使用Murraya Koenigii（L.）对多药物抗性病原体合成的银纳米粒子的抗菌作用

抽象的

病原菌多药耐药的发展已成为细菌感染化疗的全球性问题。广谱β-内酰胺酶βL-）产生肠细菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)是近年来发展迅速的两大类疑难多药耐药细菌。在本研究中，水提物九里koenigii用于银纳米颗粒的合成叶。使用UV-Vis光谱合成的MK-的AgNPs进行了表征，FTIR，XRD，SEM，TEM和，和它们的抗菌潜力上的多个ES评价β产生l的肠道细菌和MRSA。纳米颗粒主要为球形，粒径分布在5 ~ 20 nm。MK-AgNPs中银含量为60.86%。通过圆盘扩散法评价其抑菌活性表明MK-AgNPs能有效地抑制试验病原菌的生长，抑制带大小不同。MK-AgNPs对MRSA和甲氧西林均敏感S.金黄色葡萄球菌MSSA菌株32株μg/ml, ESβL-生产大肠杆菌，它介于32到64 μ克/毫升。控制菌株大肠杆菌（ECS）与16的麦克风相对较为敏感 μ克/毫升。所述的MBC分别按照各自的MIC。生长动力学分析表明，所有的测试增长S.金黄色葡萄球菌菌株被抑制(∼有32人在场时，占90% μMK-AgNPs g / ml。敏感菌株大肠杆菌(ECS)对MK-AgNPs的抗性最低，>81%的抑制率为16μ克/毫升。目前的调查结果令人鼓舞体外绿色合成MK-AgNPs的有效性有待进一步研究在活的有机体内评价其对耐多药菌的治疗效果。

1.介绍

多药耐药性的发展已成为引起致病菌感染性疾病的管理严重后果的全球性问题[1］.这主要是由于人类医疗保健，农业和兽医中的抗生素使用的未分开使用[2]. 最常见的有问题的多重耐药病原体是Acinetobacter Baumannii.，ESβL-生产大肠杆菌，抗青霉素肺炎链球菌肺炎料，肺炎克雷伯菌, vancomycin-resistant肠球菌，耐甲氧西林S.金黄色葡萄球菌，并广泛耐药结核分枝杆菌［3.］.es.βl群体β正以惊人的速度不断发展的β-内酰胺酶具有能力水解第三代头孢菌素在除氨曲南[4，5］.耐甲氧西林S.金黄色葡萄球菌（MRSA）是与肺炎，血液感染和手术部位感染相关的医院感染的最重要原因[6］.鉴于这些问题，研究人员正致力于开发或发现具有广谱治疗效力的新药物。

最近的文献已经证明了金属纳米颗粒作为抗菌剂的潜在作用。然而，通过绿色合成方法可以提高金属纳米颗粒的功能性能。纳米粒子的生物合成正寻求一个特别的考虑，因为与其他纳米粒子合成途径相比，它是生态友好的[7］.尽管物理和化学方法来合成特定尺寸和形状，使用危险材料的上和经济可行性较小的纳米颗粒中的能力使它们的应用受到限制[8]. 常用的化学和物理方法有化学还原法、离子溅射法、溶胶-凝胶法等，这些方法对能量的要求较高，包括临时纯化[9，10］.合成的纳米材料和再现性的稳定性使绿色合成优选的技术在其他方法中[11］.纳米颗粒已从藻类成功合成[12),放线菌(13]，细菌 [14]，植物 [15)、糖(16、生物可降解聚合物(壳聚糖)[17]，来自更多的基质。在上述方法中，植物介导的合成被认为是更快的并且需要较小的优化[18］.

