牛血清白蛋白与利塞膦酸钠相互作用的多元光谱和分子对接技术的生物物理研究

摘要

采用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、紫外-可见光谱(UV-Vis)、荧光光谱(emission and synchronous)、圆二色光谱(CD)和计算(molecular docking)技术，分别在28,297和28,297，研究了牛血清白蛋白(BSA)与利塞膦酸钠盐(RSN)的结合作用。305k温度，pH为7.40的生理缓冲液。将CD光谱和曲线拟合方法观察到的牛血清白蛋白的构象和二级结构变化应用于傅里叶自反褶积。紫外-可见光谱证实了BSA-RSN络合物的形成。从Stern-Volmer和修正Stern-Volmer方程验证了RSN对BSA的静态淬火类型。10阶的绑定常数⁵证实BSA与RSN之间存在强的结合相互作用。同步荧光显示色氨酸微环境发生了改变，而牛血清白蛋白的酪氨酸微环境没有发生改变;此外，根据福斯特的非辐射能量传递理论，确定了BSA色氨酸与RSN之间的距离。BSA和RSN之间的相互作用主要是由氢键和范德华力引起的，这个过程是放热自发的，是通过van ' t Hoff方程实现的。这种相互作用受生物活性铁的存在影响^2＋、镍^2＋、钙^2＋、镁^2＋和CD.^2＋也被研究过。通过分子对接分析验证了BSA与RSN相互作用的子域IIIA。

1.介绍

老年人最常见的问题是骨质疏松症和佩吉特氏病。1，2］.骨质疏松症是一种当骨骼虚弱时导致骨骼断裂的疾病。与男性相比，这种疾病主要影响女性。在2010年的调查中，欧盟约有2200万女性和550万男性，美国有800万女性和100万男性，亚洲人是最危险的人群[3.，4］.另一个骨骼相关的问题是Paget疾病，影响一种或多种骨骼，但不完全骨骼到细胞重塑和剥离，如头骨，股骨，骨盆和椎骨[5］.这种疾病，在罕见的情况下，转化为严重的并发症称为恶性骨癌。约1.5至8.0%的英国后裔[6患有佩吉特氏病。佩吉特氏病在男性和女性中的比例为3:2 [7］.用于治疗和预防骨质疏松症和佩吉特病的著名药物是利塞膦酸钠盐，称为利塞膦酸钠(图)1(一))是一种双膦酸盐，其IUPAC名称为羟基-(1-羟基-1-磷酸-2-吡啶-3-乙基)膦酸钠。此药作为即时缓释片口服[8］.它有常见的副作用，如背痛、胃灼热、腹泻和消化不良[9］.

近年来，研究人员越来越关注药物与生物大分子之间的相互作用[10.，11.］.血清白蛋白是脊椎动物血液中最丰富的血浆蛋白。它在许多内源性和外源性配体(药物、脂肪酸、药物等)的运输、分配和生物学过程中发挥重要作用[12.］.药物在血浆中以游离和结合的形式与血清白蛋白的浓度提供了对所期望疾病的作用机制的信息。因此，通过蛋白质-药物相互作用研究，可以发现药物明显分布和消除的速率。因此，本研究在药物设计的医学科学和制药工业中的应用，以改善药物传递过程。

本研究选择牛血清白蛋白(BSA)作为人血清白蛋白(HSA)的替代物，其结构相似性达88%，易于获得，成本低。BSA的心形结构如图所示1 (b)其中由583个氨基酸组成：整个结构分为3个同源域（I，II和III），每个结构域再次被细分为A和B，具有两个色氨酸（TRP134和TRP213）和20 TYR的疏水包（酪氨酸）残留物。表面上存在TRP134和TRP213并埋在BSA的疏水区域内[13.］.

蛋白质的生物学特性通过其结构和功能上的金属离子结合而得到很好的表征。在许多金属蛋白和酶中，金属离子分别被紧密地结合和松散地结合，以使其稳定或储存[14.- - - - - -16.］.金属离子的电荷半径与离子半径之比称为其极化功率，这是决定金属离子与蛋白质络合功率的主要因素。因此，随着金属离子极化率的增加，牛血清白蛋白与金属离子的相互作用增强，金属离子在牛血清白蛋白中产生高密度正电荷。金属选择、配位数和几何形状是BSA中金属结合位点的主要参数。金属与牛血清白蛋白的配位通常是通过羧酸(结合方向为syn孤对)基团、硫基团、主链上的羰基氧、酪氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、水分子和咪唑侧链(氮上的孤对)。含有未配对电子的金属离子更容易与牛血清白蛋白的原子核相互作用。牛血清白蛋白上的天然电荷和构象螺旋偶极子在金属结合中起重要作用。软金属与含硫的蛋氨酸和半胱氨酸残基结合，而硬金属定性地与亲水氨基酸残基结合，壳被大壳的疏水(含碳)基团包围，即高疏水性中心的差异[17.- - - - - -19.］.

