ZNF191(243-368)的识别代码及其与DNA的相互作用

摘要

ZNF191(243-368)是ZNF191的c端区域，包含一个推测的4个Cys的dna结合区域₂他的₂锌指图案。本研究构建了ZNF191(243-368)与谷胱甘肽- s -转移酶(GST)融合蛋白的表达载体，并将其转化大肠杆菌BL21。利用该载体表达融合蛋白GST-ZNF191(243-368)，根据锌指结构域的结合质量，通过亲和选择策略研究蛋白- dna结合反应。结果表明，ZNF191(243-368)能选择性地与含有AGGG核心的基因结合并与之反应。然而，Cys的识别机制₂他的₂锌指蛋白与DNA的关系需要进一步研究。

1.介绍

Kruppel-type (C₂H₂)锌指基序是一种广泛存在于真核生物中，介导DNA序列特异性识别的基序。锌指蛋白还可以结合DNA、RNA或其他蛋白质，在细胞分化和胚胎发育等多种生物学功能中发挥关键作用[1- - - - - -3.］.以往的研究探索了锌指蛋白的晶体/核磁共振结构和dna结合位点，一些工作报道了对新C₂H₂锌指蛋白序列分析[4- - - - - -7］.然而，这些观察结果不足以确认每个氨基酸残基的识别码[8，9］.因此，获得锌指蛋白的特定dna结合序列和了解其功能仍然具有挑战性。

一般来说，新锌指蛋白与未知序列特异性DNA的DNA结合序列可以通过随机寡核苷酸选择或从全基因组文库中筛选确定[10- - - - - -12］.然而，必须确定大量的DNA序列，并且必须通过计算机分析提供一个推定与典型蛋白质接触的一致的DNA序列。计算结果还必须经过实验验证。由于多种因素对锌指蛋白识别码的影响，实验结果可能与氨基酸序列推断的结果不一致。

ZNF191基因从人肝脏的cDNA文库中鉴定。该基因位于人类染色体18q12.1上，与一些遗传和肿瘤疾病有关[13，14］.ZNF191编码一个368氨基酸的蛋白质，其中包括一个假定的4个Cys的dna结合区域₂他的₂在c端有锌指图案。ZNF191(243-368)是ZNF191的锌指蛋白，可能与ZNF191的主要功能区域的特定DNA序列结合。一些研究报道了ZNF191的at结合倾向(243-368)。然而，ZNF191(243-368)的实际功能和dna结合位点尚不清楚。

本研究旨在从蛋白水平阐明ZNF191(243-368)的功能。我们表达并纯化了谷胱甘肽- s -转移酶(GST)与ZNF191(243-368)的融合蛋白，利用GST对sepharose 4B树脂的特异性亲和力选择特异性结合DNA。结果表明，ZNF191(243-368)的一致结合位点具有一个“AGGG”核心，可能是Cys序列特异性识别的化学规则₂他的₂应谨慎使用。

2.材料和方法

2．1．融合蛋白表达质粒的构建

通过PCR方法亚克隆ZNF191锌指区的cDNA片段，获得GST融合蛋白。利用寡核苷酸引物P1 (5 ' -CGCGGATCCAGAAATCCCTCTCGAAAGAAACAA-3 ')进行PCR克隆;P2(5“-TCCCCCGGGTTAAACTTCCACAACATTCAGAAG-3”)。PCR模板为pTSA-ZF载体[14］.利用上引物P1(引入Bam HI位点)和下引物P2(引入Sma I位点)扩增ZNF191(243-368)基因。pcr扩增片段和pGEX-4T-2 (Amersham Pharmacia)载体分别与Bam HI和Sma I孵育，电泳凝胶纯化，T4连接酶(BioLabs)混合连接。将结扎产物转化BL21寄主株。对细菌克隆进行测序，重组载体命名为pGEX-ZF [15］.

