙酰-3,7-二羟基苯恶嗪_2个O型_2个. CYP119在工业实际应用中的局限性之一是，表达和分离天然CYP119是一项繁琐而费时的工作[11]. 这些问题可以通过结合多组氨酸标签（His标签）来解决，以便于分离蛋白质。

His标记通常包含连续的6个或更多组氨酸残基，现在常用于蛋白质纯化。利用固定化金属亲和层析（IMAC）技术可以很容易地从细胞裂解液中分离出His标记蛋白。在IMAC中，二价阳离子（通常是Ni²⁺或Co²⁺）附着于固体基质;在中性pH附近，该组氨酸残基形成具有螯合金属离子的络合物。所关注的蛋白质然后可以通过组氨酸的位移通过加入咪唑至移动相或改变溶液的pH洗脱。S公司ince His-tags are relatively small in size (∼2.5 kDa), they are thought to not affect the structure and function of proteins [12]. 然而，最近的报告表明，这种假设可能是错误的[13–15]。虽然他的标签的蛋白质纯化用的应用已经非常有用的在提高纯度和重组蛋白的产率，而无视于天然蛋白质的结构和功能的His-标签的后果会导致nonreproducibility和混乱在文献[16]。

这里，在结构功能和酶CYP119的稳定性的N末端和C末端His标签的影响。CYP119表达，并用N-末端和C-末端His标签（N-HIS-CYP119和C-HIS-CYP119）纯化。所获得的蛋白质的热稳定性进行了表征。此外，与这些酶的过氧化物酶的活性已经在不同温度下进行。的N-的His-CYP119显示在测试条件下最高的活性和稳定性，所以这种蛋白在Amplex Red试氧化用H动力学参数_2个O型_2个进行了研究。

2。材料和方法

2.1。His标签CYP119基因的克隆

在pET11a质粒中的CYP119基因是从照之长统（Addgene公司，＃66131）[礼物17]；它被克隆到含有六组氨酸标签的质粒上。他的标签是用N-末端克隆的无损检测和BamHI位限制酶的pET-14b上。C-末端His标签用克隆的XbaI和BamHI位pET-20b+的限制性内切酶。C-末端His标签的添加需要突变以删除His标签和CYP119序列之间的终止密码子。这是通过使用Q5定点突变试剂盒（BioLabs）的聚合酶链反应（PCR）完成的。设计的PCR引物为tccgtcgaccttgcg和ttcatactcttcaaccttgcac。

2.2。His标签CYP119s的表达

含His-标记的CYP119s将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）表达的细胞。重组大肠杆菌BL21（DE3）用0.1 mg/mL氨苄青霉素在10 mL溶原肉汤（LB，10 g/L胰蛋白酶，5 g/L酵母提取物和10 g/L氯化钠）中培养。将培养物在37°C的220 rpm振荡培养箱中培养过夜。将过夜培养物（4 mL）接种到500 mL 2xYT培养基肉汤（16 g/L胰蛋白酶、10 g/L酵母抽提物和5 g/L NaCl，pH值6.8）中，加入0.1 mg/mL氨苄西林，在37°C下摇动培养，直到OD下的光密度达到0.8_600。Expression of C-His-CYP119 was induced with 1 mM Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) and 0.5 mMδ-aminolevulinic acid (ALA) for 16 hrs at 30°C. The N-His-CYP119 expression was induced with 0.5 mM IPTG and 0.3 mM ALA for 8 hrs at 30°C. The cells were harvested by centrifugation at 3800 rpm for 20 minutes. The cell pellet was kept at −80°C until purification.

2.3条。His标记CYP119s的分离纯化

该frozen cell pellets obtained were dissolved in lysis buffer (150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM benzamidine HCl, 50 mM potassium phosphate at pH 7.5). Cells were ultrasonicated, and cell lysates were incubated at 65°C for 1 h, followed by centrifugation 3900 rpm for 2 hours at 4°C. For WT CYP119, the supernatant was used as is or enriched by ammonium sulfate (60%) precipitation. WT CYP119/ammonium sulfate pellet was resuspended in potassium phosphate buffer (50 mM) at pH 7.5 and dialyzed against the same buffer. For His-tagged CYP119, after heat treatment, the supernatant was passed through a Ni-NTA column (Affinity, Agarose Resin, Thermo Scientific™) and washed with potassium phosphate buffer (50 mM) containing NaCl (150 mM), imidazole (10 mM), PMSF (0.2 mM), and benzamidine HCl (1 mM) at pH 7.5. CYP119 was eluted from the column with imidazole (150 mM), and NaCl (20 mM) in potassium phosphate buffer (50 mM) at pH 7.5. The fractions containing His-tagged CYP119 (47 kDa) were pooled and buffer-exchanged to potassium phosphate (50 mM) at pH 7.5 with a desalting column (Thermo Scientific) with a molecular cutoff of 10 kDa. 50 μ每一纯化步骤取l份样品进行SDS-PAGE分析。用凝胶分析仪测定蛋白质纯度(http://www.gelanalyzer.com）计划。CYP119蛋白浓度与已知的消光系数来确定（ε4个15 nm = 104 mM^-1个 cm^-1个）1个]。

