病毒RNA在鸟类多样性的研究样本使用新创设计多路复用Genus-Specific底漆面板

文摘

下一代测序(上天)技术的进步大大增加我们检测到新的病毒病原体的能力和系统地确定病毒流行的频谱在不同的生物样品。此外,这种方法也帮助建立viromes许多疾病的关联。然而,与宏基因组研究使用16 s核糖体rna的检测细菌,是不可能创造普遍寡核苷酸目标所有已知的和新颖的病毒,因为他们的基因多样性和可变性。另一方面,整个基因组测序仍然昂贵,已经为这类应用程序相对较低的灵敏度。寡核苷酸的设计有针对性的现有方法浓缩通常参与开发引物的pcr检测特定的病毒物种或属,但不是为家庭或更高版本分类命令。在这项研究中,我们已经开发出一种计算管道设计寡核苷酸能够覆盖大量的已知病毒在不同分类订单,以及他们的小说变异。随后我们已经设计了一个genus-specific寡核苷酸面板有针对性的浓缩病毒核酸的生物材料,并演示了其应用的可能性在鸟类病毒检测样品。我们已经测试了我们的面板使用数量的样本收集和观察优越的病毒病原体的检测和识别的效率。从一个可靠的,bioinformatics-based快速识别的序列分析方法是至关重要的,一个NGS-based数据分析模块是在这项研究中,开发及其功能的新型病毒的检测和分析virome多样性了。

1。介绍

全球化的增加,气候变化,和互动与家畜动物导致小说的出现病毒性病原体或人畜共患病1),鸟类和动物造成严重的健康问题,最终对人类。病原体的天然水库,比如鸟类、蝙蝠、啮齿类动物,吸血节肢动物发挥重要作用在食物和人畜共患传染病的传播。候鸟值得特别关注,因为他们的丰富多样性和迁徙行为导致感染扩散的相当大的距离。这样的迁移与流行性和地方性动物病暴发的出现以及自然的形成和激活病毒感染的来源。野生鸟类被广泛承认的水库和发射器等新兴传染病病原体负责严重急性呼吸道综合征病毒(SARSV)禽流感病毒(H10N7),和西尼罗河病毒(西尼罗河病毒),国内动物和人类2,3]。丰富的生物多样性的野生鸟类种群可能会增加病原体驯化家禽传播的风险。理解病毒的多样性是至关重要的预测未来的风险传播或可能的病毒性疾病的暴发。然而,识别和监测小说的传播病毒的疾病暴发应对至关重要的条件之一。运输无症状的病毒,这可能归因于某些特征的鸟类代谢和免疫系统的自适应能力,为进化提供了理想的条件,导致病毒的变异和重组菌株的出现。因此,大多数的广泛使用的分子诊断方法,如采用聚合酶链反应(PCR),不够适合识别各种各样的病毒,随着技术通常用于检测基因组的高度保守的区域,这限制了搜索限制群病毒代理和阻止新病毒或病毒变异的识别。此外,桑格测序技术,它一直是一个标准的诊断工具的各种病原体的检测和识别,提供有限的每个核苷酸序列信息以更高的成本基础,只能用于识别病原体与效价很高。此外,初步的证据的存在需要执行某些病毒PCR,没有病原体识别的过程可以花费大量的时间,这可能是一个主要障碍的预防和控制感染。