2．2．锌指融合蛋白的过量生产与纯化

LB培养基(50 mL)含100μg/mL氨苄青霉素与含有表达质粒pGEX-ZF的新鲜菌落接种，37℃孵育过夜。过夜培养物在500ml 2YT培养基中稀释100倍，37℃至OD₆₀₀= 0.6。Isopropylthio -β- d -半乳糖苷加入至0.5 mM终浓度，在30℃诱导细胞3 h。通过离心(6000 rpm和4℃)收集细胞，在100 mL冰冷PBS (pH 7.4)中重悬10 mMβ-巯基乙醇，4℃溶菌酶裂解约30分钟。在混合物中加入1% Triton X-100, 1 mM PMSF和5 U/mL DNase I (Sango Company, Shanghai, China)，在4°C下搅拌30分钟以帮助蛋白质溶解，然后在4°C下以15000 rpm离心30分钟。将上清液与10 mL谷胱甘肽琼脂糖4B浆液(Amersham Pharmacia Biotech)混合，然后摇匀30分钟。用PBS广泛洗涤亲和基质，直到OD₂₈₀< 0.02，然后用洗脱缓冲液(50 mM Tris, 100 mM还原谷胱甘肽，pH 8.0)洗脱GST融合蛋白。洗脱液用Amicon YM-10 (Millipore)进行浓缩，通过Sephadex G75色谱柱。将纯化的融合蛋白与树脂混合，进行下一步的结合实验。

2．3.锌指蛋白dna结合试验

ZNF191(243-368)的结合DNA是通过随机寡核苷酸池获得的。以5 ' -ATTCAGATCTTAAACACAGGA序列为模板，合成了一个包含18个随机碱基的中心区域的60-单链DNA寡核苷酸¹⁸…GTGATGCTCGGTACCCTAAAG-3”。PCR引物为A1 (5 ' -CGCGGATCCATTCAGATCTTAAACA-3 ')和A2 (5 ' -TTCCCCGGGCTTTAGGGTACCG-3 ')。Pfu聚合酶(BioLabs)通过变性(94°C, 1 min)、退火(56°C, 1 min)、延伸(72°C, 1 min) 10个循环获得双链DNA片段的混合物。PCR产物经苯酚/CHCl处理_3.然后用乙醇沉淀。这些dna与GST-ZNF191(243-368)融合蛋白结合谷胱甘肽sepharose 4B(如前面所述制备)在4℃结合缓冲液[0.2 mg/mL poly(dI-dC) (Sigma)， 0.2 mg/mL BSA (BioLabs)， 25 mM HEPES (pH 7.5)， 100 mM KCl, 0.1 mM ZnSO]中孵育30分钟₄， 10毫米氯化镁₂， 0.1% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 5%甘油][11］.将树脂珠离心并用束缚缓冲液洗涤四次。用洗脱缓冲液将结合的寡核苷酸从微珠中洗脱，然后在H中煮沸10分钟₂O.离心后上清，利用引物P1和P2进行PCR扩增。经过三轮筛选扩增，PCR产物经Bam HI和Sma I酶切后克隆到pGEX-4T-2载体上。重组载体转化为大肠杆菌，并对获得的菌落进行测序。

２.４.紫外可见吸收光谱

GST-ZNF191(243-368)融合蛋白、GST和ZNF191(243-368)的紫外光谱在HP 8453二极管阵列分光光度计(美国)上记录。采用Bradford 's法检测10 mM Tris-HCl的蛋白溶液(pH 7.5)的浓度，为1μ摩尔·L⁻¹．

2．5．圆二色性(CD)光谱

GST-ZNF191(243-368)融合蛋白、GST和ZNF191(243-368)在J720 Jasco偏振谱仪上记录了190 ~ 250 nm的圆二色光谱。光程长度为10 mm，含有10 mm Tris-HCl的蛋白溶液(pH 7.5)浓度为1μ摩尔·L⁻¹．记录在25°C下进行。

2．6．荧光测量

用两个合成纯化的DNA双链，荧光光谱法检测ZNF191(243-368)的DNA结合活性。一条DNA包含获得的序列GGAGGGTGGTTA (DNA1)，另一条DNA包含12 bp motif GAAATAATGTTA (DNA2)，与之前的报道预测一致[8］.

