文摘

血小板活化据报道在动脉血栓形成中发挥重要作用,癌症转移,发展。最近,我们开发了一种新型红外(III)的化合物,(Ir (Cp 3 - (1 - (2-pyridyl) 4-dimethylaminophenyl)咪唑并[1 5]吡啶Cl)的男朋友4或Ir-6作为抗血小板药物和评估其有效性。Ir-6表现出更高的力量对人类血小板聚集刺激胶原蛋白。Ir-6也抑制ATP-release,细胞内Ca2 +动员、P-selectin表达式和磷脂酶C的磷酸化γ2 (PLC)γ2)、蛋白激酶C (PKC) v-Akt小鼠胸腺瘤病毒致癌基因一种蛋白激酶/蛋白激酶B,和增殖蛋白激酶(MAPKs) collagen-activated血小板。腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536和鸟苷酸环化酶抑制剂1 h - (1、2、4) oxadiazolo [4, 3] quinoxalin-1-one显著逆转Ir-6-mediated抑制胶原诱导的血小板聚集。此外,Ir-6没有大幅减少哦激进信号collagen-activated血小板或芬顿反应的解决方案。2毫克/公斤,Ir-6明显延长了在实验小鼠出血时间。总之,Ir-6中扮演着关键角色通过抑制血小板激活的抑制信号通路,如PLCγ2-PKC瀑布和随后的一种蛋白激酶抑制MAPK激活,从而最终抑制血小板聚集。因此,Ir-6代理是一个潜在的治疗对于预防或治疗血栓栓塞疾病或破坏血小板和肿瘤细胞之间的相互作用,导致肿瘤细胞生长和发展。

1。介绍

无核红细胞,血小板血栓形成中发挥至关重要的作用在生理和病理条件下。它们需要维持血管系统的完整性和的一线防御出血。在遇到一个皮下基质暴露的血管损伤,血小板坚持矩阵和成为其他血小板激活和胶粘剂,导致进一步聚合(1]。在血小板活化,释放一些介质(例如,ATP,凝血恶烷2)与细胞内钙相对同时发生2 +([Ca2 +]我)动员、吸引更多的血小板内皮受伤,因此增厚的初始血小板单层。最后,纤维蛋白原结合其特定的血小板受体,完成最后的血小板聚集的共同通路。

血小板及其激活的关键事件,在癌症发展发挥重要作用[2,3]。血小板在肿瘤发展的影响提出了控制过程,引发肿瘤生长。因此,抑制血小板聚集,预计是一个新颖的治疗目标为减少platelet-tumor复合物的形成(4]。过渡金属配合物,其中包括铱(Ir),探讨了至少十年作为生产创新平台分子具有抗癌特性。尽管几个生物研究表明想法化合物表现出强大的抗癌活性和相对较少的副作用,没有研究调查了红外化合物对血小板聚集的影响。

近年来,研究人员更加关注在红外(III)化合物因为他们发现强大的抗肿瘤活性对正常组织细胞毒性较低(5,6]。同样,红外复合物显示优良的抗血管新生的影响通过激活各种反血管增生信号通路(5]。在早期的研究中,我们已经表明,苯酚(7和苯甲醚8]取代咪唑并[1 5]吡啶ligand-based铱(III)复合物及其抗血小板和抗血栓形成的活动。延续这些研究的电子给体的影响在咪唑并[1 5]pyridine-based配体,我们介绍了二甲苯胺作为强大的电子供体组并研究其抗血小板的活动。此外,我们开发了一个新的生物活性Ir (III)导数Ir-6如图1(一)。此外,一项研究报告红外的光物理、光化学性质(3)-cyclometalated复合物包含发光的配体(9]。因此,我们使用相同的配体合成Ir-6复杂(Ir (Cp 3 - (1 - (2-pyridyl) 4-dimethylaminophenyl)咪唑并[1 5]吡啶Cl] BF4执行这项研究。虽然一些体外和体内抗癌活动展示了想法化合物,到目前为止,还没有研究调查对血小板聚集的影响。我们的初步研究结果显示Ir-6强力的抗血小板活性的人类血小板;因此,我们进一步研究了Ir-6的分子机制和活动对血小板激活。目前的研究是一个主要的步骤调查Ir-6的强有力的活动是否对癌症恶化是由于它能够有效地抑制血小板聚集。