DNA条码技术是一种方法使用一个简短的生物体基因组的一部分(所谓的条形码)来确定它是否属于一个特殊的家庭,属,甚至物种,通过使用大规模并行测序技术(或更常见的门店[下一代测序])。这种方法最初是为研究细菌社区开发的(例如,研究肠道微生物群),但今天它被广泛用于各种任务,包括食品掺假检测(4),研究海洋社区的饮食(5),和生物燃料分析(6]。与其它类群、病毒缺乏一个普遍共享系统发育标记(如16 s为细菌,细胞色素C氧化酶鸟类和哺乳动物,:和matK对植物和内部转录间隔区(它的)真菌或植物),这使得它不可能设计一个通用引物对扩增病毒和区分不同的序列。此外,病毒分类可以让我们更好地指示引起的疾病的迹象,而不是遗传相似性。这个事实使条形码(短、标准化的一个有机体的DNA的核苷酸序列)的选择,即使对于一个属(例如,mammarenavirus血清学,系统,和在地理上分为两个主要的复合物:旧世界复杂的流行在非洲,欧洲,和亚洲,和新的世界复杂的发现在北美和南美7),更不用说更高的分类单元。然而,宏基因组仍然允许不同的病毒病原体的检测使用猎枪测序(8]。尽管不断减少DNA测序的成本,这种方法仍然是相当昂贵和不可行筛选大量的样本。同时,宏基因组门店数据集通常主要由host-derived病原体序列的序列,只有一个小零头。通常,即使最初未知病原体的近似分数内容,使它几乎无法估计有多少需要测序读每样例中,为了检测病原体在最后测序数据文件。对于大多数NGS-based测试另一个常见的问题是复杂的多步工作流可能构成挑战的再现性的结果。最近,布莱士et al。9]了virome捕获测序平台脊椎动物病毒(VirCapSeq-VERT),由200万~生物素化的dna探针为目标浓缩病毒核酸序列的敏感性增加病毒的检测和表征。描述方法允许识别(甚至可能对整个基因组进行测序可辨组装检测到病毒)的大量病毒,包括小说的。然而,测序样品的总成本仍相当高。

浓缩的其他方法是基于目标放大的cDNA地区使用genus-specific PCR引物配对。这种方法已经知道了很长一段时间(10)由不同的研究人员,并已成功应用在单个病毒属的代表的研究和分析病毒的多样性在不同类型的生物材料11- - - - - -13]。直到最近,描述了大量这样的引物(14- - - - - -16]。然而,他们中的大多数是为某些种类的病毒的检测。此外,它是不可能使用它们在复合反应由于primer-specific退火温度,非特异性扩增,和潜在的self-complementarity。因此,为了分析一个样品,需要进行大量的PCR实验对应引物对的数量。研究的有效性可以通过结合显著增加genus-specific PCR和门店。在这种方法中,不同的PCR检测的产品样本将汇集在一个管,净化,筛选了在最小的体积,和准备挥动17]。然而,这种方法并不免除许多pcr /样品的要求,这是一个问题,当大量的样品同时进行了研究。此外,有限制的使用不同的协议为图书馆准备,特别是当协议包括乳液聚合酶链反应阶段,严格要求PCR产品相同的长度。

在这项研究中,我们引入了一个方法来设计寡核苷酸靶向病毒核酸的浓缩,面板,主要目的是使用最小数量的底漆寡核苷酸的最大数量的不同病毒分类群在单一PCR反应。我们应用这种方法为目标设计genus-specific底漆对浓缩人畜共患的互补脱氧核糖核酸病毒和评估使用了样本鸟类。我们还演示了一个相当大的病毒基因组覆盖率的增加。

2。材料和方法

2.1。Genus-Specific引物的设计小组

本节包含的技术细节的算法genus-specific底漆面板的设计。让我们来处理浓缩PCR反应在一个管,许多限制参数应用于寡核苷酸的位置和结构。的可用性验证参考病毒核酸序列算法的有效使用是至关重要的。尽管一些病毒参考序列数据库是公开的(18),相关的医学和生物模型在很大程度上是过多的,和流行株的基因组多样性往往是弱势。这样的一个来源是开源数据库”的病毒病原体数据库和分析资源(ViPR)”(19),这是在2011年开发的。这个数据库的最重要的优点是核酸序列的真实性,策划和管理的数据专家在病毒学和生物信息学。这个源用于检索目标病毒属的聚合酶基因序列(或其他基因的聚合酶基因序列的情况下不可用)。序列是由长度过滤(≥400个基点),质量和intrageneric相似,并结合相应的FASTA文件。

为了创建共识序列,核苷酸序列在每个FASTA文件特定于属一致使用ClustalW [20.]。如果至少两个共识子序列长度最多20个英国石油(bp)和四个模棱两可的立场与小核苷酸频率≥10%的人不确定,原FASTA文件迭代集群使用CD-HIT [21),降低门槛。集群获得每一步都对齐的独立使用ClustalW识别共识子序列(s)的子集,它必须集体代表至少90%的属内不同的物种。最后,至少有一个对齐FASTA文件得到每一个属。