2.4条。CYP119s的紫外可见光谱

该UV-Visible spectra of WT and His-tagged CYP119 proteins were obtained in 50 mM potassium phosphate buffer at pH 7.5. UV-Visible spectrophotometric analysis was carried out using a UV-1600PC Scanning Spectrophotometer for the WT and His-tagged CYP119. The spectra were deconvoluted with fityk 1.3.1 software by fitting to Gaussian functions with Levenberg–Marquardt method after baseline subtraction [18]。

2.5条。CYP119s的热稳定性测定

为了测试热稳定性，将酶在温度升高（25、60、70、75、80、85、90和95°C）下，在pH值为7.4的50 mM磷酸钾缓冲液中培养5 分钟。在350-650 nm波长之间的每个温度下，进行紫外-可见光谱测定。差谱是通过将室温下的谱与高温下的谱相减得到的。Soret最大吸光度的变化由△Abs（390–425）监测，其中△Abs是由在更高温度下指定波长的吸光度与在室温下的吸光度之差定义的。通过减去ΔAbs得到ΔΔAbs（390–425）_390nm的来自ΔAbs_425nm.

2.6。CYP119s过氧化物酶活性的

WT CYP119，N-HIS-CYP119，和C-HIS-CYP119的过氧化物酶活性通过的Amplex红（赛默飞世尔科技）的氧化反应来确定。反应含有10 μM Amplex红色，1.5 M M高_2个O型_2个，和1.5 μpH7.4时，0.25 M磷酸钠中的M CYP119变异体。反应在室温和65℃下进行。产物（resorufin）的形成之后，监测荧光（570 nm激发，585 nm发射）或570 nm吸收(ε_570nm的 = 54 mM^-1个·厘米^-1个）6个]. 阴性对照组在无H_2个O型_2个.该average of the emission values of the resorufin at 582 nm from three independent measurements was used. Observed rate constant (千_{奥林匹克广播公司}）通过动力学数据拟合到一个相关联式求出。

2.7条。N-His-CYP119氧化Amplex红的动力学分析

用紫外可见光谱法对Amplex-Red反应进行了动力学分析。反应用10 进行μM Amplex红色，1.5 M M高_2个O型_2个和1.5 μ米N个-His-CYP119 in 50 mM reaction buffer at pH 7.4. UV-Visible spectra were taken at 0, 2, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, and 270 minutes after addition of H_2个O型_2个. 为了确定N-His-CYP119氧化Amplex红的动力学参数，在570 nm处观察了Amplex红（10 nm）反应过程中间苯二酚的形成μM）用H_2个O型_2个(0个。2个5个–2个 mM) in the presence of N-His-CYP119 (1.5 μM）。初始速率数据拟合至米氏方程以获得动力学常数。

3.结果

3.1。克隆His标签CYP119的表达和纯化

蛋白质的N-的His-CYP119和C-HIS-CYP119的序列显示在图1个，其他残留物以粗体显示。两种蛋白都被克隆和表达大肠杆菌如材料和方法部分所述。纯化包括在65℃下对细胞裂解物进行1小时的初始热处理。如图所示S1，所有的蛋白质仍热处理后极易溶解。其次IMAC，这导致大约95％的纯度为两种蛋白质。From 0.5 L of culture 4.8 mg of N-His-CYP119 and 1.4 mg of C-His-CYP119 were obtained. The heme incorporation of isolated proteins were observed by the absorbance ratio of 280 nm vs Soret (415 nm) absorbance, this ratio was 0.46 and 0.58 for N-His-CYP119 and C-His-CYP119, respectively, showing appropriate levels of heme incorporation for both proteins.