金属离子是所有活的制度，因为它们可能会影响血清白蛋白与药物之间的结合相互作用十分必要的。这还研究了当前工作。洞察BSA和RSN之间的相互作用的生物物理研究通过采用几种光谱（发射荧光，同步荧光，FT-IR，CD，和UV-VIS）和分子对接方法调查。每个实验进行了性能测试结果及其推论在下面讨论。

2.实验

2．1.试剂和溶液的制备

牛血清白蛋白(BSA:产品编号A1933-1G，色谱纯化，≥98%)，利塞膦酸钠(RSN:产品编号SML0650-50MG, NMR，≥97%)，六水硫酸铁(II)铵(Fe^2＋:产品编号203505-5G，微量金属基，99.997%)，硫酸镍(II)铵(Ni^2＋：产品编号574988-25G，痕量金属基础，99.999％），碳酸钙（CA.^2＋:产品编号202932-5G，微量金属基，≥99.995%)，六水氯化镁(Mg^2＋:产品编号255777-5G，微量金属基，99.995%)，水合硫酸镉(Cd^2＋:产品编号202924-5G，微量金属基，≥99.995%)，华法林(产品编号A2250-10G，分析标准)，布洛芬(产品编号I4883-1G，气相色谱，≥98%)，洋地黄毒素(产品编号D5878-250MG, HPLC，≥92%)从Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里，美国)获得。每次实验均使用pH为7.40的Tris缓冲液(0.05 M Tris和0.15 M NaCl加少量HCl)和双蒸馏水制备所有溶液。牛血清白蛋白原液的浓度为是准备。RSN、华法林、布洛芬、洋地黄毒素、金属离子(铁^2＋、镍^2＋、钙^2＋、镁^2＋和CD.^2＋）溶液以浓度的浓度制备 。对于紫外可见、发射荧光和同步荧光光谱测量，保持BSA浓度不变(）通过改变0.5至5.5的RSN的浓度（)增加 。所有仪器光谱都经过缓冲背景校正。

２.２.方法和工具

2.2.1。UV可见光谱

使用UV可见分光光度计（Beckman Coulter，Du 730，Life Sciences，Brea，Brea，CA 92821，USA）采用200至300nm的波长范围为200至300nm的波长范围为200至300nm的吸收光谱。该仪器分别配备了氘和钨灯，分别用于UV和可见光。石英比皿与10mm的路径长度一起使用。

2.2.2。荧光光谱法

(1)仪器。All the fluorescence spectral measurements were carried out on fluorescence spectrophotometer (F-4600, Hitachi Model, Tokyo, Japan) with 150W Xenon lamp and the excitation and emission slits were kept at 10 nm.

(2)内滤效果。在一个特定的波长（发射或激发）明显减少发射量子产率的辐射出射结果的分子经受重吸收被称为内滤效应。的excitation (295 nm) and emission (∼340 nm) wavelengths of BSA were overlapped with the absorption spectrum of RSN. Therefore, (1)，从所有BSA荧光信号中减去RSN的荧光强度，得到BSA所需的荧光信号: 在哪里和是RSN激发和波长的发射吸光度分别与和分别为校正后的BSA荧光强度和观测到的BSA荧光强度。

(3)荧光发射。记录了在三种不同温度(289、297和305 K)下的荧光发射光谱。采用外循环水浴保持所需温度。激发波长为295 nm，发射波长为290 ~ 420 nm。

（4）同步荧光。通过设置（)在15和60 nm对应牛血清白蛋白的Tyr和Trp，实现了同步光谱测量。扫描波长240 ~ 320 nm，温度297 K, pH 7.40。

2.2.3。荧光共振能量转移(FRET)

RSN和BSA在各浓度下的紫外-可见吸收光谱和发射荧光光谱记录在295-425 nm波长范围内。将两个光谱重叠，应用Forster无辐射能量转移理论计算BSA的Trp134/Trp213与RSN之间的距离。