从多个序列中提取公共子序列的比对,用“滑动窗口”的指定范围内的长度。这个窗口“幻灯片”的5 ' - 3 '端对齐一个核苷酸的步骤和识别所有子序列满足以下标准:(我)比例的模棱两可的位置(P_AMB)≤20%;(2)比例的独特物种,共享子序列的和不含缺口(P_上海)≥50%;(3)GC的共识序列(内容P_GC在35 - 65%区间);(iv)缺乏自补区域;(v)没有形成为;(vi)缺乏与先前选定的寡核苷酸形成的形成。

两个子序列之间的扩增子的长度(底漆)然后调整200至400个基点,使面板最受欢迎的测序平台兼容(例如,Illumina公司MiSeq或离子S5从热费希尔科学)。两个子序列被认为是一对如果他们一起覆盖至少90%的物种相关目标属或集群和共享超过90%的物种。对被过滤根据其退火温度≤(50°C≤55°C)。所选引物对当时与NR数据库使用爆炸来检查他们的特异性。非特异性的候选人被淘汰。形成序列之间形成的可能性,和之间的序列和先前选择的引物,使用软件计算Primer3 [22]。然后对上述参数进行计算,并对相应的排序。“最好”的引物对被选为“genus-specific一对。”

上述参数被计算,并对相应的排序。最适合的一对引物被选为“genus-specific一对。”

引用的引物序列对病毒属,设计使用开发算法,介绍了表1和2。

2.2。控制样品

开发小组的能力丰富的目标cDNA人畜共患RNA病毒是评估使用高效价病毒RNA(浓度从10的解决方案⁵到10⁷拷贝/毫升)从24种病毒,属于13个病毒属病毒在12科(表1)。病毒rna是来自集合存储在中央研究所流行病学,莫斯科,俄罗斯。所有病毒rna都储存在−70°C到进一步研究使用。H₂O无菌(AmpliSens、俄罗斯)被用作负控制实验。

控制样品cDNA通过逆转录反应上执行5μL使用Reverta-L RT工具包(提取的RNA AmpliSens;反应混合物的总量是20μL);之后,5μL的反应混合物的互补进一步用于评价能力的引物对扩增病毒的目标区域,在单一和复合PCR格式。

2.3。反应混合物和放大模式

PCR反应混合(25μ使用5 L)准备μL的cDNA模板,5μL H₂O (MilliQ AmpliSens) 5μL (PCR mix2聚全氟乙丙烯/ FRT, 1μL的0.2μ米的底漆(single-plex格式)或0.08μ每个引物(总浓度的3.84μ米多路传输格式),2.5μL(核苷酸(1.76毫米;AmpliSens), 0.5μL (TaqF聚合酶(AmpliSens)。热循环参数的初始变性为15分钟在95°C,紧随其后的是45 95°C的周期15年代,120年代50°C, 72°C 30年代,最终在72°C扩展了7分钟。

2.4。特异性发达面板

PCR产品适当的长度是解决含有溴化乙锭在1.5%琼脂糖凝胶电泳。PCR扩增子被纯化使用QIAquick净化设备(试剂盒),遵循制造商的指示。纯化PCR产品然后使用ABI棱镜测序3500测序仪(应用生物系统公司)确认的特异性反应single-plex格式。

2.5。样品收集

鸟样本(泄殖腔拭子和/或粪便)从叶尼塞河生态站,收集Mirnoe(俄罗斯)。样本收集从鸟类捕获使用了雾网例行鸟类或粪便留在地上的鹅停站点。为了防止污染,单独的橡胶手套和无菌棉签被用于每个样本的集合。样本存储在集合地点在4 - 8°C长达30天,然后在室温下四天在运输,最后在2 - 4°C在处理。样本存储在传输介质为0.5毫升管拭子包含存储解决方案(AmpliSens)。

