科威特住院呼吸道感染患者中循环的混合病毒感染

摘要

本研究的目的是确定呼吸道感染住院患者的病毒混合检测频率，并评估病毒混合检测与临床严重程度的相关性。应用敏感分子技术对住院的呼吸道感染(RTI)患者进行15种呼吸道病毒检测。2010年9月至2014年4月共筛查住院患者850例，年龄3天至80岁。在351例(47.8%)确诊的病毒感染患者中，49例(14%)出现了病毒混合检测，其中人鼻病毒(HRV)是最常见的混合检测病毒(7.1%)，其次是腺病毒(AdV)(4%)和人冠状病毒- oc43 (HCoV-OC43)(3.7%)。病毒混合检出率最高的是HRV和AdV(2%)，其次是HRV和HCoV-OC43(1.4%)。肺炎和毛细支气管炎是最常见的住院原因(9.1%)。毛细支气管炎混合检出率与单纯检出率差异有统计学意义()及肺炎(）.我们的发现可能表明，与单次检测相比，呼吸道病毒混合检测与发生更严重的LRTI(如毛细支气管炎和肺炎)的可能性存在显著相关性。

1.介绍

识别呼吸道病毒的分子技术的进展使快速和具体的诊断成为可能，这对呼吸道感染(RTI)患者的管理至关重要[1，2]．许多研究表明，聚合酶链反应(PCR)技术已被确定为鉴定呼吸道病毒的适当工具[3.- - - - - -5]．呼吸道病毒感染是一个重大的公共卫生问题，因为它在世界各地都有发生，很容易在社区传播，而且发病率和死亡率相当高[6，7]．在住院儿童中发现混合呼吸道病毒的频率从10%到30%不等[8- - - - - -11]．一些研究表明，混合检测与疾病和/或临床严重程度的增加之间存在关联[9，12- - - - - -15]．其他人提出混合呼吸检测与疾病增加和/或临床严重程度之间没有关系[16，17]．

呼吸道病毒如人鼻病毒(HRV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒-1 (PIV-1)、副流感病毒-2 (PIV-2)、副流感病毒-3 (PIV-3)、人冠状病毒- oc43 (HCoV-OC43)、人冠状病毒- 229e (HCoV-229E)、腺病毒(AdV)被认为是RTI的病原体[3.，18]．经确定对呼吸道感染有责任的病毒已进一步扩大，包括更多的病毒，如人类偏肺病毒(hMPV) [19，20.], HCoV-NL63 [21，22]、人类博卡病毒(博卡)[23，24]、人多瘤病毒KI (KIV)和人多瘤病毒WU (WUV) [25，26]．

本研究的目的是确定RTI住院患者的病毒混合检测频率，并评估病毒混合检测与临床严重程度的相关性。

2.方法和材料

2．1．研究人群

该研究包括850名在科威特Mubarak Al-Kabir医院住院的上呼吸道感染(URTI)或下呼吸道感染(LRTI)的儿童和成人患者。筛查2010年9月至2014年4月期间所有因呼吸道感染住院的患者。标本在医院采集，在- 70°C下保存，直到在科威特大学医学院病毒学室进行处理，使用PCR技术检测病毒核酸的存在。患者年龄3天~ 80岁。大部分标本采集于秋季和冬季。科威特的秋天在9月到11月之间，冬天在12月到3月之间。

2．2．临床样本

在获得住院患者书面知情同意后，采集鼻咽拭子标本用于URTI，支气管肺泡灌洗用于LRTI。开展这项研究的伦理许可得到了健康科学中心和科威特医学专业研究所(KIMS)研究中人体受试者保护联合委员会的批准。使用统一的数据收集表格从病历中收集临床数据。

2．3.呼吸道病毒的分子检测

2.3.1。提取方法

核酸提取采用MagNA Pure LC 2.0 (Roche Diagnostics Ltd.， Rotkreuz, Switzerland)自动核酸提取方法。根据制造商说明书，使用MagNA Pure LC总核酸分离试剂盒(罗氏应用科学，曼海姆，德国)提取所有850例呼吸样本。提取结果是60μ病毒核酸洗脱液置于−70℃保存至加工。