2.2.4。位点标记存在时对结合位点的确认

Warfarin，布洛芬和Digitoxin分别是用于研究竞争性结合实验的位点I，II和III的三个站点标记。通过在290-420nm处调节波长来进行位点标记存在下的BSA-RSN复合物的荧光实验，其中通过保持at indabled的BSA和位点标记的浓度不变地进行 ，RSN的浓度从来在297 K和pH 7.40。

2.2.5。铁的影响^2＋、镍^2＋、钙^2＋、镁^2＋和CD.^2＋BSA-RSN结合的离子

Fe的作用^2＋、镍^2＋、钙^2＋、镁^2＋和CD.^2＋通过保持BSA和金属离子浓度恒定为，记录离子存在下BSA- rsn体系的荧光光谱，分析离子对BSA- rsn体系结合常数的影响随着RSN的浓度增加来在297 K和pH 7.40的波长范围290-420 nm。

2.2.6款。傅立叶变换红外光谱

(1)仪器。所有的FT-IR光谱测量都是在FT-IR光谱仪上进行的(Spectrum Two, PerkinElmer, Waltham, MA 02451, USA)。该仪器配备了分束器、探测器和ATR(锗衰减全反射)，分别作为OptKBr、氘化三甘氨酸硫酸盐(MIRTGS)和MIRacle Diamond S2PE附件，扫描约90次，分辨率为4厘米⁻¹。

(2) BSA-RSN相互作用构象的变化。在297 K和pH 7.4条件下，保持BSA和RSN的浓度不变(）.除buffer background外，通过校正buffer + (RSN-free form) background得到BSA与RSN的结合形式。

(3) RSN对BSA二级结构的改变。将自反褶积二阶导数增强的曲线拟合分析应用于酰胺I波段(1700-1600 cm)⁻¹)的FT-IR谱图，其中重叠的峰用单峰表征，每个单峰对应于RSN相互作用后的BSA二级结构。

2.2.7。分子对接

使用蛋白数据库(PDB)下载BSA晶体结构，PDB ID: 4F5S (https://www.rcsb.org/structure/4F5S）.进一步采用Swiss-Pdb Viewer 4.1.0软件对BSA施加GROMOS96 43B1力场，使能量最小化到非常低的程度。利塞膦酸钠(RSN)的结构由PubChem公司用CID 4194514 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/4194514）.利用Marvin View 5.8.1实现RSN的能量最小化。现在，BSA和RSN已经准备好进行分子对接。利用Autodock工具、Autogrid 4.2和Autodock 4.2软件研究BSA-RSN结合相互作用的分子对接[20.］.通过保留a链去除BSA中的B链、剩余原子、杂原子和水分子，然后加入极性氢和部分科尔曼电荷:合并非极性氢得到BSA。沿着尺寸为60 × 60 × 60的网格箱X，Y,Zaxes with grid spacing 0.375 Å was adjusted. Then, the grid centered coordinates for site I (IIA), site II (IIIA), and site III (IB) were positioned at (−4.795, 30.487, and 101.007), (10.906, 16.276, and 119.720), and (19.857, 33.531, and 97.915), respectively, to analyze the molecular docking separately for each binding sites after interaction of BSA with RSN. The docking was run for all the three binding sites independently by running 90 times. After this process, the output was estimated using Lamarckian genetic algorithm (LGA) with maximum of 2,500,000 energy evaluations, 27,000 generations by assigning random translations, orientations, and 9 torsions to populations of 150 individuals. The obtained results were figured out by Biovia Discovery Studio 2016.

2.2.8。圆二色性（CD）频谱测量

采用J-815圆二色偏振分光光度计(Jasco international Co.， Ltd, Tokyo, Japan)获得了自由BSA和与RSN结合的BSA的CD光谱。在细胞长度约为10 mm、扫描速度约为1.00 nm、扫描速度约为100 nm/min的条件下，在297 K时，在200 ~ 240 nm范围内记录了CD光谱。基线校正也进行，同时记录CD光谱的缓冲液减pH 7.40。BSA与RSN浓度之比保持为1:20 (来）.利用BeStSel软件在线服务器(bestsell .elte.hu/)，找出与RSN交互前后BSA的二级结构。