九里koenigii(L.)是一种小型芳香树，俗称咖喱树，属于芸香科，有许多传统药用价值。这种植物的绿叶已被用于印度的医药系统。这种植物的叶子对患有糖尿病的老鼠也有抗高血糖的作用[19］.麻的水醇提取物M科尼吉已显示抗氧化和抗炎活性可与标准药物体外研究[20.］.具有高含量的酚类和黄酮类化合物的含水叶提取物具有有效的自由基清除活性[21.］.Ningappa和Srinivas分离出一种名为咖喱叶蛋白的35 kDa蛋白质，该蛋白质已被发现具有很高的抗氧化活性[22.］.植物化学表征发现主要生物碱的存在作为9-甲酰基-3-甲基咔唑，9-碳甲氧基-3-甲基咔唑和3-甲基咔唑[23.］.的干树皮提取物M科尼吉含咔唑类生物碱和苯并异呋喃酮衍生物具有较强的抗菌活性Aspergillus尼日尔，枯草芽孢杆菌，S.金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，Proteus Ventgaris.，和念珠菌白葡萄酒［24.］.咖喱叶中的抗氧化蛋白对氧化应激引起的人红细胞DNA损伤有明显的改善作用[25.］.

我们以前探讨过抗氧化剂和抗动型潜力M科尼吉［26.］.考虑到良好的药用价值M科尼吉在绿色合成金属纳米颗粒方面的工作缺乏M科尼吉被用于银纳米粒子的合成。将合成的纳米颗粒进行了表征和它们针对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的MDR的抗菌功效，详细进行了评估。

2.材料和方法

2．1.植物样品的采集和水提取物的制备

九里koenigii（咖喱叶）收集在阿里格尔穆斯林大学（AMU），阿利加尔附近，并在植物，AMU，阿利加尔系的植物生物学家进行鉴定。将叶子用蒸馏水洗涤，以除去灰尘和颗粒，随后遮阳在室温下干燥。然后将叶子磨碎用搅拌机做细粉。Five-gram of the leaf powder was mixed in 100 ml of distilled water and heated for one hour at 100°C. The extract was then centrifuged for 10 min at 10,000 rpm and filtered using the Whatman filter. The extract was stored at −20°C for further use.

２.２.用颜色法测定植物化学物质

如前所述，进行化学试验以检测提取物中是否存在主要的植物化合物[27.- - - - - -29.］.

2.2.1。测试单宁

将干燥的提取物（500mg）在20mL水中煮沸，然后过滤。几滴fecl_3.添加（0.1%）以观察蓝黑色或棕绿色。

2.2.2。测试黄酮类化合物

采用了用于检测黄酮类化合物的比色方法[27.，29.］.将稀释的氨水溶液(5 ml)与提取液的水滤液混合，并将H₂所以₄加入。黄色的发展表明存在在站立时消失的黄酮类化合物。一百微多体的NH_3.将溶液（1％）加入到一部分滤液中。再次出现黄色，这是一种用于存在黄酮类化合物的指示剂。

2.2.3. 糖苷类检验

少量的植物提取物溶解在水中。加入1ml % NaOH溶液。黄色的外观证实了糖苷的存在[30.］.

2.2.4。测试由Salkowski测试萜类化合物

这aqueous extract (5 ml) was mixed in 2 ml of chloroform, and 3 ml of conc. H₂所以₄小心地通过试管壁添加。界面呈现红棕色，表明存在萜类化合物。

2.2.5。用凯勒-基利亚尼试验检测心脏苷的试验

用冰醋酸（2mL）处理含水萃取物（5ml），含有一滴FECL_3.solution, followed by addition of 1 ml of conc. H₂所以₄．界面处出现棕环，表明有脱氧糖，这是强心内酯的特征。