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图1
比较的水平Ir-6-mediated抑制血小板聚集诱导人类血小板受体激动剂在洗。(一)合成复杂的(Ir-6) [Ir (Cp )(L) Cl)的男朋友4。(b)血小板(3.6×108细胞/毫升)与溶剂preincubated控制(0.1% DMSO)或Ir-6 (5 - 500 米),随后处理胶原蛋白(1 g / mL),花生四烯酸(AA;120年 米),凝血酶(0.01 U /毫升)或U46619 (1 米)刺激血小板聚集。(c)的量效直方图Ir-6代表的水平抑制血小板聚集了各种受体激动剂。提出了数据为平均值±标准平均误差( )。

2。材料和方法

2.1。化学物质

凝血酶、胶原蛋白、花生四烯酸(AA), luciferin-luciferase, U46619,佛波醇12日13-dibutyrate (PDBu),硝酸甘油(NTG)、肝素、前列腺素E1(铂族元素1)5 5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide (DMPO) SQ22536, 1 h - (1、2、4) oxadiazolo [4, 3] quinoxalin-1-one (ODQ) LY294002, SB203580, PD98059, SP600125,牛血清白蛋白(BSA)购买的σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。Fura-2AM购买从分子探针(尤金,或者美国)。一个anti-phospho-p38增殖蛋白激酶(MAPK)爵士182年单克隆抗体(mAb)购买的圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。Anti-p38 MAPK, anti-phospho-c-Jun n端激酶(物)(用力推183年/酪氨酸185年),anti-p44/42细胞外signal-regulated激酶(ERK)马伯以及anti-phospholipase Cγ2 (PLC)γ2),anti-phospho(酪氨酸759年)公司γ2、anti-phospho——(Ser)蛋白激酶C (PKC)衬底(pleckstrin;p-p47)、anti-JNK anti-phospho-p44 /页ERK(刺202年/酪氨酸204年)多克隆抗体(绝压)购买从细胞信号(美国贝弗利,MA)。(一种蛋白激酶)(Ser Anti-phospho-protein激酶B473年)和anti-Akt马伯买来Biovision(美国加利福尼亚州山景城)。anti-pleckstrin (p47)帕布从GeneTex购买(欧文、钙、美国)。Hybond-P聚偏二氟乙烯(PVDF)膜辣根过氧化物酶-(合)共轭驴anti-rabbit免疫球蛋白G(免疫球蛋白)羊anti-mouse免疫球蛋白买来Amersham(英国白金汉郡)。异硫氰酸荧光素(FITC)反CD42P (P-selectin)马伯从BioLegend购买(美国圣地亚哥,CA)。

2.2。合成(Ir (Cp )(L) Cl)的男朋友4(Ir-6)

10毫升的methanolic解决1 - (2-pyridyl) 3 - (4-dimethylaminophenyl)咪唑并[1 5]吡啶(L) (0.12 g、0.4毫米)(9],[Ir (Cp的解决方案 )(Cl)2]2(0.16克,0.2毫米)在10毫升甲醇添加一滴一滴地,和解决方案是在室温下搅拌3 h。随后,NH4男朋友4(200毫克,0.6毫米)被添加到解决方案,和解决方案慢慢改变颜色从淡黄色到橙色。24小时后,溶液蒸发,和获得的固体过滤。渣是用乙醚洗净(40毫升)和真空下干燥。所需的产品被二氯甲烷和正己烷重结晶为橙色微晶核。1H NMR (400 MHz,二甲亚砜(DMSO) d6)δ8.86 - -8.84 (d1 h, ),8.50 - -8.44 (米2 h), 8.21 - -8.18 (t1 h, ),8.01 - -7.99 (d2 h, ),7.59 - -7.49 (米2 h), 7.19 - -7.16 (t1 h, ),7.03 - -7.01 (d2 h, ),3.6 (年代15 h), 1.36 (年代,6小时);紫外可见(λ腹肌海里)(ε,米−1·厘米−1):400 (1447),304 (2576),242 (1468);质(m / z): 677.17 (M-BF4]+(图1(一))。

