形成的银制备DNA模板包含Ag) (I)介导的碱基对

文摘

一系列的DNA双股链含有不同数量的银(I)介导的碱基对涉及人工碱基咪唑或2-methylimidazole申请DNA模板的生成银纳米束。原始Ag) (I)含有核酸以及由此产生的发光机制和纳米粒子的特点通过UV / Vis光谱学、圆二色性(CD)光谱,荧光光谱、透射电子显微镜(TEM)。结果显示,首次metal-mediated碱基对可以用于金属制备的模板化增长。

1。介绍

金属纳米束是一个局部的研究领域由于其巨大的适用性(1,2]。在过去的几年中,使用dna模板制备了大量的兴趣(3,4]。根据实验条件,包括选择适当的寡核苷酸序列,银制备不同大小(AgNCs)与不同的物理性质(因此)可以获得5]。甚至集群Ag一样小₃或Ag)₂已经合成了(6]。一般来说,光学性质AgNCs似乎主要取决于集群规模,尽管他们的交互与DNA强烈影响这些属性(5]。通过选择特定的dna模板合成的寡核苷酸序列,可以获得不同的光学性质(7- - - - - -9]。第一次申请dna模板AgNCs已报告,也包括,例如,对爆炸物的检测[10]。模板合成的寡核苷酸序列用于AgNCs通常包含大量的胞嘧啶残留,可能由于这个规范的亲和力增加nucleobase Ag) (I) [11]。

在过去的十年中,metal-mediated碱基对的使用作为一个通用的方法,建立了特有的金属功能引入核酸(12- - - - - -16]。在这些碱基对,天然碱基(由氢键)正式取代人工的(由协调债券中心金属离子)。Ag) (I)介导的碱基对代表类别的著名小说类型的碱基配对。几Ag) (I)介导的碱基对组成完全自然的基地是已知的,即cytosine-Ag (I)胞嘧啶(17- - - - - -19),cytosine-Ag (I)腺嘌呤(20.],cytosine-Ag (I)胸腺嘧啶(21),给了一个可能的理由使用上述趋势cytosine-rich AgNCs模板合成的寡核苷酸。此外,各种各样的Ag) (I)和人工核苷介导碱基对已报告,例如,1-deazaadenine-Ag (I)胸腺嘧啶(22),pyridine-Ag (I)吡啶(23),和碱基对purine-derived配体(24,25]。即使是双核的碱基对是已知的(26- - - - - -31日]。最著名和最佳调查人工Ag) (I)介导的碱基对含有咪唑核苷(计划1)[32- - - - - -37]。

就像通过一个实验性的核磁共振显示解决方案结构及其后续细化QM / MM方法(33,34],imidazole-Ag (I)咪唑(Im-Ag-Im)碱基对很好地符合常规B-DNA双没有明显扭曲了核酸骨架。此外,咪唑的亲和力:咪唑mispair Ag) (I)的离子是10倍高于胞嘧啶:胞嘧啶mispair [37]。因此,我们着手调查Im-Ag-Im碱基对的使用dna模板的生成AgNCs。