3.2。WT CYP119的电子吸收光谱，N-HIS-CYP119，和C-HIS-CYP119

的N-的His-CYP119的光学光谱，C-HIS-CYP119，作为分离的，富集的和WT CYP119示于图2个.为了得到的最大吸光度，索瑞更准确的比较α/β对谱带进行反褶积，并从反褶积后的光谱中获得最大吸光度。反褶积峰的拟合如图所示S2和S3). 反褶积后，WT CYP119在414 nm处显示出最大的Soret吸光度并分裂α/βbands in 533 and 567 nm, similar to previously reported spectra (FigureS2）三]。Addition of the His-tag to N-terminal and C-terminal of the protein resulted in a small shift in the Soret maximum to 418 nm (FigureS3).该α/βbands shifted to 535 and 570 nm for C-His-CYP119 and to 540 and 572 nm for N-His-CYP119 (Figure2个，图S3).

3.3。WT CYP119，N-HIS-CYP119，和C-HIS-CYP119的热稳定性测量

在N-的His-CYP119，C-的His-CYP119和WT CYP119随着温度的紫外可见光谱的变化显示在图三.WT CYP119的最大吸光度的Soret不随温度改变多达测试的最高温度（95℃）（图图3（a）). 然而，由于杂质引起的聚集，在较高温度下，在较低波长处的吸光度增加。另一方面，随着温度的升高，N-His-CYP119和C-His-CYP119的最大Soret吸光度从418 nm变为415 nm（图3（b）和3（c）).此外，N-HIS-CYP119和C-HIS-CYP119的索瑞吸光度分别下降了40％和12％，在温度（图增加3（b）和3（c）).差光谱可用于密切监测索瑞吸光度随温度的变化（图S4). 差异光谱显示，对于His标记的CYP119s，在425 nm处观察到最大吸光度下降，而在390 nm处观察到吸光度的细微增加，而在425 nm处则伴随着吸光度下降（图S4B).T型his shift in absorbance can best be monitored by the change in the difference in absorbance at 390 nm and 425 nm [∆∆Abs (390–425)]. As seen in Figure3（d），吸光度的移ΔΔAbs（390-425）]的最高用于N的His-CYP119，而没有显著偏移为WT CYP119观察。

3.4。WT CYP119，N-HIS-CYP119，和C-HIS-CYP119的过氧化物酶活性

CYP119变异体的过氧化物酶活性通过由H以下的Amplex红氧化研究_2个O型_2个[9个]。该product resorufin can be observed by fluorescence with excitation at 570 nm and emission at 585 nm. The excitation and emission spectra of the reaction mixture containing 1.5 mM H_2个O型_2个和10 μ中号的Amplex红1.5 μ中号WT CYP119显示在图4个，光谱清楚地表明试卤灵的形成。

在荧光由于试卤灵的形成的增加可被用于通过在分离的酶遵循的Amplex红氧化的动力学。反应后在室温下和在65℃至明白温度升高的影响如何酶活性。如图所见5个，WT CYP119和N-HIS-CYP119表明在室温下类似的产品的形成，而C-HIS-CYP119表明只有20％WT CYP119活性。将温度提高到65℃导致在用于WT CYP119的最终产率80％的下降;然而，对于N-HIS-CYP119，这种降低是只有33％，而对于C-的His-CYP119，几乎没有活性降低被观测到。从图图5（a），和奥林匹克广播公司erved rate constant for the formation resorufin at 25°C was determined to be 6.8 × 10^-3个 s^-1个,三。7个 × 10^-3个 s^-1个,1个。5个 × 10^-2个 s^-1个分别用于WT CYP119、N-His-CYP119和C-His-CYP119。同样，在65℃下，所观察到的resorufin形成的速率常数被确定为5.2 × 10^-3个 s^-1个，1.0 × 10个^-3个 s^-1个，1.0 × 10个^-2个 s^-1个分别用于WT CYP119、N-His-CYP119和C-His-CYP119（图图5（b）). 此外，产物的生成速率与产率并不平行；事实上，C-His-CYP119的产物生成速率最高，但在65°C时的产率明显低于N-His-CYP119_2个O型_2个只被研究了辣根过氧化物酶;这个反应的机理被证明是特别复杂[19]。由于红色的Amplex通过氧化催化CYP119的详细机理尚不清楚，也很难猜测这个分歧在速度和产量的原因。