2.3。血小板聚集

台北医学大学的机构审查委员会(TMU-JIRB-N201612050)、台湾、批准这项研究和符合赫尔辛基宣言的指令。人类所有的志愿者提供知情同意参与这项研究。人类血小板悬浮液准备如前所述[10]。人类血液样本收集从成人志愿者没有采取任何药物或物质可能会影响测试的前至少14天收集样品;收集血液样本混合acid-citrate-dextrose解决方案。离心后,富含血小板血浆(PRP)补充了0.5 米铂族元素1和6.4国际单位/毫升肝素。Tyrode含3.5毫克/毫升BSA的解决方案是使用人类血小板准备洗的最后中止。最后一个Ca2 +浓度Tyrode的解决办法是1毫米。血小板聚集是由lumiaggregometer(佩顿Associates,斯卡伯勒、加拿大)如前所述[10]。血小板悬浮液(3.6×108细胞/毫升)preincubated与不同浓度的Ir-6或溶剂控制(0.1% DMSO) 3分钟前添加各种受体激动剂(即。胶原蛋白)。血小板聚集程度的计算和表示为一个百分比相对于控制(没有Ir-6)在光传输单位。ATP-release化验,20 L (luciferin-luciferase添加1分钟前的兴奋剂;的ATP释放与血小板释放的控制。

2.4。测量(Ca2 +]我动员

(Ca2 +]我浓度是决定使用Fura-2AM如前所述[10]。总之,柠檬酸盐全血在120×g离心10分钟,和上层的收集和孵化5 M Fura-2AM 1 h。人类血小板悬浮液准备如前一节所述。Fura-2AM-loaded血小板被清洗和preincubated Ir-6 CaCl在1毫米2和刺激胶原蛋白。Fura-2荧光测量使用荧光谱仪(日立FL分光光度计f - 4500,东京,日本)340年和380年的激发波长和发射波长510 nm。

2.5。检测乳酸脱氢酶(LDH)

检测LDH活性,洗净人类血小板(3.6×108细胞/毫升)preincubated 20 - 100 M Ir-6或溶剂控制(0.1% DMSO)为20分钟37°C。上层清液的整除(10µL)被放在一个富士Dri-Chem幻灯片LDH-PIII(富士山,东京,日本),和540海里的吸光度测定采用紫外可见分光光度计(uv - 160;日本岛津公司、日本)。LDH的最大价值(MAX)记录在用血小板。

2.6。血小板表面P-Selectin流量仪的分析表达式

这一分析,洗涤血小板悬浊液准备如前所述[8]。整除的血小板悬浮液(3.6×108细胞/毫升)与Ir-6 preincubated(10和20µ米)或溶剂控制(0.1% DMSO)和FITC-P-selectin (2µg / mL)为3分钟。胶原蛋白(1µg / mL)随后添加到引发血小板激活。fluorescein-labeled的悬浮液被化验血小板通过使用流式细胞分析仪(FAC扫描系统,正欲,圣何塞,CA,美国)。数据收集从50000年每实验组血小板和血小板的根据他们的特点,正交光散射配置文件。所有的实验都重复至少四次,以确保再现性。

2.7。免疫印迹

免疫印迹分析,洗涤血小板(1.2×109细胞/毫升)与Ir-6 preincubated(10和20µ米)或溶剂控制(0.1% DMSO) 3分钟,然后添加了胶原蛋白引发血小板激活。10分钟后,反应是通过添加EDTA停了下来,和由此产生的血小板resuspended在200年 L裂解缓冲。蛋白质(约80 g)分离通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page) 12%的凝胶。分离蛋白被转移到PVDF膜通过使用Bio-Rad半干转移单位(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。膜被阻塞Tris-buffered盐水渐变20 (TBST;10毫米Tris-base、100毫米氯化钠和0.01%渐变20)含5% BSA 1 h,然后被探测使用各种主要抗体。的膜随后被孵化HRP-conjugated anti-mouse免疫球蛋白或anti-rabbit免疫球蛋白(TBST稀释1:3000)1 h。增强化学发光系统被用来检测免疫反应性的乐队,和光学密度(OD)乐队的量化使用Bio-profil Biolight(版本V2000.01;Vilber Lourmat Marne-la-Vallee、法国)。

