Dihydropyrimidinase的结构性基础pH-Dependent寡聚化铜绿假单胞菌PAO1

文摘

Dihydropyrimidinase, dimetalloenzyme含有羧酸盐活性部位中的赖氨酸,是环酰胺水解酶家族的一员,也包括尿囊素酶,dihydroorotase hydantoinase, imidase。与所有已知dihydropyrimidinases,四聚物的,pseudomonal dihydropyrimidinase形成二聚体在中性博士在这篇文章中,我们报告的晶体结构铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase pH值在5.9 (PDB项5 ykd)。的晶体铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase属于空间群C222年₁与细胞的尺寸一个= 108.9,b= 155.7,c= 235.6。的结构铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase解决了2.17一项决议。非对称晶体包含四个结晶学的独立单位铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase单体。凝胶过滤色谱分析纯化铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase透露二聚体和四聚体在pH值5.9。因此,铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase可以形成一个稳定的四聚物的结晶状态和解决方案。基于序列分析和结构的对比dimer-dimer之间的接口铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase和栖热菌属sp. dihydropyrimidinase,提出不同的齐聚反应机制。

1。介绍

Dihydropyrimidinase是嘧啶分解代谢的关键酶(<一个href="#B1">1,<一个href="#B2">2]。Dihydropyrimidinase催化dihydrouracil的可逆环化N[氨基甲酰-β丙氨酸在第二步的嘧啶降解途径(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig1/" target="_blank">1)。Dihydropyrimidinase酰亚胺基团也可以消除外源性物质,从线性胺杂环胺(<一个href="#B3">3- - - - - -<一个href="#B9">9]。从微生物被称为hydantoinase同源酶作为生物催化剂的水解5-monosubstituted乙内酰脲的合成D -和l -氨基酸(<一个href="#B10">10,<一个href="#B11">11]。光学纯的氨基酸被广泛用作半合成抗生素中间体、活性肽激素,抗真菌剂、杀虫剂和甜味剂。Dihydropyrimidinase和hydantoinase通常具有相似的活性部位,但他们的整体序列身份和底物特异性可能有所不同(<一个href="#B3">3,<一个href="#B12">12]。例如,hydantoinase纯化农杆菌属物种没有5,6-dihydropyrimidine酰胺水解酶活性(<一个href="#B13">13]。Dihydropyrimidinases从酵母酿酒kluyveri和黏菌盘基网柄菌discoideum不水解乙内酰脲(<一个href="#B14">14]。因此,一些细菌hydantoinases仍命名和标识为dihydropyrimidinase因为他们对天然底物的催化活性,即dihydrouracil dihydrothymine。这些细菌酶包括铜绿假单胞菌和栖热菌属sp. dihydropyrimidinases [<一个href="#B15">15,<一个href="#B16">16]。

Dihydropyrimidinase、hydantoinase imidase、尿囊素酶和dihydroorotase属于环酰胺水解酶家族,因为他们的功能和结构相似之处(<一个href="#B17">17]。这种酶的家人的开环水解催化环酰胺键的底物在五年或六元环。即使这些酶也有类似的功能,他们有相对较低的氨基酸序列的身份。此外,这些酶的底物选择性和特异性高度不同(<一个href="#B18">18,<一个href="#B19">19]。大多数活跃的站点dihydropyrimidinases hydantoinases,尿囊素酶,和dihydroorotases包含四个组氨酸,一天冬氨酸,和一个羧酸盐赖氨酸残留金属所需的绑定和催化活性(<一个href="#B8">8,<一个href="#B15">15,<一个href="#B18">18,<一个href="#B20">20.,<一个href="#B21">21]。羧酸盐的存在赖氨酸在hydantoinase也是双核的金属中心的自组装所需的(<一个href="#B12">12,<一个href="#B20">20.,<一个href="#B22">22)和增加的氢氧化催化的亲核性<一个href="#B23">23]。的全球架构dihydropyrimidinase单体包括两个领域,即,一个大的领域经典(β/α)₈核心筒结构嵌入催化dimetal中心和一个小β三明治域(<一个href="#B16">16,<一个href="#B22">22,<一个href="#B24">24,<一个href="#B25">25]。

所有已知dihydropyrimidinases除了pseudomonal酶是四聚体。Hydantoinase从P。putidaYZ-26函数作为一个二聚体(<一个href="#B26">26,<一个href="#B27">27]。最近,我们发现dihydropyrimidinase铜绿假单胞菌PAO1也形成一个二聚体(<一个href="#B28">28]。此外,的晶体结构铜绿假单胞菌PAO1 dihydropyrimidinase表示,一些残留tetramerization不是发现的关键铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase [<一个href="#B28">28]。在这项研究中,我们发现的寡聚化铜绿假单胞菌PAO1 dihydropyrimidinase pH-dependent过程。在pH值为5.9,铜绿假单胞菌PAO1 dihydropyrimidinase主要形成四聚物。确认这个结果和确定这种酶也可以形成四聚物,我们也决定了晶体结构铜绿假单胞菌PAO1 dihydropyrimidinase 2.17决议在酸性环境。结构比较表明,虽然铜绿假单胞菌PAO1 dihydropyrimidinase也可以形成四聚物,残留物对tetramerization不同于那些是至关重要的栖热菌属sp. dihydropyrimidinases。