2.2.9。统计分析和曲线绘制

所有实验均测量三次，以均数±标准差(SD)表示。使用OriginPro 9.0 64位软件(OriginLab Corp.， Northampton, MA)和Microsoft Excel对获得的结果进行检查和数据评估。

3.结果与讨论

３．１．含与不含RSN的牛血清白蛋白的紫外-可见吸收

通过UV-Vis光谱测量有效地研究了与RSN的相互作用后BSA的构象和复合物形成的变化。具有不同浓度RSN的BSA的UV-Vis吸收光谱（图2)说明BSA的吸收强度随RSN浓度的增加而增加，证实了BSA与RSN之间的络合物的形成。此外，还有两个红移3 nm的吸收峰:在220 nm处的吸收峰较强，对应于BSA结构的主链;在280 nm处的吸收峰较弱，对应于BSA结构的主链酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)残基的转变，因为它们属于芳香族氨基酸[21］.综上所述，RSN与BSA相互作用，这种相互作用通过改变BSA的构象而影响Tyr、Trp、Phe的微环境。

３．２．荧光测量

数字3.显示了随着溶液中RSN浓度的增加，牛血清白蛋白的荧光发射光谱。从图中可以明显看出3.随着RSN浓度的增加，BSA的荧光强度降低，表明RSN与BSA结合。因此，BSA被RSN淬灭。由于酪氨酸和色氨酸是两种芳香族氨基酸，它们负责荧光发射。在本研究中，利塞膦酸与BSA相互作用后，在308 nm和335 nm处分别出现了酪氨酸和色氨酸的两个发射峰，色氨酸没有酪氨酸的发射峰有轻微的蓝移(3 nm)。这种光谱变化表明色氨酸残基周围微环境的变化。值得注意的是，激发发生在295 nm，这对应于色氨酸而不是酪氨酸(280 nm)。因此，只有色氨酸参与了相互作用[22］.

荧光猝灭，分子重排，激发态反应，能量转移过程在分子水平相互作用的后果。此外，荧光强度的死亡被称为荧光猝灭。有两种类型的淬火机制：动态和静态。这两个由温度猝灭常数的依赖性不同。基态复合物的形成确定了静态猝灭;分子在溶液中扩散定义动态淬火，其中，与所述温度增加为动态猝灭并且反之亦然为静态猝灭淬火常数增加。传统的Stern-Volmer方程（2)来检验淬火机理的类型[23］. 在哪里和分别为BSA和BSA- rsn结合形式的荧光强度;和（）[24]分别为生物聚合物的RSN浓度和荧光寿命;和和分别为Stern-Volmer淬火常数和淬火速率常数。数字4(一)表示Stern-Volmer图(与），它给了作为斜率的值是通过使用(3.）.这些都列在表格中1在不同的温度下。表格1给出的信息是和值随温度升高而减小。除此之外，动态淬火的值为 ，但在目前的研究中，它们是相同的因此，这些结果证实了RSN对牛血清白蛋白的淬火是通过静态机制进行的。通过计算有效静态猝灭常数()和荧光团的可达部分()，使用以下修正Stern-Volmer方程(4）[25]：

数字4 (b)表示修改后的Stern-Volmer图，其中截距和斜率为和 ，分别。表格1表示所获得的值随温度升高而降低值。这证实了RSN是通过静态猝灭机制猝灭BSA的。

3．3.RSN与BSA的绑定参数

RSN与BSA结合的亲和力可通过计算其结合常数(）和绑定网站的数量（)，使用下列公式[26]：

的情节与给出一条斜率为截距等于在不同温度下(289、297和305 K)，如图所示4 (c)和它们的值列在表2。后天值随着温度的升高而降低，并且在10级⁵，并确认BSA与RSN之间存在强结合，进一步证实了静态猝灭机制。的值大约等于1，表示只有一个RSN结合于BSA。

3.4。BSA-RSN复合稳定的热力学和力

通过确定热力学参数来实现的蛋白质和小分子之间的非共价相互作用，焓变为焓（），和熵（）主要构成静电力，氢键，范德华力和疏水力。和通过下面的面包车“T Hoff方程（最好是相关6）[27]： 在哪里 ， ，和是气体常数，温度和计算的结合常数。价值和通过使用的曲线的斜率和截距计算对的插图4 (c)。从表格2，显然得到的负值和模拟范德华力和氢键，这是形成BSA-RSN复合物的主要结合力[28］.然后利用这些值来估计Gibb的自由能，由下式连接:

总结值在表2为负，表示自发放热过程。因为小于 ，吉布斯自由能通常是熵驱动。因此，相对于范德华力结合到BSA的RSN支配氢键。

3．5．同步荧光分析

通过同步荧光光谱测量中的同步扫描激发和发射单色仪，可以分析Tyr和Trp残基的微环境变化。Tyr和Trp残基微环境极性的变化是通过移位来实现的 ：红移表示极性增大/疏水性减小，蓝移表示极性减小/疏水性增大[21］.