2.8。检测哦·自由基形成的血小板和芬顿反应的解决方案,电子自旋共振谱分析

电子自旋共振(ESR)谱(美国力量EMX ESR、Billerica MA)分析如前所述[11]。血小板悬液(3.6×108细胞/毫升)或(50芬顿反应的解决方案 M FeSO4H + 2毫米2O2)与0.1% DMSO溶液或Ir-6 preincubated(10和20 米)3分钟,有或没有的1 g / mL胶原蛋白。5分钟后,100年 M DMPO之前添加到悬浮液ESR谱分析。使用石英ESR谱信号记录扁平细胞为水设计解决方案。谱仪是在20 mW和9.78 GHz,扫描范围的100 G和接收机增益为5×104。调制振幅是1 G,时间常数是164 ms。每个样本扫描42年代,每个谱三扫描的总和。

2.9。老鼠尾出血时间测定

调查Ir-6是否有出血风险,出血时间测定进行了横断面的雄性ICR小鼠的尾巴。30分钟后,腹腔内Ir-6管理局(1或2毫克/公斤),老鼠的尾巴被削减在3毫米的距离。尾巴直接放置在管充满生理盐水在37°C测定出血时间,直到出血完全停止记录。动物实验是符合指南的护理和使用实验动物(第八版,2011)和获得批准的证词动物使用从台北医科大学(lac - 2016 - 0395),台湾。

2.10。统计分析

实验结果的平均值±标准误差表示为手段(S.E.M.),并且伴随着观测的数量( )。的值 指的是数量的实验,每个实验进行了使用不同的献血者。未配对学生的t以及用于确定差异控制的意义和实验老鼠。多个组之间的差异在其他实验评估通过方差分析(方差分析)。当方差分析显示显著差异当中唯一的手段,使用Student-Newman-Keuls组比较方法。在分析中, 值< 0.05被认为是具有统计学意义。使用SAS统计分析(9.2版本;SAS公司卡里,数控、美国)。

3所示。结果

3.1。Ir-6对血小板聚集的影响在人类血小板洗

如数据所示1 (b)和1 (c),Ir-6预处理(5 - 20 米)高度和concentration-dependently抑制胶原诱导人类血小板聚集在洗。为了应对120年µΜAA刺激,Ir-6逐渐抑制血小板的聚集即使在50 - 200 m .此外,在100 - 500 M, Ir-6表现出相对较弱的活动对0.01 U /毫升凝血酶引起的血小板聚集或1µΜU46619,前列腺素内过氧化物模拟;这一结果表明,Ir-6更强有力的活动对胶原诱导聚合t引起的其他受体激动剂AA、凝血酶和U46619(图1 (c))。用溶剂控制(0.1% DMSO)没有不幸的是影响血小板聚集。在随后的实验中,1 g / mL胶原蛋白作为受体激动剂用于调查的可能机制Ir-6抑制人类血小板激活。