2。材料和方法

2.1。克隆、蛋白质表达、纯化

的建设铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase表达质粒已经报道(<一个href="#B15">15]。重组铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase表达和纯化使用先前描述的协议(<一个href="#B15">15]。的蛋白质纯化可溶性镍上层清液^{2 +}亲和色谱法(HiTrap惠普;通用电气医疗集团生物科技,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)筛选了与缓冲(20毫米Tris-HCl、250毫米咪唑和0.5 M氯化钠,pH值7.9)和透析对透析缓冲区(20毫米玫瑰和100毫米氯化钠,pH值7.0;缓冲B)。蛋白质纯度> 97%,由sds - page (Mini-PROTEAN Tetra系统;美国CA Bio-Rad)。

2.2。凝胶过滤色谱法

凝胶过滤色谱法是由AKTA-FPLC系统(通用电气医疗集团生物科技,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。总之,纯化蛋白(5毫克/毫升)缓冲C(20毫米MES和100毫米氯化钠,pH值5.9)应用于Superdex 200预备年级列(美国通用电气医疗集团生物科技,皮斯卡塔韦,新泽西)平衡缓冲(相同的<一个href="#B29">29日]。列操作在0.5毫升/分钟的流量,在280 nm和蛋白质检测。列与已知分子量的蛋白质:校准甲状腺球蛋白(670 kDa),γ球蛋白(158 kDa),卵清蛋白(44 kDa),肌红蛋白(kDa 17日),和维生素B₁₂(1.35 kDa)。

2.3。晶体学

结晶之前,铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase集中到20毫克/毫升在缓冲c .晶体生长在室温下通过在10% PEG 8000挂掉蒸汽扩散,消息灵通的100毫米,200毫米醋酸钙,pH值5.9。数据收集和细化统计的水晶铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase如表所示<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/tab1/" target="_blank">1。数据是使用一个收集ADSC量子- 315 r CCD探测器在SPXF beamline BL13C1在NSRRC(台湾,中华民国)。所有的数据集成和扩展进行了使用hkl - 2000 (<一个href="#B30">30.]。有四个铜绿假单胞菌每个不对称单位dihydropyrimidinase单体。的晶体结构铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase解决了2.17决议与分子替换软件爱慕(<一个href="#B31">31日)使用dihydropyrimidinase (PDB项5 e5c) (<一个href="#B28">28)模型。分子置换后,模型构建进行了使用XtalView [<一个href="#B32">32]。中枢神经系统是用于分子动力学优化(<一个href="#B33">33]。最终的结构是一个精炼R0.1759和一个的因素R_免费的0.2312。原子坐标和相关的结构性因素已经存入5 ykd PDB加入代码。

3所示。结果与讨论

3.1。的结构铜绿假单胞菌Dihydropyrimidinase单体

晶体的铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase种植在室温下通过在10% PEG 8000挂掉蒸汽扩散,消息灵通的100毫米,200毫米醋酸钙,pH值5.9。的晶体铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase下这种情况属于空间群C222年₁与细胞的尺寸一个= 108.9,b= 155.7,c= 235.6。的晶体结构铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase解决分辨率(表2.17<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/tab1/" target="_blank">1)。单位细胞包含八个分子。非对称晶体包含四个结晶学的独立单位铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase单体,其中两个锌离子被发现在每个单体的活性部位(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig2/" target="_blank">2(一个))。大多数的电子密度铜绿假单胞菌观察dihydropyrimidinase展出质量好,没有间断。简单地说,每一个的总体结构铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase单元由17α螺旋线,19β床单和两个锌离子(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig2/" target="_blank">2 (b))。在pH值为5.9,的架构铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase单体包含两个域,即一个大领域经典(β/α)₈核心筒结构嵌入催化dimetal中心和一个小β三明治域。

3.2。结构的比较

整体结构和体系结构的活性部位铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase类似于其他dihydropyrimidinases(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig3/" target="_blank">3(一个))和其他氨基水解酶的酶家族的成员,如hydantoinases dihydroorotases,尿囊素酶(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig3/" target="_blank">3 (b))。这些酶的活动网站包含四个组氨酸,一天冬氨酸,和一个羧酸盐赖氨酸残留金属所需的绑定和催化活性(<一个href="#B12">12,<一个href="#B14">14,<一个href="#B15">15,<一个href="#B19">19,<一个href="#B20">20.,<一个href="#B34">34,<一个href="#B35">35]。

