文摘

可扩展系统的力场的效用(ESFF)检测铜(II)绑定34-amino-acid铜(II)肽,其中包括五个组氨酸残基,是公认的铜包赖氨酰化氧。为了提高计算效率,距离几何计算被用来约束所有的组合三个组氨酸配体结合距离内的铜和最好的结果是利用结构ESFF开始计算。所有可能的铜几何图形建模,但结果显示只有很少依赖几何模型在所有导致扭曲的广场锥体几何对铜、咪唑环的导向很差对铜(II)、结扎和copper-nitrogen债券距离太长。结果表明ESFF应该小心使用铜(II)配合物在copper-ligand债券有显著的共价当配体不平面几何约束。

1。介绍

肽和蛋白质相互作用的分子建模与过渡金属离子的承诺阐明各种各样的生物物理现象。这种模拟可以帮助建立两个原生金属蛋白和金属酶的结构和反应路径解释金属离子的角色在蛋白质折叠和稳定1]。然而,这种模拟的有效性主要取决于准确的可用性和计算可靠的金属离子与蛋白质交互力场。常用的经典力场决心使用核磁共振或其他核间距离数据结构设计和参数化的蛋白质,核酸,碳水化合物,因此不是最优的系统与金属离子有关。可扩展系统的力场(ESFF) [2]试图提供尽可能广泛的元素周期表的报道包括过渡金属与合理的准确性和已经成功用于模型等蛋白质含有金属钠、锌,铁,钴(2- - - - - -5]。然而只有少数研究已经报道了铜(II)化合物,其中大部分已经严格限制配体几何图形(3,4,6],ESFF已很少用于铜蛋白质或肽(6- - - - - -8]。我们最近建模了赖氨酰化氧铜包的地点使用34-residue肽酶同源的假定的铜包区域(9]和我们现在的结果ESFF计算模型的结构铜肽有助于澄清肽的结构和调查工具的ESFF铜(II)的配体化合物具有一些几何约束如那些常见生物无机的复合物。

赖氨酰化氧(EC 1.4.3.13, LOX)是铜,quinone-containing胺氧化酶催化氧化脱氨基作用的弹性蛋白和胶原蛋白肽基赖氨酸 -aminoadipic - -semialdehyde,第一步形成的交叉连接,稳定这些结构蛋白(10- - - - - -13]。Lysyl氧化酶类从许多不同的来源显示一个非常高度的同源性,特别是在c端端,其中包含铜和醌绑定网站。有人建议,液态氧的活动需要一个紧密地绑定铜(II)原子在其活性部位(14,15),尽管这一直是有争议的16]。更完善,铜(II)的转译后的修改需要酪氨酸- 355生产lysyl酪氨酰醌(LTQ),赖氨酸- 320与羰基代数余子式,在活性部位的中心17]。

液态氧不是很可溶性除了存在高浓度的尿素和难以获得很大收益。迄今为止的酶没有结晶,没有报告核磁共振实验,只有有限的EPR和CD特征有可能(9,15,18];因此对其三级结构几乎是一无所知。有限的实验数据表明,铜配体和几何中发现类似topaquinone-containing铜胺氧化酶类(曹),涉及三个组氨酸配体(19- - - - - -23]。克雷布斯和Krawetz24)利用各种计算机预测模型,提出一个结构模型在液态氧铜包网站涉及问题区域残留280年和310年之间(使用人工酶)的编号系统。他们得出结论,三四个组氨酸(即289、292、294、296)可能是铜配体与第四个可能成为一个将军基地催化机制。在目前的工作我们有跟进的光谱研究铜(II)绑定LOX-derived肽包含这些残留物(9与ESFF计算),更好地描述区域与LOX帮助识别铜配体和评估的有效性ESFF metallopeptide和金属蛋白结构预测。

2。方法和材料

34-residue肽的氨基酸序列,意思是,为本研究选择包括液态氧(假定的铜包地区24),给出了如下:

RPRYSWEW SA 问 Y SMDEFS -YDLL DASTQRR - 。

我们之前报道的光谱研究铜约束力的意思是(9原因实验我们取代残渣11],在液态氧是一种半胱氨酸参与二硫键(25),不可用铜的绑定,丙氨酸。因此,我们使用相同的替代模型研究。

分子建模研究进行Indigo2R10,000 SGI工作站,使用修改后的26]DISGEO软件包的随机度量化哈维尔距离几何算法仿真(27),InsightII从Biosym软件包。Technologies, Inc .的图形界面大师(薛定谔Inc,俄勒冈州)是用于进一步分析和可视化生成的分子结构。