2.3。银纳米粒子（的AgNPs）通过水提物的合成

For synthesis of AgNPs, aqueous solution of 1 mM silver nitrate (AgNO_3.)准备。首先，20毫升AgNO_3.将溶液（1mM）加入0.5,1.0,2.0和4.0ml等分试样中M科尼吉水提取物。这reaction was allowed to take place in 50 ml volumetric flasks at room temperature, and solutions were kept on a magnetic stirrer for vigorous mixing to optimize the reduction of AgNO_3.通过植物提取物。最后加0.5 ml的M科尼吉萃取物和20ml硝酸银含有硝酸银水溶液（1mM）是最佳的;因此，本研究进一步使用这种浓度。减少Agno_3.到AG⁺离子被证实是由深褐色的外观，最后变成黑色。AgNPs是由M科尼吉(MK-AgNPs) were harvested by centrifugation at 11,000 rpm for 25 minutes at 25°C. The pellet obtained was dried in an oven at 60°C. As the combination of 0.5 ml of the aqueous extract and 20 ml of 1 mM AgNO_3.结果表明，以该组合合成的AgNPs是最佳的，并用于所有进一步的实验。

2.4。纳米粒子合成及表征植物提取物

如前所述，采用标准程序对MK-AgNPs进行表征[31.］.

2.4.1. 紫外可见光谱分析

用紫外可见分光光度计对MK-AgNPs进行了初步表征。通过记录溶液在一小时后的紫外可见光谱，直到没有发现吸光度的变化，来监测银离子还原制备银纳米颗粒的过程。用Cintra 10检测AgNP溶液的吸收光谱(300-600 nm)E.分光光度计（GBC科学仪器公司），和蒸馏水用于基线校正。

2.4.2。x射线衍射分析

通过X射线衍射仪获得的银纳米颗粒进行了表征粉末形式。使用CuK得到的衍射图案_α辐射（λ = 1.54060 Å) with a nickel monochromator from 20° to 80°. The average crystalline size of the nanoparticles was calculated using Scherer’s equation: 在哪里D为纳米颗粒的平均晶体尺寸，λ是X射线源的波长（1.54060），β为衍射峰最大值的一半宽度，K为Debye-Scherrer方程的常数，取值范围为0.9 ~ 1.0。

2.4.3。红外光谱

FTIR是用于鉴定和表征的重要技术，因为它给出了关于分子的转动和振动模式的有价值的信息。MK-的AgNPs通过离心，用去离子水洗涤三次，以摆脱未结合的或松散地附着的蛋白质/酶或从银纳米颗粒的表面的任何其他phytocompounds的。Powder of MK-AgNPs was diluted with KBr (1 : 100), and the transmittance spectrum was recorded. FTIR measurements were carried in the diffuse reflectance mode at 4 cm⁻¹使用PerkinElmer FT-IR光谱仪（Spectrum二，PerkinElmer Life和Analytical Sciences，CT，USA）分辨率分辨率。

2.4.4。透射电子显微镜（TEM）

将MK-AgNPs的水悬浮液置于透射电镜网格上制备网格。在成像前，让它风干一夜。使用透射电子显微镜(JOEL-2100，东京，日本)，在阿利加尔的AMU大学精密仪器设备(USIF)以200千伏的电压和2万到10万倍的放大倍数拍摄了单独的图像。

2.4.5. 扫描电子显微镜（SEM）

对于SEM分析，使用MK-的AgNPs的细粉。这images were recorded using the JSM-6510LV scanning electron microscope (JEOL, Tokyo, Japan) at an accelerating voltage of 20 kV at the University Sophisticated Instrumentation Facility (USIF), AMU, Aligarh. The analysis of elemental composition of MK-AgNPs was performed using the INCAx-sight EDAX spectrometer (Oxford Instruments) equipped with an SEM.