3.3。pH-Dependent齐聚反应的铜绿假单胞菌Dihydropyrimidinase

这是指出,晶体的二聚的铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase属于空间群P3₁21日增长在6000年28%的条件挂钩,消息灵通的100毫米,200毫米醋酸锂,pH值7.5 [<一个href="#B28">28]。由于不同结晶条件,我们试图测试是否寡聚化铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase pH-dependent。所有已知dihydropyrimidinases四聚体。然而,pseudomonal dihydropyrimidinase / hydantoinase形成二聚体在中性pH值(<一个href="#B26">26- - - - - -<一个href="#B28">28]。考虑到结构意味着铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase也可能形成四聚物的结晶状态(图5.9 pH值<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig2/" target="_blank">2(一个)),我们进行生化鉴定确认齐聚反应状态。确认是否寡聚化铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase pH-dependent,我们进行了凝胶过滤色谱法在pH值5.9。如图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig4/" target="_blank">4结果显示,两种洗脱体积为63.25和69。26毫升共存。的分子质量铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase单体,从氨基酸序列,计算53 kDa。假设这两种形式的铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase有形状和部分具体体积相似的标准蛋白质,本机的分子质量铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase估计为105和180 kDa,大约1.9和3.5倍的分子质量铜绿假单胞菌分别dihydropyrimidinase单体。在pH值7.5相比,凝胶过滤色谱分析铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase透露一个峰值;本机分子质量估计117 kDa [<一个href="#B28">28]。这种酶的两种形式从凝胶过滤色谱法获得在pH值5.9有相似的特定活动(数据未显示)。因此,铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase确实存在二聚体和四聚体的混合物在pH值5.9。

3.4。结构洞察的二聚体,二聚体(四聚物)Dihydropyrimidinase的形成

在这项研究中,我们已经确定了铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase确实存在二聚体和四聚体的混合物在pH值5.9。来评估铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase可以形成一个稳定的四聚物,dimer-dimer接口进行了分析。水晶的铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase,四个分子形成两对二聚体,分别b和c - d(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig5/" target="_blank">5)。因为两个二聚体铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase副通过几个联系人创建四聚物,它被认为四聚物的状态可能会由于包装水晶的力量。我们注意到,在水晶,另一个相关的结晶学四聚物B-A-C′- d′(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig5/" target="_blank">5通过许多氢键)成立,进一步稳定和盐桥(表<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/tab2/" target="_blank">2和<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/tab3/" target="_blank">3)。这个tetramerization结构是相似的栖热菌属sp. dihydropyrimidinase (PDB项1 gkq)。

我们还比较了残留重要tetramerization位于B-A-C′- d′与dimer-dimer接口栖热菌属sp. dihydropyrimidinase(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig6/" target="_blank">6)。虽然他们的整体结构是相似的,四聚物的重要残留物(二聚体c′′二聚体a - d)的形成有很大的不同。四聚物的形成铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase,许多氢键与近距离被发现:这些债券(< 3)包括K374 E14灯头(A) (B), H13 (A) E14灯头(B), R386 E14灯头(A) (B), R386 E15 (A) (B), R467 -V354 (A) (B), R468 -G357 (A) (B), E14灯头(A) -H13 (B), E15 -R386 (A) (B), V354 -R467 (A) (B), G357 -R468 (A) (B), H13 (C′) E14灯头(D′), R386 (C′) E15 (D′), R468 (C′) -G357 (D′), E14灯头(C′) -H13 (D′), E14灯头(C′) -K374 (D′), E15 (C′) -R386 (D′)和G357 (C′) -R468 (D′);然而,这些残留没有发现四聚物形成的栖热菌属sp. dihydropyrimidinase(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig6/" target="_blank">6)。只有A13-D14氢键被发现栖热菌属sp. dihydropyrimidinase(即。,H13-E14铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase)。因此,dimer-dimer之间的接口铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase和栖热菌属sp. dihydropyrimidinase明显不同(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig7/" target="_blank">7)。由叠加比较表明,许多参数残留物(R253, R358, R386 R467, R468)中发现的铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase,但不是栖热菌属sp. dihydropyrimidinase, pH-dependent齐聚可能起到至关重要的作用。如果考虑到pK_一个,一个更好的候选人His13参与分子间的相互作用,依赖于其侧链的环境,这可能很容易地更改酸碱5.9和7.5之间的质子化作用状态。然而,这种推测需要进一步证实了生化实验。

3.5。不同的Dihydropyrimidinases四聚物的形成机制

在这项研究中,我们确定了铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase可以是四聚物在溶液中结晶状态和(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig4/" target="_blank">4)。四聚物的结构栖热菌属sp. dihydropyrimidinase和铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase比较(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig6/" target="_blank">6)。许多重要的残基栖热菌属sp. dihydropyrimidinase四聚物形成的不同铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase(图<一个href="//www.newsama.com/journals/bca/2018/9564391/fig7/" target="_blank">7)。基于这些结果,我们得出的结论是,铜绿假单胞菌dihydropyrimidinase可以形成四聚物,但其寡聚化机制不同于其他dihydropyrimidinases等栖热菌属sp. dihydropyrimidinase。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢提供的技术服务同步加速器辐射蛋白质晶体学设施国家核心设施项目的生物技术、科学技术部、国家同步辐射研究中心,国家科技部支持的用户设备,台湾,中华民国。这项研究受到了科技部的资助,台湾(大多数106 - 2320 - b - 040 - 004) Cheng-Yang黄。

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