3.2。Ir-6抑制ATP释放,相对(Ca2 +]我动员、和表面P-Selectin表达式

血小板激活是与颗粒的释放ATP和Ca等内容2 +和表面P-selectin表达式,从而导致强烈的血小板聚集。在目前的研究中,Ir-6(10和20µ1米)抑制ATP-release反应刺激 g / mL胶原蛋白(图2(一个))。胶原蛋白刺激(Ca2 +]我通过促进Ca的条目2 +进入胞液从两个资源;Ca2 +从细胞内释放商店和血小板穿过细胞膜进入。图2 (b)(一个)显示,没有1毫米CaCl对胶原蛋白的反应2。在这种情况下,大量钙预计将明显减少,因此任何变化(Ca2 +]我可能归因于放电从细胞内商店进入细胞质。预处理与il - 6(10和20 米)明显降低相对(Ca2 +]我动员在calcium-free Tyrode的解决方案(休息控制,26.5±4.3 nM;collagen-stimulated, 119.1±19.5 nM;10 M Ir-6, 67.3±7.3 nM;和20 M Ir-6, 25.8±7.4 nM; ),图2 (b),(A)和Tyrode的解决方案(休息控制,139.4±22.4 nM;collagen-stimulated, 626.8±102.6 nM;10 M Ir-6, 354.3±38.7 nM;和20 M Ir-6, 135.6±38.7 nM; ),图2 (b)1,(B)在血小板刺激 g / mL胶原蛋白。此外,在静止(休息)血小板,P-selectin坐落的内壁上α颗粒。血小板激活暴露的内墙颗粒细胞的外(12]。Ir-6治疗显著降低胶原诱导表面P-selectin表达式,证明了图的右侧面板中的统计数据2 (c)(休息控制,55.7±21.7;collagen-activated, 645.0±148.9;10 M Ir-6, 250.7±82.0;20 M Ir-6, 136.0±39.7; )。

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图2
Ir-6对ATP-release反应,相对(Ca2 +]我动员、和表面FITC-P-selectin表达人类血小板洗。血小板(3.6×108细胞/毫升)与溶剂preincubated控制(0.1% DMSO)或Ir-6(10和20µ米)。随后,胶原蛋白(1 g / mL)也添加到触发(a) ATP-release反应(非盟;任意单位相对(Ca)或(b)2 +]我动员(nM) calcium-free Tyrode的解决方案(一个)或Tyrode (B)的解决方案。(c)洗涤血小板(3.6×108/毫升)与溶剂preincubated控制(0.1% DMSO)或Ir-6(10和20µM)和FITC-P-selectin (2µg / mL) 3分钟,然后使用胶原蛋白刺激(1 g / mL)。相应的统计数据显示在右边的面板数据2(一个)- - - - - -2 (c)。提出了数据平均值±标准平均误差( )。 和 ,相比DMSO-treated组(a)或休息时,身体控制(b和c);# , # # ,和# # # ,相比之下,DMSO-treated组(b和c)。
3.3。Ir-6对循环的影响核苷酸形成和LDH释放人类血小板在洗

100年 腺苷酸环化酶抑制剂和10 M SQ22536 M ODQ、鸟苷酸环化酶抑制剂显著逆转抑制胶原诱导的血小板聚集由1 米铂族元素1或10 M NTG(图3(一个))。然而,无论是SQ22536还是ODQ显著逆转抑制胶原诱导的血小板聚集由20 M Ir-6(图3(一个)),这表明Ir-6-mediated抑制血小板聚集的机制不涉及环核苷酸合成的增强。此外,血小板的聚集曲线与100年preincubated M Ir-6 10分钟,随后洗两次Tyrode的解决方案没有显著不同于血小板preincubated与溶剂控制(0.1% DMSO)在同等条件下(图3 (c))。这一发现表明,Ir-6对血小板聚集的影响是可逆的,noncytotoxic。此外,LDH释放结果表明孵化血小板与Ir-6 20分钟(20、50和100 米)没有显著增加LDH展览活动或细胞毒性影响血小板(图3 (b)),证明Ir-6不影响血小板渗透率或诱导血小板细胞溶解。

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图3
Ir-6对环核苷酸形成的影响,LDH释放,人类血小板的细胞毒性。(一)洗涤血小板(3.6×108细胞/毫升)preincubated有1 M PGE1, 10 M NTG,或20µ100 M Ir-6有或没有 M SQ22536或10 M ODQ随后处理胶原蛋白(1 g / mL)诱导血小板聚集。(b)洗涤血小板(3.6×108细胞/毫升)与溶剂preincubated控制(0.1% DMSO)或与不同浓度的Ir-6(20、50和100µ米)为20分钟,10µL整除的上层清液沉积在富士Dri-Chem LDH-PIII滑动。(c)为其他实验中,洗涤血小板被preincubated与溶剂控制(0.1% DMSO)或Ir-6 (100 米)10分钟,随后洗两次Tyrode的解决方案。胶原蛋白(1 g / mL)被添加到引发血小板聚集。提出了数据平均值±标准平均误差( )。概要文件(a)和(c)代表四个独立的实验。
3.4。活动Ir-6调节PLCγ2-PKC信号和Akt激活