2．5．MK-AgNPs抗菌活性的评价

2.5.1。菌株

用提取液合成的纳米银颗粒(MK-AgNPs)对3株革兰氏阳性菌和4株革兰氏阴性菌进行了抑菌试验。革兰氏阳性菌株中，有1株耐甲氧西林S.金黄色葡萄球菌（MRSA）和两种甲氧西林敏感S.金黄色葡萄球菌（MSSA1和MSSA2）。在革兰氏阴性细菌菌株中，三个扩展谱β-lactamase-producing大肠杆菌(电子商务βL1，ECESβL2和ECESβL3)和一个敏感大肠杆菌(ECS)用于本研究。

2.5.2。琼脂井扩散测定

使用琼脂孔扩散测定评估MK-AgNP的初步抗菌活性，如前所述[31.］.在营养液中生长细菌测试生物过夜，以获得〜10的菌落形成单位（CFU）⁶每毫升。每种细菌培养液在Luria-Bertani琼脂平板上扩散100微升。用消毒的微管针尖打孔琼脂孔(8°mm)，并装入双蒸馏水AgNO_3.解决方案，以及MK-的AgNPs。这plates were then incubated for 18 h at 37°C, and diameters of zone of inhibition were recorded in millimetre (mm).

2.5.3。测定最小抑制浓度（MIC）

对测试细菌的MIC MK-的AgNPs使用TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）在96孔微量滴定板测定如先前所述[32.］.两倍稀释MK-AgNPs (256-08μG /ml)，在96孔微滴定板的高压介质中制成。每孔接种10微升过夜培养物，对照组不含MK-AgNPs。然后让培养物在细菌培养箱中生长一夜。为了表明代谢活性的细菌细胞的存在，在添加10μTTC（2）的l/井毫克/毫升）。未发现颜色变化的浓度作为MIC。

2.5.4。测定最小杀菌浓度（MBC）

如Ansari等人所述，通过Macrobroth稀释测定评估了对测试细菌病原体的MBC-AGNPS。很少的修改[33.］.所有细菌培养物均在含有MK-AgNPs的培养基中培养，以含有MK-AgNPs的组为对照。不同浓度稀释的两倍(256-16μ选择G / ml）用于治疗以确定MBC。然后将过夜生长的培养物从每个处理的浓度从每个处理的浓度下划线以确定MBC。

2.5.5。生长曲线分析

MK-AGNP对生长动力学的影响大肠杆菌和S.金黄色葡萄球菌采用光密度测量法监测分离物[34.］.银纳米颗粒的两倍稀释范围从256 μ8 g / mlμG /ml，在无菌的96孔微量滴定板中，置于营养肉汤中。10微升隔夜培养物(~ 10⁶ CFU/ml) was inoculated in each well containing varying concentrations of MK-AgNPs. Wells containing only media was taken as the control group, and each concentration was performed in three replicates. All untreated and treated sample plates were incubated for 20 h at 37°C. The OD_620nm处采用microplate reader (Thermo Scientific Multiskan EX, REF 51118170, China)每隔2小时记录一次。取3个重复的平均值，绘制每种培养物在每种纳米粒子浓度下的生长曲线。

3.结果与讨论

3．1.植物化合物的颜色测定和总酚含量的定量测定

各种颜色的测试上的不同提取物进行M科尼吉揭示医药活性phytoconstituents的存在。的水提取物M科尼吉显示存在类黄酮、单宁和强心苷，而未检测到苷。

３．２．利用植物提取物绿色合成纳米银

几种药用植物已经成功地用于合成银纳米颗粒[18，35.]. 在本研究中，水提取物M科尼吉为的AgNPs的合成进行了测试。这M科尼吉提取液加入到AgNO中_3.解决方案，并监测颜色的变化。

3.2.1。AGNP合成的UV可见分析

本文对用浸提液合成的MK-AgNPs进行了初步表征M科尼吉通过UV可见光光谱完成。加入M科尼吉提取液中，硝酸银溶液在孵育4 h后颜色变为深褐色，表明银纳米颗粒的形成。提取物颜色的变化显示了植物提取物合成AgNPs的还原能力[36.］.由于纳米颗粒表面的导通带电子的相干振荡而出现棕色，导致表面等离子体共振（SPR）[37.］.制备的纳米银胶体溶液的紫外可见光谱M科尼吉(MK-AgNPs)作为AgNO减少引起的时间函数_3.如图所示1. 在硝酸银溶液中加入提取物后，没有明显的吸收峰，而在400–450处有一个吸收峰随着溶液颜色的改变，纳米开始出现。SPR波段为410 nm表示通过以下方法合成银纳米颗粒：M科尼吉E.xtract that saturated after 4 hours.