利用几何过程的相对较高的速度距离,我们第一次使用距离几何计算提供起始结构更复杂的优化方法。初始几何图形生成的肽是建立序列作为一个扩展使用标准氨基酸构象债券长度、角度、和二面角角度。这些进行apo-peptide标准程序后,已审核(28]。肽债券约束留在他们的反式配置。溶剂不包括在内。典型的输入DISGEO包括主序列和距离约束。

虽然我们之前CD和执行1这个肽(H NMR实验9),没有实验检测和二级结构图案copper-free肽主要采用无规卷曲构象。实际上模拟铜包网站没有引入铜,我们添加了组氨酸选择之间的距离约束建模的铜配体,与铜的假设有三个组氨酸配体。因为没有实验基于一个距离得到核磁共振肽的研究,我们选择了核间距离的模拟铜包网站基于copper-ligand距离从文献中获得。每组三个组氨酸七距离限制,如表所示1,介绍了强制配体原子相互接近,使铜复杂的形成成为可能。这些限制原子之间的距离,满足三角不等式,然后随机选择使用随机度量化过程(28]。获取几何首尾一致的数据,提高订单的不平等,比如tetrangle不平等,可能包括,但这些更难以实现和计算密集的系统涉及超过100个原子。因此,距离几何程序,我们使用的版本标记只侵犯三角不等式。

表1
典型的距离约束距离几何仿真的输入文件。

晶体数据不同氮含量小无机铜配合物配体(28- - - - - -31日)被用来建立上下限制这些距离约束。Copper-histidine氮配体的距离在不同的铜胺氧化酶类,认为类似铜环境在液态氧,通常在1.9和2.1之间(19- - - - - -22]。因此,n n切断氮的任意两个组氨酸的距离不超过4.2或3.0,对应N-Cu-N 18角 和9 ,分别。我们选择上trans-N-N距离是6.0,最大允许的程序和上层cis n n距离是4.2,不限制在模拟肽构象变化的发生,和下n n的距离是3.0。这个范围广泛,连同低数量的应用限制,允许我们更好的寻找最有利的几何构象。铜的胺氧化酶类,组氨酸发现铜的协调 和 氮(19- - - - - -22),因为都是可能性在液态氧,这种额外的距离纬度也允许要么选择适应。所有18个可能的组合含有组氨酸残基的三肽序列中(His9、His12 His14, His16, His23),允许对顺式和反式异构体的组合都是模拟的。数值约束在表的一个示例1。分析获得结构并没有发现违反上下距离限制。由此产生的结构进行了分析与最小的总误差收敛和构象被选为进一步能量最小化计算。

最好的坐标距离几何结构被用作最初起始结构与铜离子的能量最小化合并作为一个自由离子的电荷 2。总装配包括34个氨基酸(614重原子)和一个铜离子的模拟蛋白质在真空内。质子化作用的氨基酸侧链是基于标准pKa价值观和pH值为7.0。具体这些几何图形应用潜力的金属离子(表根据ESFF库列表2),但没有限制氨基酸可以铜配位体;所以整个过程将探索构象空间。我们首先进行了离子能量最小化 选择ESFF库。然后,利用的可能性ESFF力场(2)我们使用这个结果作为起点进行模拟的各种协调ESFF图书馆的数字和几何图形。我们尝试了所有十环境表示在表2但是发现不同的几何图形为每个配位数只导致由此产生结构的细微差异;因此,我们只对三个案例进行了更广泛的分析,即four-coordinate铜 对称,five-coordinate铜 对称,six-coordinate铜。这些数字代表不同的协调(4、5、6)和最低的可用对称金属离子配位几何限制尽可能低。调查变化会减少,我们也进行能量最小化的肽离子铜的 1负责。

表2
ESFF库列表(观点二世对铜)。

所有能量最小化计算利用最陡下降算法优化后的第一部分的共轭梯度法(32]。所有运行的收敛性判据为最大衍生品是0.01千卡/摩尔/。检查结构并不是被困在一个错误的能量最低,我们也调整了导数为0.001,这样Cu024结构受到更长的能量最小化运行。这导致能量差别可以忽略不计,表明确实取得的最低配置。非键相互作用进行评估截止距离12和开关2的距离。模拟水溶剂条件下,整个肽被淹没在水分子的壳10厚,通常包含1050个水分子。这水壳就首先受到一个最小化,然后优化溶剂系统组装肽和能量最小化。没有约束应用于peptide-solvent组装,提供完全的自由的动力学模拟整个溶剂化肽。