3.5条。WT-CYP119和N-His-CYP119氧化Amplex红的动力学分析

对于Amplex Red试氧化的更详细的分析，反应后进行紫外 - 可见光谱。10在反应过程中在紫外可见光谱的变化 μM Amplex红色，1.5 M M高_2个O型_2个和1.2 μ图中所示为25°C时的M WT CYP119或N-His-CYP1196个.An increase in 570 nm can be observed during the reaction, this is attributed to resorufin formation. For N-His-CYP119, at the end of the reaction, 16% of Amplex Red was oxidized to product based on the final concentration of resorufin using the extinction coefficient at 570 nm [6个]相比之下，对于WT-CYP119，20%的Amplex-Red被转化为resorufin。对于N-His-CYP119，在415 nm处可同时观察到Soret吸光度降低；在反应结束时观察到Soret吸光度降低37%。另一方面，WT-CYP119在反应过程中没有显示出Soret吸光度的任何显著降低。所观察到的形成resorufin的速率常数被确定为5.8 × 10^-3个 s^-1个和1个。1个 × 10^-3个 s^-1个用于分别WT CYP119和N-HIS-CYP119。该千_{奥林匹克广播公司}for the decay of Soret absorbance for N-His-CYP119 was determined to be 7.6 × 10^-4个 s^-1个.

为了确定N-His-CYP119氧化Amplex-Red的动力学参数，在Amplex-Red（10 ）反应过程中，在570 nm处吸收再形成甲氧呋喃μM）用H_2个O型_2个(0个。2个5个–2个 mM) in the presence of N-His-CYP119 (1.5 μM）。如图所见图6（b），和formation of resorufin increases linearly with time during the first 30 minutes of the reaction; therefore, resorufin concentration at 30 min was used in determination of kinetic parameters. The dependence of initial rate on H_2个O型_2个浓度示于图7个.在图使用数据7个，和千_米was determined to be 1.4 ± 1.1 mM and千_猫was 7.5 ± 3.2 × 10^-4个 s^-1个对于N-HIS-CYP119（在10的存在 μ中号的Amplex红）。

四。讨论

将多组氨酸标签结合到蛋白质中是提高产量和简化蛋白质分离的常见做法。虽然他的标签通常远离活动站点，并且相对较小，但它们并不总是无害的。他的标签可以导致蛋白质结构和功能的改变。在这里，我们研究了C-末端和N-末端His标签对嗜热P450 CYP119的结构和功能的影响。我们发现His标签对CYP119的结构和功能有明显的影响。

用IMAC法分离了C-His-CYP119和N-His-CYP119。WT-CYP119的紫外-可见光谱在414 nm处符合Soret最大吸光度的先前观察结果，且明显α/β乐队。N-His-CYP119和C-His-CYP119显示出与WT-CYP119相似的光谱，从Soret最大吸光度的4 nm移动到418 nm（图2个).

通过检测WT-CYP119的紫外-可见光谱和活性，研究了His标记对酶热稳定性的影响。虽然WT CYP119的最大Soret吸光度随温度的变化不明显，但差异光谱显示，由于聚集作用，散射增加（图S4A).以往的研究中确定的T型_米对CYP119为89℃，和在活性没有降低显著观察到高达80℃[11,20]. 在这项研究中，蛋白质的活性在65℃时降低了80%（图图5（b）），很可能是因为所使用的WT CYP119仅部分分离和大约60％纯的（图S1).

在紫外 - 可见光谱的变化还监测与用于N的His-CYP119增加的温度。A shift in maximum Soret absorbance of N-His-CYP119 from 418 to 415 nm was observed with increasing temperature (Figure3（b）). 差分光谱显示，在425 nm处观察到最大的降低，而在390 nm处观察到吸光度的细微增加伴随着425 nm的降低（图S4B）;吸光度由于散射没有显著增加观察到。此外，N-HIS-CYP119示出了在65℃的高活性;因此，在索瑞吸光度的降低不是由于血红素辅因子的血红素的电子性质的损失，但最有可能的改变。先前的研究已经表明，在索雷最大吸光度蓝移可以归因于在从低自旋铁血红素铁的自旋状态（变化S公司 = 1/2) to high-spin (S公司 = 5/2) state [21]。在紫外 - 可见光谱的类似变化也为C-的His-CYP119（图观察3（c）). 通过跟踪390 nm和425 nm处吸光度差异的变化，可以更清楚地监测Soret吸光度的蓝移∏Abs（390–425）（图3（d）).先前的研究表明在高自旋状态WT CYP119随温度的升高的增加[11]. 根据先前的结果，WT cp119的∏Abs（390–425）随温度升高而增大。然而，如图所示3（d），N-HIS-CYP119的节目在吸光度显著更高移相比于WT CYP119，表明His标签影响活性部位的血红素的电子性质。