2。材料和方法

根据文学人工核苷合成过程(33,35]。Phosphoramidites规范核苷是购自格伦的研究。寡核苷酸合成和纯化进行了如前所报道(26]。基于他们的吸光度的寡核苷酸浓度测定。人工核苷,摩尔消光系数厘米²更易⁻¹是使用。脱盐寡核苷酸的特点是MALDI-TOF质谱(ODN1:计算的。[M + H)⁺:6498 Da,发现:6498 Da;ODN2:计算的。[M + H)⁺:6464 Da,发现:6465 Da;ODN3:计算的。[M + H)⁺:6744 Da,发现:6745 Da;ODN4:计算的。[M + H)⁺:6710 Da,发现:6712 Da;ODN5:计算的。[M + H)⁺:6554 Da,发现:6555 Da;ODN6:计算的。[M + H)⁺:6520 Da,发现:6521 Da;ODN7:计算的。[M + H)⁺:6814 Da,发现:6814 Da;ODN8:计算的。[M + H)⁺:6780 Da,发现:6780 Da;ODN9:计算的。[M + H)⁺:5514 Da,发现:5512 Da;ODN10:计算的。[M + H)⁺:5481 Da,发现:5477 Da)。第四MALDI-TOF质量光谱被记录在一个力量反射仪器使用3-hydroxypicolinic酸/柠檬酸铵矩阵。与温度有关的紫外线测量进行紫外光谱仪卡里100生物仪器。紫外线融化曲线记录使用解决方案包含从10到80°C 2μNaClO寡核苷酸复式,150毫米₄、5毫米拖把(pH值6.8)和适量的AgNO₃加热/冷却率1°C的分钟⁻¹和一个数据间隔0.5°C。吸光度是标准化的根据在260纳米。融化温度测定的一阶导数极大值的熔化曲线。减少metal-mediated碱基对进行的环境温度通过添加NaBH刚做好的水溶液₄解决方案包含40μNaClO寡核苷酸双工(150毫米₄,一个相当于AgNO₃,5毫米拖把(pH值6.8))之前被加热到65°C,然后冷却至10°C 1°C的速度最小⁻¹。在双工V和nucleic-acid-free参考测量,160年μM AgNO₃在相同的水缓冲。UV / Vis光谱减少解决方案记录在Nanodrop 2000 c的乐器。他们规范化对路径长度(假设1厘米厘米²μ摩尔⁻¹对寡核苷酸工器我- - - - - -四世和厘米²μ摩尔⁻¹对双V)和平滑。18 nucleic-acid-free解决方案,一个比例因子(类似于工器的计算我,三世,V与相同的Ag) (I)浓度nucleic-acid-free)应用的解决方案。CD光谱被记录在10°C JASCO j - 815分光偏振计,和一个手动基线校正应用。TEM测量进行了天秤座200菲TEM(蔡司)配备了场发射枪操作在200千伏,列能量过滤器,Noran能量色散x射线(EDX)探测器和Gatan US4000 CCD。常规透射电镜数据记录使用一个能量过滤器窗口大小的30 eV对称零损失。TEM样品得到用Cu-grids多洞的碳膜由回转的网格解决方案。稳态发射光谱记录从PicoQuant FluoTime300光谱仪配备了300 W ozone-free氙灯(250 - 900海里),一个激发单色仪(Czerny-Turner 2.7 nm毫米⁻¹分散,凹槽1200毫米⁻¹,开辟300海里),两个发射单色器(Czerny-Turner,选择光栅开辟与2.7 nm毫米500海里⁻¹色散和凹槽1200毫米⁻¹,或者开辟与5.4 nm毫米1250海里⁻¹色散和凹槽600毫米⁻¹40(交通时间)和PMA混合传播应用< 120 ps, 300 - 720 nm)。发射光谱修正了源强度(灯和光栅)标准校正曲线。

3所示。结果与讨论

3.1。描述的寡核苷酸的Ag)(我)约束力的行为

研究了五个不同的核酸工器对他们的能力作为模板AgNCs的形成。表1概述的序列。工器我和三世包括四个指定Ag) (I)绑定网站,工器二世和四世5设计Ag)(我)绑定网站。人工碱基用于生成结合位点是咪唑(工器我和二世)和2-methylimidazole(工器三世和四世)。后者构成第二代imidazole-type nucleobase增加热稳定性产生的Ag) (I)介导的碱基对,其中原因空间中央Ag) (I)离子预计将有一个较小的溶剂可及性35]。双工V提供一个参考双没有任何人工碱基。

确保确实截然不同的Ag) (I)介导的碱基对形成融化曲线的工器测定与温度有关的紫外光谱的存在越来越多的Ag)(我)。在接下来的讨论,一个相当于Ag) (I)被定义为所需的Ag) (I)对所有可能的形成Ag) (I)介导的碱基对。因此,对于工器我和三世一个相当于等于四Ag) (I)离子,而对于工器二世和四世1当量= 5 Ag) (I)离子。这个定义允许的讨论不同的工器无论他们绝对Ag) (I)的内容。

我们可以看到从融化曲线如图1Ag),(我)会导致大量热稳定。有趣的是,添加过量Ag) (I)的结果在一个很小的额外增加熔化温度。这种行为(大幅增加在添加一个相当于Ag) (I),之后小得多的增长)是典型的形成metal-mediated碱基对(12]。这的确表明,人工mispairs代表highest-affinity Ag) (I)的结合位点。这是证实了使用双参考测量V没有任何人工核苷。双工的Ag) (I)V导致增加多一点1°C / Ag) (I) (°C四Ag) (I))。对于工器我- - - - - -四世,额外的Ag) (I)可能是非绑定到带负电荷的核酸骨架(38)或空站点规范化碱基(39]。表2列出了融化曲线的工器相当于一个Ag)的缺失和存在(我),也就是说,有或没有Ag) (I)介导的碱基对。正如预期的那样,使用2-methylimidazole导致热的形成更稳定的Ag) (I)介导的碱基对。每个个体的平均稳定Ag) (I)介导的碱基对相当于5 - 6°C。

圆二色性(CD)光谱,重点阐明了构象的Ag) (I) -自由和Ag) (I)含有核酸工器。我们可以看到从CD光谱图所示2、添加Ag)(我)不产生显著的构象改变工器。小双CD谱的变化二世,这并不出人意料,因为它包含最多的mispairs调查工器中成为metal-mediated碱基对Ag) (I)的存在。重要的是,天然DNA双工的CD谱V在越来越多的公司(我)显示摩尔椭圆率下降在270纳米左右。类似的工器CD光谱的变化变得明显我和二世只有在超过一个相当于Ag) (I),从而证实了imidazole-based mispairs代表highest-affinity Ag) (I)的结合位点。一般来说,CD光谱与富含嘌呤的工器:胸腺嘧啶碱基对组成的一个purine-rich和一个pyrimidine-rich链(40]。

