文摘

耐药菌株的出现,目前几乎所有的抗生素强调开发新抗菌化合物的重要性。N-succinyl -l,l二氨基庚二酸desuccinylase (DapE)是一个metallohydrolase参与meso-diaminopimelate (mDAP) /赖氨酸生物合成所必需的赖氨酸生物合成途径和构建细胞壁肽聚糖。因为DapE是至关重要的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌,DapE已被建议作为一个好的抗生素发展的目标。最近,l卡托普利被建议作为一种铅化合物抑制DapE,尽管这种酶的选择性目标细菌仍不清楚(Gillner et al . (2009))。在这里,我们检测的选择性l卡托普利对DapE在细菌中。自DapE敲除株革兰氏阴性细菌是可行的在化学与mDAP补充,我们推断化合物的抗菌活性针对DapE mDAP-containing媒体应该被废除。虽然l卡托普利温和抗菌活性大肠杆菌而在沙门氏菌血清,令我们吃惊的是,抑制细菌生长的独立mDAP补充和DapE表达。我们得出这样的结论:DapE不是主要的目标l卡托普利抑制这些细菌。这里的方法实现筛查有用DapE-selective抗菌化合物直接在细菌培养。

1。介绍

最新颖的开发只是广谱抗生素,一组有限的已知的生物活性化合物的结构变异,许多针对相同的酶通路。因此,致病菌株的风险最终进化抵抗新的抗生素是非常高的1,2]。帮助对抗抗生素耐药性的严重的问题,当务之急是新酶的目标是识别和开发特定抑制剂。DapE N-succinyl -l,l二氨基庚二酸desuccinylase meso-diaminopimelate (mDAP) /赖氨酸生物合成途径的细菌已被确定为一个有吸引力的目标(潜在的抗生素3]。DapE终端酶的水解N-succinyl -l,l二氨基庚二酸(SDAP)(计划1琥珀酸)和衣冠楚楚的4]。两个产品的途径(mDAP和赖氨酸)是细胞的基本要素:赖氨酸是protein-amino酸和弹跳是必不可少的组成部分细胞壁肽聚糖的革兰氏阴性和许多革兰氏阳性细菌3,5]。由于没有类似DapE酶在哺乳动物中,DapE的抑制剂可能提供选择性对细菌的毒性,对人类有很少或没有影响。

DapE homodimeric酶,每个单体(41.6 KDa)包含两个结构域:二聚作用域和催化域di-zinc活性部位(4,6]。所有已知的序列比对DapE酶,包括大肠杆菌和血清,的结构特征DapE流感嗜血杆菌和奈瑟氏菌属meningitides,指向非常严格的保护的氨基酸作为金属配体和假定的底物结合位点4,7- - - - - -9]。

强烈抑制近年常常通过催化活性部位中的金属成分的直接协调。三个例子的抑制雇佣成功在临床药物磺胺类(如碳酸酐酶抑制剂)(10),suberoylanilide异羟肟酸(萨哈)组蛋白脱乙酰酶抑制剂(11),而l卡托普利(计划1),这是第一个销售降压药物,针对我血管紧张素转换酶(ACE) (12]。卡托普利与ACE的锌催化巯基协调。尽管卡托普利也显示了一些抑制活动向其他锌metalloproteases,这通常是几个数量级低于ACE (12]。

最近,Gillner和他的同事们(3)还发现了卡托普利的最佳抑制剂流感嗜血杆菌DapE在屏幕上偏向化合物包含锌结合组(包括硫醇、羧酸、boronic酸为原料,和hydroxamates)。卡托普利被发现DapE low-micromolar抑制剂(μ米,μ米),有抗菌活性在细菌中(对大肠杆菌)。然而,我们目前的证据表明DapE不是主要的目标l卡托普利抗菌活性在细菌中。

