纳米银对食源性致病菌的体外抗菌活性及其机制

摘要

纳米银的生物合成Planomicrobium并探讨其对食源性致病菌的抗菌活性枯草芽孢杆菌, (3053)植物克雷伯氏菌(2727)肺炎克雷伯菌(MAA)沙雷氏菌属nematodiphila(CAA)和大肠杆菌．在目前的研究中，将1mm的硝酸银加入到100ml的Planomicrobiumsp.文化上层清液。纯AgNO的生物还原_3.采用紫外-可见光谱、x射线衍射分析(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、能谱分析(EDS)、透射电子显微镜(TEM)和傅里叶变换红外(FT-IR)分析对样品进行了表征。利用紫外可见分光光度法，在400 nm处有一个吸收峰，证实了银纳米粒子的形成。通过透射电镜和扫描电镜观察纳米银的形貌和尺寸。通过x射线衍射研究得到了晶体结构，显示为面心立方结构。根据井法中抑菌带直径的不同，比较了纳米银的杀菌效果。细菌对纳米颗粒的敏感性是制造纳米颗粒的关键因素，适合长寿命应用于食品包装和食品安全。食品安全是世界性的健康目标，食源性疾病是人类健康的主要灾难。因此，控制食品中的细菌病原体是对健康和安全的危害。

1.导言

食品制造中的纳米技术可以有多种形式。它将纳米技术应用于食品包装材料中。纳米技术将增加食品的抗菌覆盖。纳米颗粒在合成过程中分散，并能够在食品中形成积木₂阿,₂以及从新鲜水果、蔬菜、肉类和其他食物中吸收的水分。包装可以控制食品中的细菌生长[1]，这样就可以在致病细菌的容器中，疾病和疾病。食品包装的一个严重问题是迁移和渗透性[2，3.[参考译文]:包装食品中没有完全抗水蒸气、大气或湿度的材料。橙汁是全球最受欢迎的水果产品之一。为了保持果汁的新鲜度，延长其货架期，近年来研究开发非热处理技术来替代热处理技术。虽然一些技术能够去除橙汁的污染，但最近在食品包装行业引入的纳米技术可能为食品包装挑战提供解决方案。采用双螺杆挤出机熔融共混法制备了含Ag和ZnO纳米颗粒的LDPE纳米复合薄膜。橙汁消毒后接种8.5 log cfu/mL乳杆菌［4]．抗生素耐药性是世界上解决公共卫生问题最重要的产品之一。在现代几十年里，几乎每一种微生物的替代品都变得更强大，接触抗生素治疗的机会更少，威胁到了传染病的新菌株或超级菌株，这些菌株治疗起来同样更昂贵，治愈起来也更复杂。耐药细菌正在提高病原体的耐药性，这是控制它们的传播和它们对人类健康的影响的最大挑战[5]．纳米技术之所以得到大力发展，是因为它是一个重要的新研究领域，可能对生物医学技术和电子技术产生影响[6]．不言而喻，银纳米粒子的性质是由它们的大小、形状、组成、晶体和结构决定的。其中银纳米粒子已被广泛用于传感器[7，光催化剂[8和抗菌剂[9]．有一些方法，如微乳液[10),电纺的(11，以及超声波辐射[12]，可用于合成银纳米颗粒[13]．金属纳米粒子由于其非凡的电催化活性而广泛应用于生物医学和生物电化学领域。众所周知，纳米银颗粒是一种有效的抗菌剂，对细菌、病毒和真菌具有很强的抗菌活性;尽管如此，其作用机制和方式仍不为人所知[14]．

有几种编程的方法，如食品包装、制造和农业，可以大大减少食品中的致病菌菌株。然而，病原体检测方法的作用仍然至关重要，这是预防人类健康和安全的解决之道。从过去几十年到最近几年，目前用于食源性病原体检测的方法将重点讨论它们的优点和局限性。

目前的研究旨在评估表征良好的银纳米颗粒对食源性病原体的毒性。食品腐败是指食品介质上的杀菌活性导致食品成分分解的报告。目前的报道表明，各种类型的食品致病菌对不同的抗生素具有耐药性。细菌菌株如枯草芽孢杆菌(3053),植物克雷伯氏菌(2727)肺炎克雷伯菌(MAA)沙雷氏菌属nematodiphila(CAA)和大肠杆菌是使食物变质的主要微生物。使用这些细菌污染食品会对人类健康造成危害。