3.2.2。XRD分析

通过XRD谱图对所合成的绿色MK-AgNPs进行进一步表征。数字2显示MK-AGNPS的典型XRD模式。通过峰值扩展明显明显明显明显。MK-AGNP在2时显示出最大峰值θ值为33.74°。MK-AgNPs的平均粒径为13.54 nm。通过透射电子显微镜(TEM)验证了MK-AgNPs的尺寸范围和形状。

3.2.3。傅里叶变换红外光谱法

利用傅立叶变换红外光谱(FTIR)分析了不同植物成分的作用M科尼吉其负责MK-的AgNPs的合成和稳定化。数字3.显示了MK AgNPs的FTIR光谱。3404附近的综合峰值厘米⁻¹表示羟基的伸缩振动。这short absorption peak at 2928 cm⁻¹与脂肪族碳氢键伸缩振动有关。吸收带在1642厘米处⁻¹可归因于胺的N-H键。1370和1390之间存在少量短峰厘米⁻¹对应于ch_3.-CH烷烃和烷基的键。突出的峰值在1063厘米处⁻¹是由于羧酸、醇和醚的C-O伸缩。山顶在632左右厘米⁻¹可能是由于芳族化合物的C-H键。它已被记载，phytocompounds和蛋白质/酶存在于植物中的提取物用作封端剂[38.，39.］.

3.2.4。透射电子显微镜

吸收光谱仅提供有关AgNPs形成的信息。详细研究了纳米颗粒的形成，并用TEM进行了验证。图形4显示了MK AgNPs的透射电子显微照片。TEM图像清楚地显示了不同的尺寸范围（5-20 MK AgNPs的纳米级。此外，透射电子显微照片显示，大多数粒子呈球状，少数纳米粒子具有各向异性的形貌。也发现少量颗粒会形成小团聚体，这可能是由于结块或盖层不当造成的。通过绿色合成方法合成的纳米颗粒在形状和尺寸上的变化也在前面有记录[40，41.］.

3.2.5。扫描电子显微镜

用扫描电子显微镜观察合成的纳米粒子的表面形貌。扫描电子显微照片在7000倍的银纳米颗粒合成使用M科尼吉如图所示5．大多数纳米粒子的表面形貌呈各向异性。从EDX图中可以看出，MK-AgNPs中银、碳、氧和氯的元素组成按重量分别为60.86%、19.84%、12.53%和6.77%(图)5(b))。然而，颗粒大小的分布也依赖于它们的相对成核速率、团聚程度和生长过程[42.］.

3.3。MK-的AgNPs的抗菌活性

3.3.1。琼脂井扩散测定

研究了MK-AGNP的抗微生物活性大肠杆菌和S.金黄色葡萄球菌使用琼脂孔扩散测定。抑制区域（mm）含有MK-AgNP和Agno_3.解如图所示6．MSSA2对MK-AgNPs和AgNO的最小抑制带分别为16 mm和15 mm_3.解决方案100. μ.g /。ECS对MK-AgNPs和AgNO表现出21和18 mm的最大抑制区_3.分别解决方案。与Agno相比，AgNP的增强抗菌活性_3.解决方案归因于其大表面积，可提供与微生物的更多表面接触[43.］.文献中记载的AgNPs抗菌活性增强的另一个重要原因是粒子与天然化合物之间的协同效应[44.］.卡多佐等人。发现吩嗪-1-甲酰胺和的AgNPs之间的协同作用增加了抗菌效果通过32倍对MRSA菌株，导致形态学改变细菌的细胞壁[45.］.AgNPs抗菌活性的作用机制是攻击呼吸链和细胞分裂，最终导致细胞死亡。银纳米颗粒也被报道在细菌细胞内释放银离子，进一步增强其杀菌活性[46.］.