2。菌株、质粒、媒体和其他材料

大肠杆菌从Stratagene XL1-Blue购买。沙门氏菌血清型沙门氏菌感染DapE knockout-strain (TN5911)和质粒,pCM655 / DapE被米勒教授(请提供13]。E-medium [14与0.4%葡萄糖和0.4毫米)补充适当的氨基酸浓度(Bachem)作为基本培养基,和LB-medium作为丰富的媒介。作为一个补充,内消旋-diaminopimelate (mDAP)添加1毫米(Bachem)。l从西格玛奥德里奇卡托普利购买。钠氨苄青霉素、四环素和氯霉素的最终浓度使用60,5、34μg / mL,分别添加到液体或固体培养基。液体文化被摇晃在扶轮充气瓶(250 rpm),和增长孵化项目都在19小时37°C。电主管细胞美国血清和化学有关的细胞大肠杆菌是由标准协议。IPTG的最终浓度和mDAP 1毫米。琼脂(使用1.5%)和琼脂糖(在1%),从英杰公司购买。T4-DNA连接酶和HindIII来自新英格兰生物学实验室。所有其他的化学物质从Applichem购买,除非另有说明。

3所示。方法

pCM699空质粒,是源自于质粒,pCM655 / DapE [13),通过删除DapE基因HindIII消化和religation向量的骨干(表1)。应变TN5911(氯霉素抗性)的基因敲除菌株DapE和几个二肽酶;因此,必须补充mDAP最小和丰富的媒体。也需要一个适当的亮氨酸和脯氨酸在基本培养基和补充赖氨酸提供更好的增长(米勒教授;个人沟通)。两株来源于knockout-strain TN5911通过转化质粒pCM655 / dapE和pCM699(菌株TN5935 TN5959, resp)。质粒(pCM655 / dapE和pCM699)被电穿孔转化为TN5911 (1.8 kV, 0.1厘米比色皿)和恢复1毫升的SOC中包含mDAP和氯霉素为1小时37°C颤抖的孵化器和质粒编码的氨苄青霉素抗性选择。一群每个应变TN5935和TN5959挑选和培养5毫升的磅含有适量的氯霉素,氨苄青霉素,mDAP晚上37°C颤抖的孵化器。两个菌株的文化被稀释10倍(dilute-out任何剩余mDAP)和每个应变镀在基本培养基与mDAP补充与否。以类似的方式,大肠杆菌菌株,TN5960 TN5962,来自野生型XL1-Blue转化质粒pCM699和pCM655 / DapE,分别。分析可溶性细胞提取物TN5960 TN5962, sds - page显示另外一个物种的存在约42 KDa的细胞窝藏pCM655 / DapE(即。、应变TN5962),对应的预期规模重组美国血清DapE在大肠杆菌。

测试l卡托普利抑制、适当稀释的压力(例如,TN5935和TN5959)在选择板有无mDAP传播。传播文化,后无菌纸光盘浸泡在几个浓度l卡托普利被放置在每个板;另外,给定的化合物被以粉末形式直接定义站点琼脂,这样它可以由一个纸盘,随后10μL无菌水的添加磁盘上的仔细。一夜之间,这些选择板块被孵化在37°C。

4所示。结果

首先,我们的增长相比大肠杆菌的存在l卡托普利,没有补充mDAP琼脂培养基中,使用disk-diffusion试验(图1和表2)。我们确认的适度抑制活动l卡托普利在大肠杆菌之前报道。然而,令我们吃惊的是,l卡托普利抗菌活性是独立于mDAP补充大肠杆菌。此外,抑制的程度也影响了不同的表达DapE(从沙门氏菌血清)大肠杆菌(数据1 (c)和1 (d))。

其次,考虑到过度的DapE美国血清在大肠杆菌并不影响l卡托普利抑制,我们着手确认DapE质粒是DapE表达功能。正如之前报道的(13),DapE淘汰赛(TN5911)美国血清只有当携带质粒携带生长dapE基因(pCM655 / DapE,在应变TN5935)或通过与mDAP补充中,来自本地产品的DapE水解活动,l,l衣冠楚楚的。因此,应变TN5935 plasmid-encoded(港口dapE基因)增长即使没有mDAP补充,因为它能产生自己的衣冠楚楚的细胞壁合成。消极的控制,我们证实了基因敲除株窝藏相应的“空质粒”(但是没有提供氨苄青霉素抵抗dapE基因;应变TN5959)没有生长在没有mDAP补充。