2.材料和方法

2.1.细菌的分离和鉴定

冰淇淋样品从牛奶市场采集。将其连续稀释并涂布在营养琼脂平板上。然后在27°C孵育1周。分离的微生物是Planomicrobiumsp。

２.２.纳米银的胞外合成

Planomicrobiumsp.在100 mL营养液中培养，35°C孵育24小时。过夜的培养液以6000 rpm离心10分钟。收集细胞游离上清，混合1 mM的硝酸银，在35°C孵育24小时。用紫外-可见分光光度计测定样品的光谱。

2.3.银纳米颗粒的表征

采用perkins - elmer分光光度计在300 ~ 600 nm波长范围内对银离子在水溶液中的生物还原过程进行了监测。纳米粒子在4000-400厘米范围内进行红外扫描⁻¹傅里叶变换红外光谱仪(热Nicolet模型，6700)。将银纳米颗粒悬液在样品网格上风干，用JEOL JEM-1010扫描电镜观察。用x射线粉末衍射仪(Seifert-3000p)测定产物的结晶相。在能量色散x射线分析中，银纳米颗粒在碳涂层铜网格上干燥，并在日立SU6600模型上进行。

２.４.纳米银的抗菌活性

2.4.1.肉汤稀释法

研究了纳米银的抗菌活性枯草芽孢杆菌(3053),k . planticola(2727),k .肺炎（MAA），线虫（CAA），以及大肠杆菌在Luria Bertani肉汤（LB）中，将24小时龄的细菌培养物接种到补充了不同浓度（250℃）的LB肉汤中 L, 500L, 750L)银纳米颗粒。以无NPs LB肉汤作为对照。将装有锥形瓶的肉汤在室温下搅拌24小时，并在不同时间间隔下取600 nm光密度观察被测试生物的脆弱性。

2.4.2. 井扩散法

所合成的银纳米颗粒采用Planomicrobium采用琼脂井扩散法检测该菌株对病原微生物的抗菌活性枯草芽孢杆菌(3053),k . planticola(2727),k .肺炎（MAA），线虫（CAA），以及大肠杆菌．细菌的纯培养物在营养液上继代培养。用无菌棉签将每个菌株均匀地交换到单独的培养皿上。在Muller Hinton琼脂上用凝胶穿刺，取直径10mm的孔。不同浓度的银纳米颗粒30L, 60L, 90我被倒在每一口井里。孵育24小时后，测定不同程度的抑制带。进行了三次重复实验。

3.结果和讨论

３．１．视觉观察

溶液颜色的变化初步证实了银纳米颗粒的形成（图1(一)和1 (b))由于表面等离子体激元共振的激发，水溶液呈现黄色到棕色的颜色变化。银纳米颗粒细胞外生物合成的详细研究Planomicrobium在这项工作中被执行了。数字1(一)显示了Planomicrobiumsp.，生物量，图(b)为1mm硝酸银溶液处理后的生物量。颜色由黄色变为深褐色，表明在孵育24小时后形成银纳米颗粒。孵育24小时后的深棕色外观证实了硝酸银用培养上清还原为银NPsPlanomicrobium暗棕色的形成是银NPs合成的指示。24小时后，未发生电荷，表明纳米银的合成过程已经完成。24小时后，浅棕色变为深棕色，表明银金属离子被细菌还原为AgNPsPlanomicrobium由于反应混合物中自由电子的激发，培养24小时后颜色变为深棕色[15]．在24小时时，棕色的稳定性和粒子的沉淀说明硝酸银完全被生物分子还原。颜色随孵育时间(6-24小时)、纳米粒子的大小和形状而变化。

３.２．紫外可见光谱分析

用紫外-可见光谱分析方法观察了银纳米粒子在胶体溶液中的形成和稳定性。研究了银纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱Planomicrobium如图所示2.硝酸银溶液用硫酸处理Planomicrobium假设不同的生长阶段在银纳米颗粒的合成过程中起着重要的作用。银的表面等离子体共振(SPR)出现在400 nm处。一般在生物量中，Ag NO_3.还原银纳米颗粒并沉淀在锥形烧瓶底部。随着银纳米颗粒尺寸的增加，溶液的颜色从黄色到棕色不等。48岁以后 培养小时后，纳米颗粒的形成速度降低。24岁以后 hrs时，吸光度逐渐降低，表明银纳米粒子的合成过程已经完成。由于微生物活性生物分子的作用，在反应混合物中形成了银纳米颗粒，本报告与来自烟曲霉属真菌［16]．24小时后，没有出现高吸光度，说明银金属离子还原为银NPs的过程已经完成。表面等离子体吸收带的属性在400 nm处可见，纳米颗粒尺寸的增大也会影响SPR带的展宽[17].该吸收路肩的外观以及420处的驼峰 nm表示存在不同尺寸的纳米晶。TEM分析表明存在不同类型的颗粒，这一观察结果得到了很好的支持。使用黄曲霉［18]．