样本来自以下种鸟类:针叶林Bean鹅(雁属fabalis johanseni)、西伯利亚鹅口疮(Geokichla sibirica),歌曲鹅口疮(Turdus philomelos)、田鸫(Turdus毛发角化),红翼鸫(Turdus髂肌),包括黑鹅口疮(Turdus atrogularis),常见的燕鸥(胸骨hirundo)、绿色鹬(Tringa ochropus),常见的青足鹬(Tringa nebularia)、红喉捕蝇器(Ficedula albicilla),Temminck阶段(Calidris temminckii)和昏暗的莺(中国东北部fuscatus)。没有鸟在这项研究中受到伤害。92鸟样本用于进一步virome分析,其中62个样本属于6到西伯利亚针叶林Bean鹅和鹅口疮。

2.6。RNA提取和反转录

从100年总RNA提取μL resuspended样本与RNeasy脂质组织的迷你包(试剂盒)使用机器人工作站QIAcube(试剂盒),遵循制造商的协议。互补脱氧核糖核酸是通过逆转录反应在10μL使用Reverta-L RT工具包的提取的RNA (AmpliSens),根据制造商的指示。

2.7。底漆面板测试与控制样本

底漆面板测试(表参考的样本1)。结果呈现在图1。在所有情况下,产品的指定范围的长度。

多路复用系统然后用同一套测试病毒和PCR产品使用genus-specific reamplified底漆对。在所有情况下,非特定的放大观察。然而,与genus-specific reamplification反应引物显示目标产品的存在。多路复用系统是第一次测试三个蝙蝠样本被几个已知病毒感染(示例N1:Betacoronavirus样例N2:Betacoronavirus样例N3:Orthoreovirus)。reamplification的PCR产物进行了genus-specific引物(图2)。结果清楚地表明产品的存在目标三个样品的长度。

2.8。准备和测序的离子S5库

目标序列被多路复用与设计引物PCR浓缩池上面描述(表2)。PCR产品清洗使用carboxyl-coated磁性粒子,商用Sera-Mag速度珠子(通用电气医疗集团)。片段的浓度测定采用量子位dsDNA海关化验设备量子位2.0荧光计(表达载体)。

扩增子库的制备涉及磷酸化的5 '端并整合编码适配器,紧随其后的是放大最终的图书馆。为此,T4多核苷酸激酶和T4 DNA连接酶(来自新英格兰生物学实验室,内)是根据制造商的协议使用轻微的修改。放大了使用PCR-mix 2聚全氟乙丙烯/ FRT (AmpliSens)。

离子S5的两个总RNA库高通量测序是准备从两鸟总RNA样本(B23和B66)。互补脱氧核糖核酸合成第一链使用随机引物和Reverta-L RT工具包(AmpliSens)。第二链cDNA准备NEBNext超第二链合成模块设备# E7530(内)。双链DNA是由离子剪切分散+试剂盒(热费希尔科学)和库制备进行了使用离子Xpress +片段库套件(热费希尔科学)根据制造商的指导。

最终库的质量评估在安捷伦2100生物分析仪(安捷伦基因组学),采用安捷伦高灵敏度DNA工具包(安捷伦基因组学)。1.7%琼脂糖凝胶电泳分离扩增子库和溴化乙锭染色,和目标长度的片段被剪和使用MinElute凝胶萃取净化设备(试剂盒)。大小的选择最终的总RNA库使用2% E-Gel™SizeSelect™II琼脂糖凝胶(热费希尔科学)E-Gel电泳系统(热费希尔科学)。