第三,我们测试的生长抑制l卡托普利在这些不同的重组菌株美国血清。我们假设如果l卡托普利是抑制DapE在细菌中,然后mDAP补充或DapE过度会减轻药物的抗菌效果。令人惊讶的是,l卡托普利抑制的增长TN5959(窝藏空质粒)尽管添加mDAP(图2和表3)。我们还测试了是否适度l卡托普利抑制可以克服DapE超表达。也在这里,我们惊奇地发现,类似的l卡托普利抑制应变TN5935 (overexpressing DapE),即使mDAP另外补充的媒介。

菌株的抑制是稍微带TN5935 TN5959相比,虽然这种差异是非常微妙的,只能看到当纸磁盘浸泡在25毫克/毫升浓度和50毫克/毫升,但不是当添加了20毫克(表3);在后者的化合物,抑制的程度是显著和TN5959中观察到的一样。我们推测,这略高l卡托普利抑制的应变overexpressing DapE (TN5935)与TN5959是由于细胞的高代谢负载DapE过度引起的。

综上所述,这些数据强烈建议l卡托普利适度抑制两种美国血清和大肠杆菌类似的程度,但DapE-independent的方式。

5。讨论

二氨基庚二酸是一种重要的前体在许多细菌细胞壁的合成,包括大肠杆菌和美国血清(5,15]。抑制DapE从流感嗜血杆菌体外和抑制大肠杆菌通过l卡托普利在细菌中最近报道(3]。的过程中保持酶的变异的变异特征沙门氏菌血清DapE,我们决定测试DapE的抑制l卡托普利在细菌中。我们假设如果l卡托普利被抑制DapE抑制细菌生长,然后mDAP增长媒体克服drug-inhibition补充。然而,我们发现我们的惊喜l卡托普利抑制细菌菌株(美国血清和大肠杆菌DapE-independent的方式)。

假定的底物结合位点和金属协调残留DapE非常保守的大肠杆菌,美国血清,流感嗜血杆菌,所有这些都被认为是相似的双核的metal-centres和相同的催化机理4,7- - - - - -9]。因此,考虑这样的结构和功能之间的保护DapE从这些不同的细菌,它预计将l卡托普利能抑制不同的同源染色体在类似的方式,证明潜在活性broad-selectivity抗生素。值得注意的是不同亚型的DapE(例如,从不同的生物体或与不同的金属内容)可以抑制不同,因此很难找到一个针对DapE广谱抗生素。我们的数据表明,l卡托普利不是广谱抗生素针对DapE细菌,因为它既不DapE目标大肠杆菌也不是在美国血清。自抑制的程度l卡托普利在细菌中类似于我们所有的实验吗大肠杆菌和美国血清DapE和独立,我们表明,适度的抗菌活性的化合物可能是由于抑制hitherto-unidentified DapE以外的金属离子。

总之,我们的结果表明,尽管DapE的报道抑制流感嗜血杆菌通过l卡托普利在体外不太可能,DapE抑制导致任何重要的革兰氏阴性细菌的抗菌活性的文化。因此,l卡托普利是一个温和的抗生素,在高剂量抑制革兰氏阴性细菌,但其作用机理或分子目标仍然是未知的。

最后,考虑到DapE抗生素的目标,是一种很有前途的铅化合物,抑制DapE的失败在体外表现出任何可测量的anti-DapE效果在细菌中提供了一个令人清醒的提醒:翻译的困难在体外数据的影响体内,即使在纯微生物文化。然而,尽管我们发现卡托普利并不导致DapE抑制细菌,其他(更有效)DapE抑制剂的发展在体外和在活的有机体内仍然是一个非常有价值的目标和承诺的研究向新的抗生素。我们建议mDAP补充,这里所描述的那样,将提供一个简单,非常健壮的方法,针对DapE确认新抗生素的选择性在细菌中。

确认

作者想表达感谢瑞士国家科学基金会的资金支持格兰特(200021 - 116344),从一个居里夫人重返社会格兰特(fp7 perg03 - ga之下,2008 - 231112年),和行动TD0905和CM0902成本。m .幅特别感激的支持Treubel-Fonds(巴塞尔)。作者还想承认教授托马斯·r·沃德一般鼓励和允许使用的实验室设施以及教授查尔斯·g·米勒(伊利诺伊大学)为他的慷慨的捐赠有价值的研究资料和见解。