随着温度的Amplex红氧化活性的变化对WT CYP119和His标记的变异体进行了测定。这些结果表明，氮-HIS-CYP119在65℃（保持其活性的67％，基于最终产品的形成，图5个).没有观察到活性没有降低显著为C-的His-CYP119随着温度的增加，但这种酶仅表现WT CYP119的20％的活性在室温下。在另一方面，Amplex Red试形成的动力学在没有表现出随温度的变化显著。

由于N-His-CYP119具有最高的活性和稳定性，因此研究了该蛋白催化Amplex-Red氧化的动力学参数。先前的研究表明，CYP119可以催化Amplex红氧化[9个]然而，还没有研究该反应的动力学参数和产率。使用570 nm处的resorufin消光系数[6个]结果表明，在10 的存在下，只观察到16%的产物形成μM Amplex红色，1.5 M M高_2个O型_2个，和1.5 μ米 N-His-CYP119 after 3 hours (Figure6个）;这对应于酶的单个周转。因此，红色的Amplex氧化的产量很低。事实上，当Amplex Red试氧化在H增加浓度的存在下监测_2个O型_2个，和千_猫obtained was only 7.5 ± 3.2 × 10^-4个 s^-1个.相比之下，以前的研究已经确定千_猫用于CYP119 [苯乙烯的氧化9个] as 1.3 s^-1个.因此，Amplex Red试氧化速率比苯乙烯环氧化的当由CYP119催化显著更低。

的Amplex红的由H氧化期间在紫外 - 可见光谱的变化的比较_2个O型_2个在WT和的存在下与N-的His-CYP119可揭示通过添加他的标签的酶功能的变化（图6个).试卤灵形成是在WT CYP119的存在下在25℃下5倍更快相比至N-HIS-CYP119（千_{奥林匹克广播公司}is 5.8 × 10^-3个 s^-1个for WT vs 1.1 × 10^-3个 s^-1个对于N-HIS-CYP119）。类似速率常数通过监测在相同温度下的荧光增加获得的;the discrepancy in the rate constant for N-His-CYP119 (3.6 × 10^-3个 s^-1个）是最有可能是由于在荧光观察结果误差较大。WT CYP119还具有大于N-HIS-CYP119（图略更高的产率6个).此外，N-HIS-CYP119的索雷吸光度在反应过程中降低，而WT CYP119的Soret吸收不显著变化。以前的研究已经表明，治疗过量的过氧化色素P450可导致破坏卟啉和脱辅基酶的修饰，这可以被观察为在索雷吸光度的减少[22–24]. N-H is-CYP119在Amplex-Red氧化过程中更易降解血红素，这可能是由于暴露在溶剂中的血红素辅因子更易被H_2个O型_2个. 或者，基板Amplex Red可以通过与H竞争来防止血红素损失_2个O型_2个用于该反应过程中形成的反应性中间体血红素[22]。WT CYP119可以于Amplex Red，具有更高的亲和力，这导致从保护h的破坏作用_2个O型_2个.两者合计，CYP119的活性位点表明通过N-末端His-标记的掺入显著变化。

5。结论

总之，CYP119，而他的标签是在简化酶的分离和纯化一个非常有效的策略，他们可以对血红素活性位点，结构和酶的活性不可预测的影响。之前的学习 [三,9个]已经使用C端His-标记的CYP119;然而，有His标签蛋白和WT之间没有直接的比较。在我们的研究中，N-HIS-CYP119表现出更高的稳定性，并与C-他-CYP119的活动;因此，它是可能的工业应用中一个很好的候选人。但是，如果-HIS-CYP119 N用于机理研究的活性位点的电子结构似乎已经修改应小心。另外，在N-的His-CYP119 His标签被连接到通过凝血酶切割位点的蛋白;因此，该构建体可用于获得具有额外的纯化步骤的分类标签-WT CYP119。在这里，我们证明了他的标签可能会导致蛋白质结构和功能的差异，而他的标记蛋白质仍显示预期的活动。我们建议应谨慎，特别是如果机械分析将要执行的应采取His标记的酶的调查。

数据可用性

用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。

利益冲突

作者声明本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢埃姆雷Hakli先生实验的帮助和副教授。H.卡格拉Karakaya可以通到超声波发生仪博士，教授。这项工作是由土耳其科学技术研究理事会资助项目（批准116Z380）。

补充材料

一份单独的补充材料pdf包含以下内容：在分离和纯化步骤中对WT和其标记的CYP119变异体的SDS-PAGE分析以及WT-CYP119和其标记变异体的热稳定性分析的差异吸收光谱。(补充材料)

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