dna结合研究是在含有50 mM Tris-HCl和10 mM NaCl的缓冲液(pH 8.0)中进行的。滴定过程是将蛋白原液GST- znf191(243-368)或GST加入到1 mL含有500 nmol·L的缓冲液中进行的⁻¹12 bp的寡核苷酸双链和1μ摩尔·L⁻¹溴化乙锭(EB)。

荧光发射光谱由Cary Eclipse荧光光谱仪(Varian公司)在550-700 nm范围内获得，激发波长为540 nm，在1 cm × 0.5 cm荧光试管中，20°C。所有荧光测量的入口和出口狭缝保持在10 nm。

3.结果与讨论

3．1.质粒的构建及融合蛋白的表达

从重组质粒pGEX-ZF的DNA序列来看，ZNF191(243-368)基因的n端与GST基因的c端相连。因此，该融合基因表达了一个40 kDa的蛋白，其中含有4个C₂H₂型串联锌指基序在融合蛋白的c端。GST-ZNF191(243-368)经谷胱甘肽sepharose 4B和Sephadex G75柱按照上述方法纯化。纯化蛋白的SDS-PAGE分析显示出融合蛋白预期大小的显著条带(图)1)．将纯化的融合蛋白与树脂结合后，将混合物用于后续的结合实验。

3．2.基于亲和性的dna结合位点选择

四个C的预测结构₂H₂锌指结构域和基因定位表明ZNF191(243-368)是一个dna结合蛋白。为了确定ZNF191(243-368)的dna结合位点，我们使用了前面描述的随机寡核苷酸结合选择策略。选择过程涉及到两个亲和过程，即GST-ZNF191(243-368)与基质固定的谷胱甘肽sepharose 4B结合，以及随机寡核苷酸与锌指蛋白结合(图)2)．将随机寡核苷酸与GST蛋白进行类似的结合实验作为对照。

基于亲和力，我们通过一系列的洗涤和扩增过程获得了ZNF191(243-368)的dna结合位点。最后，我们将这些DNA序列转移到pGEX载体中，然后对这个质粒进行测序。获得了与蛋白质紧密结合的DNA序列(图)3.)．

3．3.dna结合活性

比较GST-ZNF191(243-368) dna结合位点的序列。69个克隆中有38个(55%)有AGGG序列，7个、4个、2个克隆中分别有AGGC、AGGT、AGGA序列相似。因此，51个(74%)克隆被发现含有“AGG”核心。虽然“AGG”核心在残差序列之外，但有几个序列具有类似的序列AGCG和ACGG。此外，GC含量较高。这些结果表明，GST-ZF与AGGG序列的结合强于与其他序列的结合。

比较这些包含AGGG的序列，计算AGGG前后碱基的概率，我们认为结合序列为(G)(G)AGGG(G)(表)1)．

结合位点列中结合序列的碱基编号为1 ~ 8。将这些序列中有时出现两次的AGGG序列进行比较，碱基选择列中的数字表示每个碱基出现在1-8个位置的频率。百分比列中的每个数字表示在指定位置含有该碱基的所选寡核苷酸的百分比。

3．4．真核生物启动子数据库

ZNF191在人体器官中广泛表达，可能与一些遗传性和癌症疾病有关。因此，含有AGGGG核心的基因可能是ZNF191(243-368)的靶基因。我们在真核启动子数据库中搜索含有GGAGGGG的基因[16］.许多基因启动子包含ZNF191(243-368)的这一结合位点，如AHSA1、NOSIP、RHO和HIVEP2，分别与转移性前列腺癌、神经元NOS活性、视紫红质变性状态和免疫缺陷相关[17- - - - - -20.］.另外，许多染色体的开放阅读框、对接蛋白、转录因子和锌指蛋白也含有这个序列[21- - - - - -24］.这表明ZNF191在人体器官中广泛表达，可能与许多生理过程和疾病有关。