如前所述，测定呼吸道病毒中是否存在病毒核酸[4]．简单地说，用单一PCR方法检测腺病毒和副流感病毒-2 (PIV-2);采用双链PCR检测甲型和乙型流感病毒;采用三联体PCR检测呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒(PIV) 1和3，采用三联体PCR检测人鼻病毒、人冠状病毒- 229e和冠状病毒- oc43。

2.3.2。PCR和RT-PCR检测新发现呼吸道病毒

在从临床标本中提取核酸后，使用Ordás等所描述的引物来测定hMPV RNA的存在。[27]．使用Moës等的引物检测HCoV-NL63 RNA [28]，采用Allander等的引物检测Boca DNA [23]．用于检测KIV和WUV DNA的引物之前由Allander等人和Bialasiewicz等人描述[25，26]．

2.3.3。PCR和RT-PCR条件

在37℃下进行RT步骤60分钟μL反应体积含1X GeneAmp RNA PCR缓冲液，5μL 25毫米氯化镁₂，每个三磷酸脱氧核苷1毫米，2.5μ随机六聚体的M, 0.5μL RNase inhibitor, 3μL, 2.5 U/μL逆转录酶(GeneAmp RNA Core Kit;应用生物系统公司，芝加哥，伊利诺伊州)。逆转录酶在90℃热灭活5分钟后，整个反应混合物用于PCR，总体积为50μL.反应混合物组成为2 mM氯化镁₂溶液，1X PCR缓冲液，正反引物各0.02 pg, 0.05μL (5u /μL Ampli Taq DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, USA)。PCR方法如下:94°C变性1 min, 94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，72°C延伸7分钟，共40个循环。用水代替核酸作为阴性对照。利用ATCC参考病毒面板检测对旧呼吸道病毒的交叉反应性，确定每种PCR格式的特异性。将引物和探针退火位点的DNA模板(110-140 bp, Thermo Scientific)作为阳性对照，检测HCoV-NL63、hMPV、Boca、WUV和KIV的核酸。

２.４.统计分析

数据分析使用社会科学统计软件包(SPSS 20.0版本，IBM公司，Armonk, NY, USA)。连续变量的描述性统计使用非参数Mann-Whitney进行比较或Kruskal-Wallis测试。对于分类变量，卡方检验或者Fisher精确检验-检验用于检验比例之间的差异或评估比例之间是否存在关联。双尾概率值被认为具有统计学意义。

3.结果

在850例住院患者中，确诊为病毒性呼吸道感染的患者351例(47.8%)，其中男性210例(59.8%)，女性141例(40.2%)。结果351例患者中检出408例病毒。表格1结果显示，在有呼吸道症状患者的临床呼吸道标本中，HRV检出率最高(41.6%)，其次为流感(15.1%)、RSV(13.1%)和HCoV-OC43(12.3%)。351例住院患者中49例(14%)检出病毒混合。混合检测最常见的病毒为HRV(7.1%)，其次为AdV(4%)、HCoV-OC43(3.7%)、RSV(3.1%)和FluA (2.8%)1）.

有趣的是，有四名患者检测到三联病毒。第1例感染Boca、HCoV-OC43、HRV，第2例感染WUV、Boca、HCoV-229E，第3例感染HCoV-OC43、FluA、HRV，第4例感染KIV、RSV、hMPV。

表格2显示49例患者中病毒混合检出率。病毒混合检测中HRV和AdV组合最高的7例(2%)，其次为HRV和HCoV-OC43组合5例(1.4%)，HRV和FluA组合4例(1.1%)。

49例(14%)混合检出患者中，男性33例(9.4%)，双检32例(9.1%)，三检1例(0.3%)，女性16例(4.6%)，双检14例(4%)，三检2例(0.6%)3.）.