测序进行离子S5平台使用离子520/530 Kit-Chef试剂样品制备设备和采用离子530芯片离子厨师仪器(热费希尔科学)。

2.9。生物信息学分析

从平台获得原始测序读第一次过滤使用PRINSEQ-lite工具(23)来消除太短(< 80个基点)和低质量(min_mean < 20)碎片。均值、中位数和10和90百分位数的读取长度的分布选择过滤FASTQ文件补充表所示S1。BWA软件(24)然后使用对齐过滤读取参考鸟类基因组数据库。理想情况下对齐读取(完整读取长度和没有不匹配)被标记为病毒的读取和消除。软件CD-HIT [21)被用来减少冗余,即。,the number of reads per sample, by clustering (with a similarity threshold 90%) and selecting the representative sequences for each cluster. Briefly, the CD-HIT algorithm sorts the sequences from long to short and processes them sequentially. The first sequence is automatically classified as the first cluster representative sequence. Then each query sequence from the remaining sequences is compared to the representative sequences identified before it and is classified as redundant or representative based on whether it is similar to one of the existing representative sequences. The described filtering and clustering steps significantly reduced (by ~100 times) the computational time of the further steps. The software BLAST was then employed to first compare the representative sequences (RS) against virus-only nucleotide and protein databases that were collected by selection of virus sequences from GenBank NT and GenBank NR databases, respectively, to identify viral nucleotide candidate RS (nRS) and protein candidate RS (pRS) with E-value cutoffs of 10⁵和10³,分别。因为病毒仅远小于NCBI数据库NT和NR数据库,成对序列比较快得多,最大化的速度和允许更有效的计算资源的使用。我们随后对齐这些候选人nRS和pRS整个基因库NT和NR数据库,分别以消除潜在的假阳性(序列相似性较高的病毒的参考序列比病毒的数据库)的候选人和选择真正的优点。额外的步骤应用于选择真正的阳性病毒pRS: pRS对齐NR数据库与关系,一致元数据库来消除病毒pRS,这对应关系,将病毒的核苷酸序列与高价值。了解真正的病毒总数的阅读属于相同病毒,读取的数量为每个RS最终总结。生物信息学分析的图解方案呈现在图3。

3所示。结果与讨论

一组45引物包括23个正向和22反向引物设计使用开发相应的算法和合成(表1和2)。使用可用的控制样品(表的初步分析1)表现出的能力设计引物进行有针对性的cDNA浓缩single-plex和多路传输格式。这证实了一个特定的预期长度在电泳,其次是毛细管测序(数字1和2)。

随后,我们部署底漆面板研究70鸟样本(如所描述的方法)和测序结果展示在表3和图4。只有那些样品,至少10病毒读取(过滤质量和长度)被确定在最后FASTQ文件,表中给出。等样品的测序读的总数也例证了病原体读取的百分比。与病毒的参考序列的排列顺序读取视觉检查消除大部分的潜在的工件(比如primer-dimers)。

从表明显3属的病毒(样本B11,B23,B24以粗体突出显示)有一个特定的引物对面板显示显著放大,和相应比例的病毒读取介于4.3%和43.1%之间。这证实了我们的底漆面板可以有效地丰富目标属。其他测序读属于噬菌体、细菌和宿主物种。然而,我们也观察到显著富集样品B27和还,大量的读取对应于三峡水黾鸭病毒和腺病毒,分别检测到。我们审查这些结果进一步详细地通过所有可能的爆炸分析版本的引物(因为他们非常退化)对测序读和指出,这些发现很有可能是由于非特异性扩增引物设计的其他属(gammacorona1_f和flavi_r),尽管我们没有检查通过直接实验面板,缺乏这些引物。虽然非特异性扩增允许一个更详尽的搜索,它还介绍了潜在不受欢迎的浓缩。这可能是一个问题,特别是当获得扩增子的长度超出了标准区间适合排序在最受欢迎的平台上。

我们也观察到相当数量的病毒读取对应各种属的一些样品(B27,B46,B49,B58,B66,B69),尽管没有具体的引物在面板的浓缩。读取不同的数量从0.00013%(突尼斯病毒)到2.2%(豆瓣菜白脉病毒)。后者是一种植物病毒,预计它的存在主机鸟类的粪便主要包含草。这些结果可能是由于弱,非特异性PCR扩增。

然后我们检查是否获得病毒读取样本B11,B23,B24, B27,还是由于面板设计引物的扩增。这五个样本选择表示最重要的放大,与总量的4.0 - -43.1%测序读FASTQ文件被病毒。这样做是通过重复的爆炸分析所有可能的版本的引物序列对获得的病毒读取上述样品和计算包含至少一个引物的百分比。我们发现超过99%的序列包含了引物验证小组的有效性。