不同浓度RSN的牛血清白蛋白的同步荧光光谱= 15和60 nm对Tyr和Trp残基的反应如图所示5。Tyr没有观测到光谱位移(图)5(一个))，但Trp的特征红移约为3 nm(图图5（b））.由此可见，色氨酸的微环境发生在其暴露于极地环境较多的地方。

3.6。BSA和RSN之间的能量传递

在没有光子发射的情况下，从供体到受体的激发态分子的激发能转移被用来确定蛋白质中配体-色氨酸的距离。根据Forster的非辐射能量转移理论，施主的荧光发射光谱和受主的紫外-可见吸收光谱应该重合在1 ~ 10 nm的距离内。能量转移效率()可以写成 在哪里临界距离是什么时候是50％，而且为BSA和RSN偶极中心之间的平均距离。然后,（厘米）可通过[来表示23］ 在哪里为偶极子的空间取向因子，是BSA的荧光量子产量，是介质的折射率，和为BSA荧光发射光谱与RSN吸收光谱的重叠积分(图6）.的价值可由(10.)= 295 - 425 nm: 在哪里和BSA在波长处的荧光强度是多少来（它没有单位）和在波长的RSN的摩尔吸光系数是 。如果是BSA，= 2/3,= 1.336,= 0.118。得到的结果为= 1.19 × 10⁻¹⁴厘米^3.·L·摩尔⁻¹， = 70.44%,r = 0.267 Å, and= 0.252。由较大的值进一步证实了RSN对BSA的静态淬火与…相比 。BSA只有两个色氨酸残基，Trp134和Trp213，主要负责其荧光。因此，FRET工具允许我们确定Trp134/Trp-213与结合RSN之间的距离。

3.7。竞争性结合测定值

通过竞争性结合测量来确定RSN在BSA中的最佳结合位点。三个结合位点I、II、III分别对应子域IIA、IIIA、IB。华法林、布洛芬和洋地黄毒素分别与I、II和III位点结合[29］.BSA-RSN复合物在所有站点探针存在的情况下计算的绑定常数值(5)(图7(一))和值列在表中3.。从表格3.，据了解华法林和洋地黄毒素对BSA-RSN的结合没有影响，而布洛芬有显著的作用，获得的结合常数值差异较大。因此，该结果提示BSA位点II (IIIA)与RSN主要结合。分子对接研究进一步证实了结合位点。

3.8。金属离子对BSA-RSN影响绑定

人体的许多化学和生物过程是通过与蛋白质相互作用的金属离子介导的。铁存在和不存在时BSA与RSN相互作用的荧光数据^2＋、镍^2＋、钙^2＋、镁^2＋和CD.^2＋离子在297 K处使用(5）.所得值如表所示3.其曲线图如图所示7 (b)。从表格3.，可以注意到，铁^2＋、钙^2＋,毫克^2＋离子降低了BSA与RSN和Ni之间的结合^2＋和Cd^2＋增加BSA和RSN之间的结合。倪^2＋和Cd^2＋金属离子-RSN配合物通过金属离子桥与BSA相互作用，提高了RSN与BSA的结合亲和力。因此，RSN仍然与BSA有更多的相互作用，这提高了RSN的有效性[30.］.在金属离子存在下，结合常数降低可能是由于离子与RSN之间的竞争，也可能是由于BSA构象的改变。因此，RSN一进入血液，在Fe存在的情况下，与BSA相互作用后立即排出^2＋、钙^2＋,毫克^2＋离子。所以，在血液RSN的短时间内不会导致所需的治疗效果固化。因此，需要更多的剂量。

3.9。FT-IR法测定牛血清白蛋白构象的变化

该蛋白表现出许多FT-IR谱带，其中酰胺谱带给予肽键振动。有两个酰胺带，I和II，象征着在1700-1600厘米处振动的特征构象变化⁻¹(C=O拉伸)和1600-1500厘米⁻¹(C-N组合拉伸和N-H组合弯曲)。数字8为RSN存在和不存在时BSA的FT-IR光谱，其峰位如表所示4。从图中可以看出光谱线的变化8（a）和8（b），提示BSA与RSN形成复合物并发生构象变化。