49例病毒混合检出患者中，年龄<1岁20例(5.7%)(双重检出18例(5.1%)，三联检出2例(0.6%))，1 ~ 14岁17例(4.8%)(双重检出16例(4.6%)，三联检出1例(0.3%))。12例(3.4%)≥15例(表2)3.）.整体而言，大部分病毒混合检测，达到8.5% ()，为5岁以下儿童。表格4显示了每一种病毒混合检测患者的中位年龄、范围和智商的分布。Boca、HCoV-OC43和RSV的中位年龄<1岁，而WU、AdV、FluA、PIV-3、HRV和hMPV的中位年龄为1 - 11.5岁。其余呼吸道病毒KI、HCoV-229E和PIV-1年龄≥15岁。

肺炎17例(4.8%)(双检15例(4.3%)，三检2例(0.6%))，毛细支气管炎15例(4.8%)(双检14例(4%)，三检1例(0.3%))。10例(2.8%)URTI患者均为双病毒检测，7例(2%)RD患者均为双病毒混合检测(表)3.）.呼吸道病毒感染以下呼吸道感染为主(39例，11.1%)，上呼吸道感染为主(10例，2.8%)。肺炎和毛细支气管炎是最常见的住院原因(32例，9.1%)。表格1比较混合病毒检测和单病毒检测患者的临床表现。毛细支气管炎混合检出率与单纯检出率差异有统计学意义()及肺炎(）.

住院患者以病房为主(32例，9.1%)，其次为儿科重症监护病房(PICU)(11例，3.1%)，重症监护病房(ICU)(6例，1.7%)3.）.

病毒混合检出率最高的月份为11月(15例，14.7%)，其次为1月和6月(14例，13.7%)。发病率最低的月份是8月份(2次检出率或2%)，7月份没有发现病毒混合检测(图)1）.

4.讨论

利用分子技术检测病毒感染，改善了在单一样本中检测混合病毒的识别[29]．在本研究中，我们评估了科威特2010年9月至2014年4月连续三年半期间，在患有呼吸道感染和LRTI的住院儿童和成人中采用PCR技术进行病毒混合检测的发生率。在科威特，呼吸道感染住院患者中病毒混合检测的总体流行率为14%。LRTI混合病毒检出率比URTI高约8%。从已发表的使用分子诊断报告呼吸道病毒混合检测的研究来看，没有其他研究与我们的研究人群(儿童和成人)或临床表现(URTI和LRTI)相匹配。在中国济南市进行的一项基于社区的研究中，一年内来自呼吸道感染住院患者和门诊患者的720份样本中，有95份样本(13.19%)发现了病毒混合检测。此外，在这项研究中，LRTIs的病毒阳性率比URTIs高出约20% [9]．在最近的一项研究中，在8%(22/292)的样本中观察到48%(140/292)的急性LRTI住院儿童和成人样本(病毒混合检测)[10]．在最近的另一项研究中，对131例0-8岁急性呼吸道感染儿童样本进行了研究，其中19例(14.5%)采用混合病毒检测[11]．

混合病毒检测涉及的三种主要病原体是HRV、AdV和HCoV-OC43。报告了类似的结果，其中他们确定HRV、AdV和HCoV-OC43为混合检测涉及的主要病毒[30.]．其他研究报告了涉及混合检测的主要病毒的不同分组。近期研究报告RSV、HRV和AdV为儿童混合检测的主要病毒[8，31]以及儿童/成人[10]．在另一项研究中，在患有RTI的儿童中混合检测的最普遍的病毒是HRV、PIV和流感病毒[9]．这些差异可能归因于所检测的呼吸道病毒组、区域或环境的可变性以及病毒检测技术的不同。

在49例病毒合并感染患者中，45例(12.8%)出现双重病毒检测，4例(1.1%)出现三重病毒检测。在韩国的一项流行病学研究中混合病毒检测分析显示双重检测的17.1%和三重检测的1.8%，这高于我们的结果，可能是因为他们测试了更大的样本量，我们测试了更大的病毒组[30.]．另一项研究也报告了呼吸道合胞病毒感染儿童中两倍20.3%和三倍3.9%的病毒检测[8]．最常见的组合是HRV/AdV、HRV/HCoV-OC43和HRV/FluA。HRV/AdV组合为主要组合;这一发现与以前的报告具有直接的可比性[8，30.]．在本研究中，大多数病毒混合检测发生在1岁以下的儿童(20例，5.7%)。这可与最近的其他研究相媲美[8- - - - - -10，31]．这可能是由于婴儿的免疫系统尚不成熟，以及没有较早接触呼吸道病毒，这可能会增加他们对混合感染的易感性[12]．