3所示。结果与讨论

使用距离几何模拟导致86结构没有违反上下距离限制。最小的总误差的构象被选为进一步能量最小化计算。距离几何模拟导致快速和有效的抽样有利apo-peptide构象的组氨酸残基被认为是铜配体(图聚集在一起2)。铜被添加到这个网站在一个位置,这样距离组氨酸问题都大致相等,和能量最小化过程进行了利用ESFF C 参数。利用这个结果作为起点,然后进行能量最小化计算对十个不同的铜铜(II)选择的几何图形ESFF图书馆。尽管距离几何计算利用距离约束以确保三个组氨酸配体接近彼此,这样都可以绑定到一个铜离子,能量最小化过程涉及到没有这样的约束和组氨酸自由移动远离铜。自不同的几何图形配位数给了非常相似的结构,我们限制我们的讨论代表Cu024 Cu025, Cu026,离子C 用例。


图1
铜网站用于开发模型的距离约束用于分子动力学计算表中所示的示例1。
(一)
(一)
(b)
(b)
图2
apo-peptide之前的结构(a)和(b)后距离几何模拟。

PROCHECK程序(33)是用来评估的整体质量最小化几何图形。最低的总势能为模拟五种铜和立体化学参数的分析是基于一个拉马钱德兰情节(34]。鉴于氨基酸与铜往往有些扭曲的键角,所有模拟给合理的键角和残留在允许的数量 - - - - - - 地区的拉玛钱德朗情节相当或优于典型值计算使用PROCHECK从晶体数据库(33]。肽的结构与four-coordinate铜、Cu024,给了最后的能量最低,最快的收敛,最少的氨基酸残基与不利的角度、长度和最合理的债券(表3(a))。所有最小化结构显示显著提高立体化学的几何参数对结构所产生的距离。

表3

二级结构分析的模拟结构显示没有任何二级结构的图案,除了少量的 词(图3(一个)),这是符合我们的CD试验肽意思是(9]。将铜离子进入apo-peptide(我们尝试的几何图形)导致了轻微的变化 词的内容,但没有额外的结构图案。均方根偏差值为0.45 (RMSD)叠加骨架原子的溶剂化和无水的结构确认的构象多肽也只有当溶剂化确实发生了轻微的变化。在我们所有的模拟几个芳香暴露在溶剂残留,符合穷人溶解度我们观察到的肽(9]。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
(a)为Cu024 CuP34对称的结构能量最小化。肽链所示黄色,随机线圈在绿色区域,β词用蓝色区域。组氨酸残基是红色的。铜(II)离子在红色。(b)的叠加CuP34结构获得Cu024和Cu025对称性显示他们有非常相似的构象。

所有模拟导致肽构象的骨干(图非常相似3 (b)),但一些铜的几何形状的变化。附近的核间距离和选定的原子间键的角度总结了铜表3(一)和3(b)和铜的几何图形网站图所示4。铜的位置和其最近的残留非常相似的模拟Cu024, Cu025,和Cu026类型的对称,但明显不同的C 模拟。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
铜网站为不同的几何图形ESFF协调数字:(a) C 、(b) Cu024 Cu025 (c), c (d) 。

结果C 计算如图4(一)和表3。只有三种配体在2.4的铜、肽的羰基氧原子Ser22 (O1群)和咪唑Nε氮原子His9 His16。没有其他原子与协调能力在3.7的铜虽然His23戒指,Gln13的侧链酰胺氧气(OE1或O 1),和一个solvent-derived水分子(O366)位置对应于预期配体位置大约在铜的八面体几何。

在所有其他ESFF模拟的直接协调环境这些相同的铜离子由六个残留在一个扭曲的八面体几何,但随着距离大大缩短copper-ligand Gln13, His23, O366。金字塔的底部对应于一个四边形和不平等,与配体原子N顶点 氮原子从His9 His16,氧原子从Ser22和Glu13。尽管协调原子基配体的三个,NεSer22 His9、O1, Oε1 Glu13,躺在一架飞机含有铜,第四,N His16,略高于这个平面。两个氮和两个羰基氧原子是反式(图4)和一个水分子占据了轴向位置。此外,His23结合距离内的铜位置相对协调的水,虽然它也不是面向正确的铜氮协调。因此,几何是最好的形容为一种扭曲的广场金字塔。Cu025和Cu026结构几乎是重叠和特点是copper-ligand债券距离2.7 -2.9,大大超过预期的基础上为小分子晶体数据铜和铜蛋白质复合体。尽管Cu024网站非常相似的几何形状的Cu025 Cu026,站点(图5),copper-ligand债券Cu024结构长度明显短和Cu-O债券长度(2.13 - -2.19)Cu-O债券通常预期范围内的值(35]。Cu-N债券的长度,然而,仍为0.4大于正常,这表明ESFF计算涉及铜可能不充分将债券共价贡献软氮基地。虽然Cu024站点的几何相似的Cu025和Cu026网站大部分的配体在不同的方向。