3.10。BSA二级结构检查

酰胺I带分为两部分，可以进一步分析牛血清白蛋白的二级结构β表,随机线圈,α螺旋,β转,β对应于1615-1637、1648-1648、1649-1660、1660-1680和1680-1692厘米处的振动⁻¹分别为(31］.数字9表明，对BSA-RSN相互作用，采用二阶导数分辨率提高的曲线拟合方法对酰胺I带进行自反褶积，将BSA与RSN相互作用后的二级结构构象变化列于表中5。峰位置和酰胺I带形状的改变，揭示了BSA通过修饰后的BSA与RSN的二级结构相互作用。

3.11。分子对接分析

分子对接测量进一步证实了BSA-RSN配合物荧光研究中的位点标记实验、热力学计算和相互作用类型，提供了相互作用研究的所有主要信息。BSA配体结合位点I (IIA)、II (IIIA)、III (IB)分别与RSN对接。通过均方根偏差(RMSD)对3个结合位点I、II和III进行聚类分析，得到聚类模式(62、89和35)，结合能分别为−25.03、−30.58和−22.47 kJ·mol⁻¹。从结合能最低和簇模式最大来看，与RSN相互作用后，BSA的II位点(IIIA)比其他两个位点结合得更好。数字10.表示RSN周围氨基酸明显可见的每个位点的对接结果。此外，所有结合位点的相互作用及其距离总结在表中6。此外，还对II位点(IIIA)的结果进行了进一步分析。表格7代表II (IIIA)场地的前5个理想能量排序结果及其值 ， ， ，和是束缚自由能;分子间相互作用能;范德华能、氢键能和脱溶剂自由能之和;和静电能量。RSN包围的位点II中50%以上的氨基酸残基属于极性和离子型。这一点从Table已经很明显了7，明显比 ，这说明氢键和范德华力在RSN和BSA之间的络合物形成中起着至关重要的作用，这与理论计算得到的热力学结果一致。

3.12。圆形二色（CD）光谱分析

圆形二色性（CD）光谱测量是在与小分子或配体相互作用时研究蛋白质的构象修饰非常有效的工具。BSA的CD光谱在没有和存在RSN的情况下（如图所示）11.）have two distinctive negative absorption bands at 208 nm (过渡)和222 nm (过渡）对应于肽键的-螺旋[32］.这一点可以从图中看出11.在不改变带最大值的情况下，与RSN相互作用后，自由BSA的两个负带强度降低，诱导BSA的构象随RSN的减小而变化螺旋的内容。计算得到BSA与RSN相互作用前后的二级结构如表所示8。二级结构的内容(α螺旋,β- 链反平行，并与RSN的相互作用后BSA的转）降低。但是，二级结构的含量（无规线圈和β与RSN相互作用后，BSA的-片平行)增加。说明与RSN相互作用后，BSA的多肽链矩阵发生了改变。

4。结论

在本作工作中，通过在生理pH 7.40的多光谱和分子对接方法彻底研究BSA和RSN之间的相互作用。RSN通过静态淬火机制淬火HSA。通过氢键和范德华力稳定形成的HSA-RSN络合物。HSA-RSN系统的获得绑定常量值是订单10⁵说明HSA与RSN之间存在强结合。对于HSA-RSN-Fe^2＋，HSA-RSN-CA^2＋, HSA-RSN-Mg^2＋体系中，结合常数降低。但对于HSA-RSN-Cd^2＋和HSA-RSN-Cd^2＋系统，结合常数增加。IIIA的亚域IIIA是Site II，是BSA的主要绑定部位，用于RSN。还实现了BSA和RSN的TRP134 / TRP213之间的距离。在与RSN的相互作用之后修改了BSA的构象和二级结构。这些类型的研究有助于了解RSN的新陈代谢，药效学和药代动力学。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

M. Manjushree非常感谢大学资助委员会-基础科学研究(UGC-BSR)为科学领域的优秀学生提供奖学金，Mysore大学的Vijnana Bhavan卓越研究所(IOE)提供仪器设备，以及钦奈的CSIR-CLRI-CATERS提供CD光谱测量。

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