本研究未发现RSV和hMPV之间的病毒混合检测，尽管多项研究发现hMPV和RSV混合感染率约为~ 5-14% [20.，32，33]．然而，在荷兰进行的一项对LRTI住院儿童的研究中，没有发现RSV和hMPV之间的病毒合并感染[34]．

如表所示2， HCoV-OC43阳性患者最常同时感染HRV和RSV。2006年至2009年在中国进行的一项研究旨在评估急性LRTI儿童中10种呼吸道病毒的总体流行情况，冠状病毒阳性样本最常与HRV和RSV同时感染[35]．描述冠状病毒与RSV混合检出率高的类似数据以前也有描述[36，37]．

自首次发现KIV和WUV以来，它们的病毒序列已在全球范围内从RTI患者的呼吸道样本中确定[38- - - - - -41]．然而，WUV和KIV在没有呼吸道疾病的对照组个体中发现的发病率相似，所以这些多瘤病毒和呼吸道疾病之间的关联仍然是假设的[38，40，42]．KIV的混合检出率为74%，WUV的检出率从68到79% [39- - - - - -41]．在本研究中，单次检测WUV的住院患者被诊断为支气管炎、毛细支气管炎和肺炎(见表)1）.在中国南方的一项研究中，单次检测到WUV的住院儿童表现为咳嗽、中度发热和喘息，他们还被诊断为肺炎、毛细支气管炎、URTI和支气管炎。这些发现表明多瘤病毒可导致URTI和LRTI [43]．在另一项评估免疫缺陷儿童和免疫正常儿童呼吸道样本中WUV和KIV的发病率和病毒载量的研究中显示，与免疫正常人群相比，免疫缺陷患者中WUV和KIV的患病率相似[44]．然而，这些数据还需要在进一步的研究中加以证实。

多项研究表明，Boca检测往往与其他呼吸道病毒如HRV、AdV和RSV有关[23，35，45]．本研究将混合检测的Boca病毒与HRV、HCoV-OC43、HCoV-229E和AdV进行了鉴别(表)2）.持续的病毒脱落和高频率的混合检测导致了对其作为真正病原体的作用的争论[42，46]．其他研究证实，如果患者只有一次检测，且临床样本中病毒载量高，则博卡病毒最有可能是RTI的病因[45，47]．在本研究中，我们的患者被诊断为单一Boca病毒检测，同时患有URTI和LRTI(表)1）.尽管如此，博卡病毒是一种重要的呼吸道病毒，这一点越来越明显[48]．

我们的发现可能表明呼吸道病毒混合检测与更严重的LRTI(如毛细支气管炎)的可能性之间的联系()及肺炎()，与单一检测相比。混合病毒检测与疾病/临床严重程度之间的关系是有争议的。早期的研究报告称，混合检测呼吸道病毒会增加住院和肺炎的风险[8，9，13，14]，而其他研究则报道混合检测与疾病/临床严重程度之间无相关性[16，49]．然而，尽管可用敏感的分子检测，关于混合检测与单一检测在疾病/临床严重程度中的作用的报道仍存在争议。已经提出了许多理论来解释混合呼吸道病毒检测和呼吸道感染严重程度之间的关系;这些理论包括原发性感染后免疫反应的改变[50，51]和主机对多种病毒的脆弱性[15]．

混合病毒检出率除7月外全年均有季节变化，1、6、11月为发病高峰(检出率43例，占42.1%)。

综上所述，我们的研究结果可能提示RTI患者的病毒混合检测并不少见，混合检测可能会增加肺炎或毛细支气管炎患者的临床严重程度。在RTI病毒混合检测中，需要进一步调查疾病严重程度的决定因素。

尽管这项研究有一些局限性，如缺乏研究对照(没有估计可归因疾病所需的RTI的匹配住院病例)，目标病原体之间的RT-PCR敏感性/特异性的差异，以及缺乏对潜在细菌病原体的系统检测，未检测到病毒载量，但这些数据提供了科威特混合呼吸道病毒检测的代表性结果。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢科威特大学研究部对这项研究(MI 03/08)的持续支持。特别感谢科威特大学医学院微生物学系副教授Wassim Chehadeh博士，他在利用PCR分析病毒方面提供了出色的技术支持。特别感谢Prem Sharma博士(科威特大学副校长办公室技术顾问)在数据统计分析方面的杰出帮助。

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