最后,为了确认小组的浓缩的有效性,我们选择两个样品(B23和B66)的病毒RNA的存在使用扩增子测序数据(见表所示3)。值得注意的是,B23拥有大量读取对应于冠状病毒(43.1%)和我们的面板有特定的引物对这些属。至于B66示例中,它有一个小数量的读取对应于腺病毒(0.1%),但是我们没有为他们设计寡核苷酸。然后我们准备总RNA-seq这些样本库,并随后测序,屈服~ 450万读/样品。的百分比冠状病毒读取B23样本被发现明显降低(0.2%)比以前丰富了相同的样本(表中所示的面板4)。至于B66示例中,我们发现,0.05%的读取属于Adenoviridae家庭,他们中的大多数被确定为类似于鸭和Psittacine腺病毒。这类似于阅读中发现的百分比B66FASTQ文件(0.1%)底漆面板应用时,即像预期的那样,没有观察到明显的浓缩。与此同时,我们失去了~ 0.2%的腺病毒B23,但由于数据量是非常不同的两个实验,有显著放大的冠状病毒几乎一半的读取这些属;这一结果并不完全令人吃惊。因此,我们的方法可以显著减少测序的成本。除此之外,对于一个成功的识别病毒的preenriched样本,每个样本通常是100000 - 200000年读够了。

4所示。结论

在这项研究中,我们提出了一种寡核苷酸的方法设计的浓缩病毒核酸。我们使用这个方法来设计一个底漆面板,显示一个效率高的探测和识别几个病毒使用门店测序。这是特别重要的检测已知病毒坚持自然人畜共患水库包括鸟类、蝙蝠、啮齿类动物,那些有较高的遗传多样性,和那些可能对人类和动物具有潜在危险的。这些因素使得快速测试系统的开发必不可少的有效管理潜在的流行。

描述方法可以建议研究人员调查不同viromes跨不同类型的生物样本。我们部署面板筛选大量的鸟样,并演示了一个伟大的效率。在未来的研究中,专家组将扩大到目标更加多样化的病毒与鸟的样本和测试其他地区。

数据可用性

所有FASTQ文件用于支持本研究的发现可以从相应的作者要求(卡米尔Khafizov;kkhafizov@gmail.com)。

伦理批准

所有适用的国际、国家和/或机构动物保健和使用指南。

信息披露

早期版本的这项工作提出了一个抽象的第43位2月国会布拉格7 - 2018年7月。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

安德烈a Ayginin弗拉基米尔•g . Dedkov德国a . Shipulin和卡米尔Khafizov参与研究设计,Ekaterina诉Pimkina Alina d . Matsvay滨诉Safonova表示安娜·s . Speranskaya Ekaterina a . Blinova和Ilya诉Artyushin收集样品并进行了实验,安德烈a Ayginin和卡米尔Khafizov发达执行的算法和数据分析,安德烈a . Ayginin Alina d . Matsvay滨诉Safonova表示弗拉基米尔·g . Dedkov德国a . Shipulin和卡米尔Khafizov起草了手稿,和安德烈a . Ayginin Ekaterina诉Pimkina Alina d . Matsvay安娜·s . Speranskaya Ekaterina a . Blinova滨诉Safonova表示Ilya诉Artyushin,弗拉基米尔·g . Dedkov德国a . Shipulin和卡米尔Khafizov批准最后的手稿。

确认

这项工作是由RSF批准号17-74-20096。

补充材料

表S1:意思是,中位数,第10和第90百分位数过滤FASTQ文件读取长度的分布。(补充材料)