3.3.2。MK-AgNPs的MIC和MBC

结果表明，MK-AgNPs是一种有效的抗菌剂。图中显示的是被测菌株未见明显生长的记录MIC值6．MK-AgNPs对MRSA和MSSA的最低抑制浓度为32μ克/毫升。ECS被发现是所测试的菌株中最敏感的带16的MIC值 μg/ml，而ECESβL2被发现对MIC值为64的银纳米颗粒具有高度抗性 μ克/毫升。然而，到目前为止，还没有确定的标准来考虑阻力水平上的MIC断点。

MBC是任何抗菌剂的最低浓度，杀死100％的细菌种群，并且在琼脂平板上划线时没有显示任何可行的生长。MK-AGNPS的MBC的价值在图中介绍6. MRSA、MSSA1、MSSA2、ECES的MBC值βL1，ECESβL2和ECESβL3被发现是64 μg/ml，对ECS的MBC为32μG / ml对于MK-AGNPS。这些值符合MIC结果，发现ECS被发现最敏感。

类似的结果早前也有记录，其中AgNPs的MIC和MBC值使用蓝桉反对大肠杆菌被发现是36和42 μ克/毫升(47.］.使用的种子提取物制备的AgNPs。此外，安萨里和Alzohairy报告MIC和MBC值凤凰dactylifera分别为10.67和17.33μG /ml，分别抗甲氧西林耐药S.金黄色葡萄球菌［48.］.这些变化可能是由于用于测定，纳米颗粒的测定，尺寸和性质的测试菌株的不同内在耐受性，以及用于测定MIC和MBC的方法。

3.3.3. 纳米银对细菌生长动力学的影响

对MRSA，MSSA，ES MK-的AgNPs的剂量依赖性作用βL-生产大肠杆菌，和一个敏感的大肠杆菌对菌株ECS进行了研究。用酶标仪在620 nm处测量吸光度，在不同时间间隔监测生长情况。所有菌株均以双倍稀释的方式给予纳米颗粒处理，对照组为未加任何MK-AgNPs修饰的孔。MK-AgNPs对MRSA的抑制程度分别为31.4%、53.3%和85.6%，分别为8、16和32μ分别为g / ml(图7），浓度高于32 μ发现G / ml是抑制超过90％的细菌。治疗8,16和32 μ克/ ml的MK-的AgNPs的导致37.0％，48.5％，和对MSSA1，分别90.8％抑制，如图8(一个)．浓度超过32 μ微克/毫升由95％以上的检查MSSA1增长。对于MSSA2得到抑制的类似的模式，如图呈现8 (b)．对于ECES.βL1菌株，存活力的降低，观察到分别为19.8％，59.6％，和87.4％，（图9（a））.相反，ECESβL2表明21.3％，57.4％，和60.4％的抑制率表示对MK-的AgNPs更多的阻力相比，ECESβL1（图9（b））.ECESβL3表现出与ece相似的生长动力学β不同浓度的MK AgNPs下的L1（图9（c））.ECS显示出对MK-AGNP的抵抗力最低，抑制31和81.8的抑制百分比 μ克/ ml（图10）.浓度大于16μg/ml可抑制90%以上的ECS。银纳米颗粒的毒理学影响不仅取决于其大小，还取决于测试生物体[49.］.它已被Brunner等记录。该纳米颗粒的毒性可以是由于来自纳米颗粒如Ag释放出金属离子的⁺或活性氧的产生，或生物大分子的直接相互作用和破坏，例如插入DNA [50.］.一项研究表明，从平均大小为18nm的绿色方法合成的银纳米颗粒表现出对ES的麦克风价值βL-生产大肠杆菌和P铜绿假单胞菌为36μ微克/毫升和27 μ微克/毫升，分别[47.］.

(一)

(b)