3.3.X射线衍射

所得银纳米粒子的XRD谱图Planomicrobium如图所示3.．在整个光谱中有三个强烈的峰取值范围为20 ~ 70。将我们的XRD谱图与标准样品进行比较，证实了本研究中的银纳米颗粒以纳米晶体的形式形成，从图中的峰值可以明显看出值44°，64.5°和77°积分强度值分别为(200)，(220)和(311)立方银相。这些与报告的标准一致(JCPDS文件编号84-0713)。在28°、32°、54°和56°处观察到四个未指定的杂质峰，可能与培养上清液中的其他有机物有关。XRD谱图表明，银纳米颗粒是由Ag还原形成的⁺离子的PlanomicrobiumSp.是晶体性质的。布拉格峰的加宽表明银纳米颗粒的形成。根据折光峰(220)的线宽，利用Scherer方程，从XRD谱图中计算出银纳米颗粒的平均粒径: 在哪里为半最大值时的全宽度(FWHM)，x射线波长是多少为角度处的参考峰宽;为垂直于发光面的平均晶体面积大小。结果表明，包封剂在银纳米粒子合成过程中对晶体场的弯曲、稳定性的破坏以及晶体段的修饰具有重要作用。这些峰的XRD谱图表明，银纳米颗粒在性质上是结晶的，并观察到一些未指定的峰;这可能是由于细菌的酶或蛋白质等稳定剂的生物分子较少所致[19]．

3．4．扫描电镜

数据4(一)和4 (b)显示银纳米颗粒的扫描电子显微镜图像。以不同的放大倍数（如2000x和5000x）观察银纳米颗粒，颗粒大约在1 纳米到10 纳米银颗粒的形态几乎是球形。SEM图像清楚地表明颗粒聚集并形成不规则形状。少数颗粒呈球形结构。SEM图像还显示大量聚集可能是由于培养液中存在生物分子所致来自Planomicrobium纳米银的SEM图像呈球形。在SEM图像中没有发现清晰的结构，因为在纳米粒子的表面发现了负责纳米粒子合成的生物分子[20.]．从丝状真菌合成的银双金属纳米颗粒中观察到了相同形状的纳米颗粒粗糙脉孢菌［21]．

3.5.EDX

通过能量色散x射线分析证实了元素银的存在。3kev的强信号证实了银纳米颗粒在溶液中形成。由于细菌的生化分子负责银纳米颗粒的合成，可以观察到氯的微弱信号(图)5)．

3.6。TEM和SAED分析

在高倍镜下，用透射电镜对银纳米粒子的形态结构和分布进行了表征。数字6(一)显示了分散良好的球形银纳米颗粒，也证实了合成的银纳米颗粒是纳米级的[22]SAED图显示了晶体中面心立方（FCC）结构的（200）、（220）和（311）指数对应的三个环，这些结果也通过XRD分析报告（图6 (b))．

3.7。红外光谱分析

红外光谱显示了与银纳米颗粒相结合的生物分子，它们负责将银离子还原为银纳米颗粒(图)7).在3356处观察到的强谱带 厘米⁻¹表示蛋白质的酰胺键的N-H伸长。2921,2351厘米处的弱带⁻¹分别由于亚甲基基团的拉伸振动和胺的N–H拉伸而观察到。1643处的窄带 厘米⁻¹对应于烯烃的C=C -拉伸。小而强烈的峰在1392厘米处⁻¹显示蛋白质或酶的硝基化合物的存在。在1034和677处观察到两条弱带 厘米⁻¹是归属于脂肪族胺和-C =H弯曲的烯烃。FTIR光谱证实了蛋白质的酰胺连接、蛋白质或酶的亚甲基和硝基化合物的存在[8从培养上清液中提取的蛋白质或酶的功能性生物分子Planomicrobium因此，我们得出结论，硝酸还原酶产生的这些功能分子可能参与将银离子还原为银纳米颗粒[17]解释并使用了从中纯化的硝酸还原酶尖孢镰刀菌用于银纳米颗粒的合成。同样的,(23研究还表明生物分子组分硝酸盐还原酶参与还原过程，鼠李糖脂参与覆盖培养上清液中发现的银纳米颗粒铜绿假单胞菌．