引用

1. b·a·琼斯d .优雅,r·考克et al .,“人畜共患病与农业集约化和环境变化,出现“美国国家科学与美利坚合众国,卷110,不。21日,第8404 - 8399页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j·s·麦肯齐和m . Jeggo水库和向量新兴病毒。”当前舆论病毒学,3卷,不。2、170 - 179年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. w·j·c . Wang Wang苏et al .,“野生鸟类和家禽之间的关系在人类H7N9病毒活禽市场和小说在中国,“《传染病杂志》上,卷209,不。1,34-37,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. v . a . Parvathy v . p . Swetha t . e . Sheeja和b . Sasikumar”检测姜黄粉植物添加剂的使用DNA条码技术,”生物制药,53卷,不。12日,第1779 - 1774页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. t·e·贝瑞s . k . Osterrieder特区穆雷et al .,“DNA metabarcoding饮食分析和生物多样性:一个案例研究使用濒危的澳大利亚海狮(Neophoca灰质),“生态学与进化,7卷,不。14日,第5453 - 5435页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. s . Jaenicke还多,t . Bekel et al .,“比较和联合分析的两个宏基因组数据集从454 -焦磷酸测序获得的沼气发酵罐,”《公共科学图书馆•综合》》第六卷,没有。1,文章ID e14519, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 冈瑟和o .楞次,”拉沙病毒。”临床实验室科学的关键评论第41卷。。4、339 - 390年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. r . Schlaberg c . y .赵s Miller g·w·普罗卡普和g·魏因斯托克,“宏基因组下一代测序验证测试普遍病原体检测,”病理学和实验室医学档案,卷141,不。6,776 - 786年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. t·布莱士a·卡普尔:Mishra et al .,“Virome捕获测序使得敏感病毒诊断和综合Virome分析,“mBio》第六卷,没有。5,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. d . r . VanDevanter et al .,“检测和分析引物PCR herpes-viral种类多样性的共识,”临床微生物学杂志,34卷,不。7,1666 - 1671年,1996页。视图:谷歌学术搜索
11. s . j . Anthony j . h·爱泼斯坦k·A·默里et al .,”一个策略来估计未知病毒的多样性在哺乳动物中,“MBio,4卷,不。5篇文章ID e00598-13 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. s.w, p . t . Witkowski b Auste et al .,“汉坦病毒在蝙蝠、塞拉利昂、”新发传染病,18卷,不。1,第161 - 159页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. c . Drosten et al .,“识别患者的一种新型冠状病毒的严重急性呼吸系统综合症,”《新英格兰医学杂志》上,卷348,不。20日,第1976 - 1967页,1967年。视图:谷歌学术搜索
14. l .郑j .唐·g·r·g·三叶草m . e . Spackman a·j·弗里曼和b . c . Rodoni”小说genus-specific广泛引物检测的furoviruses, hordeiviruses和rymoviruses及其应用实地调查在澳大利亚东南部,”病毒学杂志》的方法卷,214 - 2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 崔崔s . k . j·k·w·m .公园,和k h . Ryu“rt - pcr检测和识别的三种cucumoviruses genus-specific单一的一对引物,”病毒学杂志》的方法,卷83,不。1 - 2、67 - 73年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. m·菲b . Proebster r . m . Kinney, O.-R。Kaaden”Genus-specific检测再由semi-nested逆转录-聚合酶链反应,”美国热带医学和卫生杂志》上卷,57号6,709 - 718年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. v . g . Dedkov a . n . Lukashev a . a . Deviatkin et al .,”两人狂犬病病例的回顾性诊断高通量测序,”临床病毒学杂志卷,78年,第81 - 74页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. m . y加尔佩林、x m . Fernandez-Suarez和d·j·里格登“第24届核酸研究数据库问题:回顾和即将到来的变化,“核酸的研究,45卷,不。9日,第5627条,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. b·e·皮科特·e·l·萨达特y . Zhang et al .,“ViPR:一个开放的生物信息学数据库和分析资源病毒学研究”核酸的研究,40卷,不。1,D593-D598, 2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. m·a·拉金g . Blackshields n . p .布朗et al .,“Clustal W和Clustal X 2.0版本,”生物信息学,23卷,不。21日,第2948 - 2947页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. w·李和a . Godzik“Cd-hit:快速聚类和大组蛋白质和核苷酸序列相比,“生物信息学,22卷,不。13日,1658 - 1659年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. a . Untergasser Cutcutache, t . Koressaar et al .,“Primer3-new功能和接口,核酸的研究,40卷,不。15日,p . e115, 2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. r . schmied r·爱德华兹,“质量控制和预处理宏基因组数据集”,生物信息学,27卷,不。6,863 - 864年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. h·李和r·杜宾“快速而准确的短阅读符合burrows - wheeler变换,“生物信息学,25卷,不。14日,第1760 - 1754页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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