plc水解磷脂酰肌醇4,5-bisphosphate产生第二信使肌醇1,4,5-trisphosphate (IP3)和甘油二酯(DAG)。知识产权3触发相对(Ca2 +]我动员,而DAG激活PKC。PKC激活产生一种蛋白质,大约47 kDa的大小,主要是磷酸化(p47蛋白质;pleckstrin)和导致ATP-release反应(13]。如图4(一)、治疗10或20的血小板µIr-6没有显著抑制聚合诱导150 nM PDBu, PKC激活(图4(一)),这表明Ir-6并不直接破坏PKC激活。数据3(一个)和3 (b)说明了Ir-6在ATP释放的抑制效应和相对(Ca2 +]我动员引起胶原蛋白。因此,我们进一步研究了Ir-6对PLC的磷酸化的影响γ2-PKC信号级联。在10到20µM, Ir-6明显减少PLCγ2磷酸化以及PKC激活(pleckstrin磷酸化)collagen-stimulated血小板(数字4 (b)和4 (c))。Akt是丝氨酸/ threonine-specific蛋白激酶在不同的细胞过程中扮演着重要角色,如血小板激活,细胞增殖,细胞凋亡,细胞迁移14]。LY294002(一种蛋白激酶的抑制剂;10µ米)和Ir-6(10到20µ米)显著抑制胶原诱导一种蛋白激酶磷酸化(图4 (d)),展示了至关重要的作用的抑制一种蛋白激酶信号通路的Ir-6-mediated抑制血小板激活。

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图4
Ir-6对股价的影响γ2、PKC和Akt激活人类血小板。洗了血小板与溶剂preincubated控制(0.1% DMSO) LY294002 (10µ米),或者Ir-6(10或20µ胶原蛋白(1米)。随后, 克/毫升)或PDBu(150海里)被添加到触发(a)血小板聚集,(b)γ2磷酸化,(c) PKC激活(pleckstrin磷酸化),或(d) Akt激活。血小板收集,他们的亚细胞提取物进行分析来确定(b)的磷酸化PLC的水平γ2、(c) PKC和Akt (d)。提出了数据平均值±标准平均误差( )。 和 ,休息与控制;# 和# # # ,相比之下,DMSO-treated组。的概要文件(a)和(d,左面板)是代表四个独立的实验。
3.5。Ir-6对抑制p38 MAPK的影响,ERK2, JNK1磷酸化

几个MAPK信号分子的磷酸化途径进行评估调查Ir-6在血小板活化的抑制机理。在真核生物中,MAPKs (p38 MAPK、erk和物)控制的主要细胞反应和导致各种事件细胞增殖,迁移、分化和凋亡。兵、JNK1和p38 MAPK已确定在血小板15]。SB203580 (p38 MAPK的抑制剂;10µ米),PD98059 (ERK2的抑制剂;20µ米),SP600125 (JNK1的抑制剂;10µ米)显著抑制p38 MAPK(图5(一个)),ERK2(图5 (b)),JNK1(图5 (c)分别)磷酸化collagen-activated血小板。Ir-6降低浓度的方式这三个蛋白质的磷酸化。然而,10点µ米,Ir-6无意义的抑制p38 MAPK磷酸化(图5)。

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图5
抑制性的影响Ir-6 p38 MAPK的磷酸化,ERK2, JNK1人类血小板。洗涤血小板(1.2×109细胞/毫升)与溶剂preincubated控制(0.1% DMSO) SB203580 (10µPD98059(20米)µSP600125(10米)µ米),或者Ir-6(10或20µ米);随后,胶原蛋白(1 g / mL)被添加到引发血小板激活。血小板被收集,及其亚细胞提取物进行分析来确定的(a) p38 MAPK的磷酸化水平,ERK2 (b)和(c) JNK1。提出了数据平均值±标准平均误差( )。 , ,和 ,休息与控制;# # # 和# # # ,相比之下,DMSO-treated组。左面板的概要文件是代表四个独立的实验。
3.6。的角色哦·激进Ir-6-Mediated抑制血小板聚集