图5
比较的铜网站Cu024(红色)和Cu025(绿色)结构。

由于低copper-nitrogen债券长度,总能量越低,不宜氨基酸构象越少,我们认为Cu024结构是最真实结构的可靠指标。然而,所有的4 - 5 -,6-coordinate铜几何图形表中列出1给了惊人相似的结果,表明ESFF模型的配位数的选择不是决定的。此外协调几何为ESFF字段选择对最终的结构几乎没有影响。也许最令人惊讶的是,在任何情况下铜五坐标几何是最终的结果,与组氨酸(His23)第六协调网站,而不是面向正确协调铜。组氨酸配体通常绑定相当对称氮孤对指向以来的铜铜。模拟结果为His9发现这是真的,但His16组氨酸环的倾斜对铜和His23几乎是垂直于焊接铜的正确方向。结果表明,铜ESFF力场模拟的方向依赖配体。这个结果和Cu-N债券的长期债券的长度发现即使在最低能量结构表明ESFF copper-ligand的共价债券交易不佳。其他人已经报道,ESFF力场本身可能过分强调charge-charge相互作用[5),这似乎是特别重要的铜。

包含solvent-derived水配体,然而,有趣的,因为基于比较TPQ-containing曹操,人们普遍认为,液态氧铜配位至少有一个水。曹和液态氧抑制氰化物,取代了水分子和与铜结合网站(36,37]。我们先前表明,模拟使用氰化物的CFF91力场预测可以在轴向约束代替水网站(9]。

研究的影响减少铜(II)铜(I),我们反复模拟使用C 字段ESFF图书馆。这是一个很大的静电变化,导致copper-ligand债券的长度更长。结果总结在表3和铜的结构网站C C相比吗 在图6。正如预期的那样,改变铜离子电荷引起的重大变化 2 1是本地化附近的铜网站(表3)。His9 His16离开铜,而Gln13和O366(水)约1.2进一步转移到铜、和His23保持外键(如图范围6)。C 结构最相似的Cu025和Cu026结构。


图6
铜包站点C (蓝色)和C (灰色)协调几何图形显示的重排组氨酸在减少。

从我们的实验数据描述铜网站CuP34 pH7 [9)大量的证据表明,赤道配体是三个组氨酸氮原子和一个氧原子组成。不幸的是没有超精细结构中观察到的EPR谱会加强这个赤道配体的任务。EPR并没有给出关于轴向配体的信息。我们ESFF CuP34做模拟表明组氨酸三个氮原子(His9、16日和23)接近铜,但是在所有情况下其中一个面向(His23)没有正确绑定到铜。组氨酸的咪唑环12和14指出对溶剂和不接近铜的模拟。

这项工作的结果指出,重大问题的参数化ESFF模型使用铜(II)。主要的问题似乎是,共价贡献copper-ligand债券不充分结合配体的结果不够约束以确保他们孤对轨道指向铜、copper-ligand债券长度超过实验发现,和几乎没有区别不同对称性的结果对于一个给定的配位数。另外,角计算的参数化势能表达式的铜(II)还不是很完善。此外,姜泰勒效应,必然会导致长轴向债券铜(II)配合物、不充分。虽然ESFF方法已被用于各种各样的金属配合物,其中许多已组IA或花絮金属离子,债券主要是静电和配体上没有明显的几何约束38]。很少ESFF研究已经报道了铜(II)配合物,其中很多是系统与配体约束平面。施等。2]研究了几种卟啉复合物相关的金属离子、镍(II),但在这些配体几何约束也是平面的。贼鸥和Schilde3]研究了一系列four-coordinate铜(II)化合物通过氧原子与双齿配体协调与晶体结构数据,发现优秀的协议。尼克洛和Yoshikawa4)与铜(II) ESFF使用8-hydroxyquinolinate复合物,双齿平面芳香配体,运动和杰克逊(39,40建模的约束四配位基的配体。窗帘等。6)使用ESFF在淀粉体模型铜(II) 肽和三浦et al。41建模)铜(II)协调朊蛋白的八肽区域,但在这两种情况下铜平面几何约束是广场。据我们所知ESFF尚未用于铜(II)系统与monodentate配体与无约束的几何图形,这是一个更多的困难一个力场的考验。因此我们谨慎的使用铜(II)配合物的ESFF模型涉及肽或任何monodentate配体配位几何图形时,他们没有强烈的几何约束的铜离子。

确认

作者感谢戴尔博士f . Mierke距离几何计算。他的主要贡献他们承认的唐纳德·j·纳尔逊末的援助工作,把这篇文章献给他的记忆。