3.2。光谱特性的dna模板Ag纳米束

减少给AgNCs Ag) (I)的离子是通过添加过多的NaBH刚做好的水溶液₄。与描述的实验部分3.1,40双浓度μM。形成一个统一的寡核苷酸工器与Ag) (I)介导的碱基对是通过加热缓冲水溶液的工器65°C和缓慢冷却至10°C的存在相当于AgNO之一₃。

在减少,无色寡核苷酸的解决方案变成黄棕色。UV / Vis光谱标明新吸光度的存在极大值在可见范围(图3)。特别是,一个新的峰值在~ 395 nm观察所有四个imidazole-comprising DNA双工器以及本机。额外的峰值在~ 575 nm可以找到工器的光谱二世和四世在一个较小的程度上也在双谱我。工器的光谱二世和四世也小山峰~ 495纳米左右。表3列出了UV / Vis工器的光谱数据我- - - - - -V在添加NaBH之后₄。高峰在395 - 405海里表明银纳米粒子的形成直径10 - 14 nm (41]。随着时间的推移,这个峰值变得更广泛和红移,说明进一步聚合纳米颗粒(41]。相比之下,额外的峰值在~ 575 nm曾被与发光机制的形成(42),因此表明预期AgNCs形成。有趣的是,AgNO的减少₃由NaBH₄在缺乏任何DNA不会导致颜色的解决方案(图3,橙色频谱),表明没有小的银纳米颗粒或纳米束。此外,减少AgNO₃在本机双工的存在V不会导致物种的最大吸光度超过500海里。

作为他们的荧光性质[AgNCs是众所周知的1),降低核酸工器的解决方案我和二世受到荧光光谱表征。所显示的图4,没有明显的荧光信号检测的减少Ag) (I)含有寡核苷酸工器。边际荧光约400 - 550 nm观察之前和之后都减少很可能是由于DNA的固有荧光,被记录显示荧光光谱也没有任何AgNCs的Ag) (I)和。缺乏荧光也可能被解释成一个双链DNA模板的使用,如双螺旋DNA曾被证明产生AgNCs微不足道的可见荧光(7]。有人建议,这可能是由于电子配置,无需在可见的范围和/或励磁的励磁的衰减迅速以非辐射的方式(7]。

3.3。TEM测量

调查是否,尽管缺乏显著的荧光,AgNCs已经获得,TEM测量进行工器的解决方案我,二世,V。由此产生的图像证实,纳米颗粒(> 10 nm直径)和发光机制(< 10 nm直径)形成。EDX能谱法证实了银的粒子组成。同意,衍射实验结合黑暗——/亮场成像显示单一水晶银粒子。图5显示选定的TEM图像没有较大的骨料。可以看到,这些部分中的粒子直径大多在2 nm-10海里的顺序。基本上是球形的粒子。额外的发光机制的存在不能排除小于2纳米,如下这些是解决目前TEM实验使用多洞的碳网格。从双工的平均规模制备获得二世(2-methylimidazole)如图5在相同的(标准误差海里,这些获得双工的大小我(与咪唑)(海里,)。因此,似乎没有简单的数量之间的相关性Ag) (I)介导的碱基对,结果AgNCs的大小分布。天然DNA双工V观察,一个更广泛的粒度分布(图5(c),海里,)。一般来说,银纳米颗粒往往是有点比那些获得DNA Ag) (I)介导的碱基对。最后,相同浓度的减少Ag) (I)在缺乏DNA导致一个完全不同的外观产生的银(图5(d))。单个球形纳米颗粒或纳米束不成立或不稳定的在这种情况下,只有骨料被观察到。因此,TEM测量表明,核酸与Ag) (I)介导的碱基对给最小的AgNCs最狭窄的粒径分布。

4所示。结论

这项研究首次表明,核酸与人工Ag) (I)介导的碱基对可以申请的生成银纳米束。形成的集群证实了TEM。尽管核酸包含离散数量的Ag) (I)每双离子,AgNCs没有发现是单分散的。尽管如此,观察更窄的粒度分布与一个完全自然的DNA双模板相比,表明相关性Ag) (I)介导的碱基对的集群的形成。此外,制备由DNA与Ag) (I)介导的碱基对有不同的光谱特性与形成的天然DNA AgNO的存在₃明显的吸光度,UV / Vis谱的最大值。最初形成的小束有一种倾向,总在工器的情况下我- - - - - -四世。这种纳米颗粒后UV / Vis-spectroscopically时间增长。考虑到众多metal-mediated碱基对已经建立了一系列不同的金属离子,这项研究打开一个新的和有前途的大道对不同金属的发光机制的形成。根据金属离子的身份包括metal-mediated碱基对,应该获得不同的发光机制不同的物理性质。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

财政支持的德意志Forschungsgemeinschaft (TRR 61,项目C07)。作者感谢博士Anzhela Galstyan记录的一些荧光光谱。

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