一个ESR信号e哦·自由基形成观察collagen-stimulated血小板悬浊液和芬顿反应的解决方案(无细胞系统;数据6(一)和6 (b))。一个典型的哦·信号(一个N=一个H= 14.8 G)和长期( )激进的被利用DMPO旋转陷阱,观察在collagen-stimulated血小板而不是在休息中发现血小板(图6(一)),曲线(A),治疗10或20 M Ir-6并未大幅减少哦信号在血小板悬浮液激活胶原蛋白和芬顿反应的解决方案(数据6(一)和6 (b)),这表明Ir-6-mediated抑制血小板激活可能不受自由基的形成。

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图6
监管活动Ir-6哦·形成血小板悬浮液或芬顿反应溶液和在实验小鼠出血时间测定。(一)洗涤血小板或(b) (a)的芬顿反应的解决方案是preincubated Tyrode休息(控制)的解决方案,(b) 0.1% DMSO, (C) 10µ20 M Ir-6或(D)µM Ir-6。胶原蛋白(1µg / mL)被添加到血小板悬浮液中描述的ESR实验材料和方法。概要文件(a)和(b)的代表四个独立的实验,和星号( )表示哦·形成。(c)老鼠尾巴被横切的出血时间30分钟后腹腔内政府的0.1% DMSO, 1.0毫克/公斤Ir-6,或2.0毫克/公斤Ir-6 (50 L)。提出了数据的平均值±标准错误的意思。 。 ,而DMSO溶液(0.1%)治疗组。
3.7。Ir-6对出血时间的影响

在老鼠的尾巴横断模型,30分钟后,出血时间明显延长小鼠治疗腹腔内2.0毫克/公斤Ir-6管理局(323.3±55.2年代; ),而不是那些处理1.0毫克/公斤(184.3±39.7年代; )与小鼠相比处理溶剂控制(0.1% DMSO-treated集团150.5±11.9年代; )(图6 (c))。每个鼠标监控是否有出血10分钟后出血停止。

4所示。讨论

血小板激活血栓事件上贡献了重要作用在癌症患者(16]。化疗的方法可能会增加这种效应,刺激血管血栓栓塞事件(vt)诱导血小板聚集,加重血管内皮损伤,导致血管毒性(17]。基于铂- (Pt)的化疗药物,顺铂被广泛用于治疗相关的静脉血栓栓塞的发生率高(18]。吉西他滨和Pt-based治疗血栓性和血管增加副作用(19,20.]。因此,研究目前专注于开发新的金属药物的抑制血小板活化治疗血管疾病,减少有毒副作用,和克服Pt阻力。值得注意的是,这项研究表明,除了其抗肿瘤活性,Ir-6,一个红外(III)导数,有力的抗血小板活性。

血小板坚持皮下基质蛋白(如胶原蛋白)改变血小板形状和导致颗粒释放的内容。胶原蛋白动员(Ca2 +]我使Ca磷酸化2 +/ calmodulin-dependent肌球蛋白轻链(20 kDa),参与分泌颗粒的内容,如5 -羟色胺和ATP (21),并激活血小板聚集。因此,抑制的程度(Ca2 +]我动员或ATP生产效能的评估是至关重要的抗血小板活性化合物。在目前的研究中,Ir-6抑制血小板聚集不同程度,取决于所使用的受体激动剂诱导聚合(胶原蛋白、U46619、AA,凝血酶),表明Ir-6并不作用于特定个人的受体,这些受体激动剂。因此,Ir-6可能发挥活动通过一个或多个常见的信号通路激活血小板。

胶原蛋白显著改变PLC激活血小板激活。PLC刺激导致的生产IP3和DAG。随后,DAG激活PKC因此诱发p47磷酸化(13]。PKC激活触发特定反应简化特定的上游信号的传输在个别细胞隔间。PLCγ家庭由同功酶PLCγ1、公司γ2;PLC)γ2参与collagen-dependent信号在血小板22]。Ir-6明显减少胶原诱导PLCγ2-PKC激活;然而,Ir-6没有对PKC激活产生直接影响,因为它没有干扰PDBu-induced血小板聚集。这一发现表明,Ir-6-mediated抑制血小板激活涉及到PLCγ2下游信号。这个结果也可以解释为什么Ir-6表现出更高的功效比抑制抑制胶原引起的血小板激活,引起其他受体激动剂。