3.8。井扩散法抑菌活性测定

表中显示了由具有良好抑制区的海洋细菌菌株合成的银纳米颗粒1和图8．对致病菌如枯草芽孢杆菌、植物芽孢杆菌、肺炎芽孢杆菌、线虫芽孢杆菌、，和大肠杆菌.有三种不同的浓度（30 L, 60L, 90L)用来杀死致病菌。在细菌合成AgNPs的过程中，AgNPs积极参与了对细菌的抗菌活性枯草杆菌，大肠杆菌和线虫有最小的抑制区，因为细菌分离株的耐药能力最大。抑菌作用在中等范围内k . planticola和k .肺炎对细菌介导的银纳米颗粒具有最低的抑制作用。银是一种以其广泛的抗菌活性而闻名的金属，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，包括耐抗生素菌株[24，25]．它可以用来减少烧伤部位的感染[26- - - - - -28]，以消除食品包装、医疗仪器、纺织织物及水处理所用的细菌[29- - - - - -32]．银纳米颗粒作为一种抗菌剂，已经在包括玻璃、聚合物和钛在内的一系列设备中发挥了作用。

3.9.通过肉汤稀释法测定银纳米颗粒的抗菌效果

纳米银的抗菌作用枯草芽孢杆菌，植物芽孢杆菌，肺炎芽孢杆菌，线虫，和大肠杆菌在LB肉汤中进行了研究。不同浓度的银纳米颗粒（250 L, 500L, 750L)，用紫外-可见分光光度计测定光密度值(OD)。的增长率枯草芽孢杆菌，植物芽孢杆菌，肺炎芽孢杆菌，线虫和大肠杆菌在750L（数字9（a），9（b），9（c），9（d）,9（e）).围绕银的抗菌活性对学术界和食品工业来说是一个巨大的挑战。这些材料在生命中的新颖性形成了一种具有高温稳定性和低挥发性的持续抗菌材料[33].耐药病原体菌株数量和发病率的大幅增加激发了人们对使用银纳米颗粒作为抗菌剂的新兴趣[34]．

纳米颗粒的杀菌活性可能与几种机制有关（图10).银纳米颗粒也可能直接与微生物细胞相互作用。研究银离子可以将呼吸电子传递与氧化磷酸化分离，氧化磷酸化抑制呼吸链酶或通过覆盖对磷酸盐和质子的渗透性进行干扰（例如，中断跨膜电子转移、氧化细胞成分、破坏、穿透细胞覆盖物或活性氧（ROS），或溶解造成损害的重金属离子）。由于病原体菌株的存在，食品行业是主要的相关方，在这种情况下，快速检测病原体可能会产生可怕的影响。尽管食品安全性总体上有了显著提高，但由于细菌污染而导致的不均匀和食源性疫情仍在不断发展。然而，许多科学家和业内人士老年人已经在食品工业的几乎每一个环节，包括农业、加工和产品中使用了银纳米颗粒。这可能与以下事实有关：当前的研究表明，公众更渴望在“食品外”中接受纳米技术与直接将银纳米颗粒添加到食品中的应用不同。

本报告显示了一种快速且成本效益高的方法，可从中合成银纳米颗粒Planomicrobium抑制区清楚地表明，受试致病菌株对银纳米颗粒负责。目前的报告证明，生物银纳米颗粒似乎具有潜在和有效的杀菌覆盖材料。这可用于扩大食品材料的作物外寿命。

4.结论

综上所述，虽然银纳米颗粒作为一种工具来检测食品防护污染物或病原体菌株的发生仍处于初级阶段，但目前的结果在两种检测极限条件下都非常有前景。普通的包装材料，如蔬菜、纸张和塑料，其外部可以经过改性，使其适合于食品包装，其表面可以覆盖几十到几千纳米的厚度。目前的工作已经讨论了许多有前景的应用，包括食品包装材料、抗菌性能、化学污染物和更有效的农药，以及纳米封装营养素和香料的释放。商业化需要进一步的研究。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢STIC和Cochin提供了SEM和EDX, VIT Vellore提供了XRD, IIT Bombay提供了TEM设备。

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