含有zf结合位点的基因可能与ZNF191(243-368)发生反应。然而，我们不能排除另一种可能性，即DNA序列不是该蛋白的生物结合位点。除了锌指结构域影响dna结合特性外，锌指结构域外的一些残基也参与了识别。此外，应谨慎使用已知的基于锌指基序的化学规则。对ZNF191锌指蛋白的DNA进一步研究正在进行中。

3．5．紫外可见吸收光谱

将GST- znf191(243-368)的紫外光谱减去GST的紫外光谱，得到GST与GST的不同紫外光谱(图)4)．结果表明，融合蛋白中的ZNF191(243-368)在260 ~ 280 nm范围内保持了对芳香族氨基酸残基的吸收，在230 nm范围内保持了对Zn-S键的吸收[25，26］.此外，GST中几个发色团在线性范围以外的吸收不能完全从光谱中推断出来，导致在200 nm处存在显著差异。

3.6。CD光谱测量

GST-ZNF191(243-368)与GST的CD谱差异表明，融合蛋白中的ZNF191(243-368)在210和220 nm处有两个负峰，在190 nm处有一个正峰α螺旋(图5)．因此融合蛋白中的ZNF191(243-368)还维持着第二种结构[27- - - - - -30.］.

3.7。蛋白质- dna复合物的结合常数

荧光光谱法广泛应用于蛋白质- dna相互作用的研究。结合曲线可以通过将蛋白溶液滴定到DNA溶液中得到，解离常数()可以通过分析所得曲线得到。在DNA溶液中加入EB增强了荧光强度的变化。

EB和ZNF191(243-368)以Scatchard方程为基础，在三组分体系中竞争与DNA结合:［31- - - - - -33］.这些关联可以描述为 在哪里和为结合EB或蛋白浓度与DNA总浓度的比值;和分别为游离EB和蛋白质浓度;为每个寡核苷酸的结合数;和和分别为EB和蛋白质与DNA的结合常数。

从(1)和(2)， (3.)的计算方法如下: 和,在这和EB-DNA系统在没有蛋白质和有蛋白质时的荧光强度分别是和吗是EB的总浓度，这是一个已知的量。因此,只有未知在(3.)．根据公式，可以计算代入到(2)以获得绑定常数蛋白质和DNA。

数字6显示了融合蛋白和DNA的荧光光谱。在此系统中,n和是0.2 × 10还是5.0 × 10⁷L·摩尔⁻¹分别为(34，35］.因此，联想常数GST-ZNF191(243-368)与DNA的关系结果如表所示2．

锌指蛋白与DNA1的结合比与DNA2的结合更强。此外，DNA2的结合结果与前人的研究接近，其中从pTSA/BL21(DE3)体系中纯化了ZNF191(243-368)的两个突变蛋白[15］.因此，融合蛋白可以用高灵敏度、高选择性的EB荧光探针，通过三组分体系的荧光方法研究蛋白质- dna的相互作用。实验得到的锌指蛋白与DNA1的结合常数为3.8 × 10⁷L·摩尔⁻¹，比锌指蛋白和DNA2高出近一个数量级，与其他锌指蛋白和DNA的数量级非常接近[36，37］.因此，我们推断了ZNF191(243-368)与GGAGGG之间的强相互作用，这为了解ZNF191(243-368)的功能提供了有用的信息。

然而，这一结果与Yu等人报道的结果不同。这种差异可能是由于多种因素影响锌指蛋白对DNA的识别。例如，ZNF191其余部分的关键残基可以诱导DNA弯曲，这有利于锌指蛋白的容易结合[38- - - - - -40］.位于ZNF191(243-368)之前的扫描盒在DNA识别中也有重要作用[41，42］.此外，各种蛋白质组分的协同作用也是一个因素[43，44］.

4.结论

ZNF191(243-368)可选择性与序列结合，并与含有AGGG核心的基因发生反应。但蛋白质的锌指结构域并不是影响dna结合特性的唯一因素;锌指结构域外的一些残基也参与了识别。基于锌指基序的已知化学规则应谨慎使用。对ZNF191锌指蛋白的DNA进一步研究正在进行中。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

承认

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no. 201430430429);21301050)。

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