通过细胞内途径由人类血小板激活抑制环腺苷酸(营)和环磷鸟苷(cGMP),因此这些核苷酸被认为是血小板激活的关键调节器(23]。环核苷酸抑制大部分的血小板反应和减少(Ca2 +]我水平提高Ca2 +吸收,从而抑制PLC和PKC激活(23]。因此,营地和cGMP协同抑制血小板激活。此外,无论是SQ22536还是ODQ显著逆转Ir-6-mediated抑制胶原诱导的血小板聚集。因此,不涉及Ir-6-mediated机制增强血小板的环核苷酸的合成。

Akt,下游效应器磷酸肌醇3-kinase (PI3K)据报道显示缺陷agonist-induced血小板活化时删除在老鼠身上,主张Akt规范化血小板活化;这种监管潜在后果在血栓形成(14,24]。因此,特定的一种蛋白激酶抑制剂的种类,如个人PI3K亚型,可能是有吸引力的抗凝治疗目标(14]。胞质磷脂酶一2(cPLA2)是一种引起的基质p38 MAPK活性受体激动剂如血管性血友病因子(vWF),凝血酶(25]。因此,p38 MAPK对cPLA至关重要2刺激以及AA版(26]。这个观察可以解释为什么Ir-6弱活动抑制p38 MAPK激活以及凝血酶或AA-stimulated血小板聚集。激活ERK也是一个重要的事件参与血小板聚集需要ATP释放之前,激活P2X1介导钙2 +涌入,从而提高肌球蛋白轻链磷酸化激酶(25]。JNK1,另一个最近发现MAPK在血小板;因此,它的激活和作用知之甚少。几个受体激动剂如凝血酶、vWF、胶原蛋白和ADP (23激活JNK1。此外,一项研究证实了增加出血时间,减少整合素αIIbβ3激活,在物和严重的颗粒分泌障碍−−/血小板(27]。因此,抑制物在血小板活化磷酸化可能起到至关重要的作用。与这些结果一致,目前的结果表明,Ir-6明显抑制胶原诱导JNK1磷酸化。

活性氧(过氧化氢)和自由基物种(即。,哦·)作为辅助信号参与血小板激活(28]。在当前的研究中,我们的ESR谱调查提供了直接证据证明Ir-6并不显著影响哦·形成血小板激活和芬顿反应的解决方案。延长止血血小板形成堵塞(出血时间)Ir-6-treated实验中观察到的老鼠。出血时间的观察结果表明,出血时间的延长人类不预测出血或手术出血的风险。这些结果问题背后的基本原理的使用抗血小板的临床评价化合物(出血时间29日]。

5。结论

总之,目前的研究结果显示,Ir-6,小说铱(III)化合物,抑制血小板活化,防止信号分子,如PLCγ2-PKC,随后会抑制一种蛋白激酶和JNK1激活。这些变化抑制过程与ATP释放有关,(Ca2 +]我动员、和表面P-selectin表达式,最终抑制血小板聚集。然而,进一步的研究需要调查其他身份不明的机制参与Ir-6-mediated抑制血小板激活。然而,Ir-6可以作为癌症治疗的化学治疗剂。此外,它可以作为抗血小板治疗血栓栓塞疾病或破坏血小板和肿瘤细胞之间的相互作用,导致肿瘤细胞生长和发展。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Ren-Shi害羞的,来说Themmila Khamrang, Joen-Rong许凤同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作是由科技部支持台湾(大多数b 104 - 2622 - 038 - 003,大多数104 - 2320 - b - 038 - 045 - my2,大多数106 - 2320 - b - 038 - 012),国泰综合医院(CGH-MR-A106020),国泰航空通用Hospital-Taipei医科大学(107 cgh-tmu-07),和印度大学拨款委员会(mrp -大-化学- 2013 - 5144;69/2014 f。10-11/12UGC)。