内控、通用Real-Time PCR定量和多重Real-Time PCR与血清型特异性探针用于登革热病毒感染的血清分型

摘要

登革热已成为一个全球公共卫生问题，早期检测的敏感诊断检测可以挽救生命。开发了一种内控、通用的实时PCR，并通过在固定数量的IC存在下检测一系列稀释的DENV阳性对照RNA来验证，结果显示良好的线性关系()， LOD至少为拷贝/毫升。应用该方法对136例患者进行PCR检测，灵敏度为95.8%，特异性为100%。新开发的多重实时PCR与血清型特异性探针，使92例(87%)real-time PCR阳性患者中的80例(87%)可对DENV进行血清分型。结合这些实时pcr技术，为临床标本中DENV的敏感和特异性定量提供了方便的诊断工具，并有可能进行血清分型。

1.介绍

蚊媒黄病毒感染(如登革热)迅速蔓延，就发病率和死亡率而言，已成为世界上最严重和最可怕的传染病[1，2]．最近的估计表明，超过35亿人（～55%)世界人口生活在登革热高危地区[3.]．全世界每年有5000 - 1亿例登革热感染病例，导致25000人死亡。由于登革热病媒在热带和亚热带国家的地理分布日益扩大，登革热已成为一个主要的国际公共卫生问题[1]．国际旅行增加，加上多个(次)热带国家登革热的传播或重新出现增加，以及流行病学的变化，导致返回不佳旅行者中确诊的登革热病例稳步上升[4]．登革热是由RNA病毒(DENV)引起的。登革热主要通过受感染者的叮咬传播AEDES AEGYPTI.蚊子。4种不同病毒血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)中的任何一种DENV感染都是轻度无症状的，在感染早期往往难以识别，因为症状和体征是非特异性的，类似于其他发热性疾病。只有少数DENV感染(约5%)会导致严重的登革热[5，6]．DENV感染最常用的诊断工具是基于抗体(Ab)的检测，最近，NS1抗原(Ag)的检测[7]．然而，Ab和Ag检测方法都不能区分各自的DENV血清型。基于登革热病毒的检测和血清分型的检测为更好地研究危及生命的登革出血热和DSS并发症、血清型和顺序感染之间的关系提供了可能性[8，9]．其他针对DENV感染的实时PCR检测均基于类型特异性引物，但均无内部控制(IC) [8，10，11]．为了可靠的检测和排除假阴性结果，必须使用集成电路[12]．DENV的血清分型很重要，因为对四种不同DENV血清型缺乏交叉反应免疫可能导致危及生命的并发症[9]．在本研究中，我们开发并验证了一种内控的用于检测和定量所有已知DENV血清型的通用实时PCR，以及基于血清型特异性探针的用于识别血清型的多重PCR。

2。材料和方法

2．1．引物和探针

利用Vector NTI Advance version 10和ClustalW对GenBank中所有已知的DENV全基因组序列进行比对。用于DENV和DENV-1扩增的通用引物对体外作为阳性对照(DENV体外RNA)位于3 ' -UTR区域。DENV属引物，非竞争性内控RNA (IC) (MS2 RNA;用于扩增和检测的探针序列见表1．我们设计了特异性的MS2 RNA引物、探针和特性。所有的引物、探针和连接物均来自Biolegio (Biolegio, Nijmegen, The Netherlands)。


引物或探针	序列(5′3′)	5 '记者	3 '冷却器

DENV-F(10546)通用	GGTTAGAGGAGACCCCTCCC
Denv-R（10711） - enic	GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT
MS2-F	cataagttagatggccgtctgt.
MS2-R	TAGAGACGACAACCATGCCAAAC
DENV-generic-MGB探针	AAACAGCATATTGACGCTGGGA	FAM公司	BHQ1.
一份调查	TCCAGACAACGTGCAACATATCGCGACGTATCGTGATATGG	十六进制	BHQ1.
Denv-1-MGB探针	AACACCATGGGAAGCTGTACCCTG	FAM公司	BHQ1.
DENV-2-MGB探针	GAGATGAAGCTGTAGTCTCACTGG	十六进制	BHQ1.
Denv-3-MGB探针	TGAGGGAAGCTGTACCTCCTTGCA	德克萨斯红	BHQ2.
Denv-4-MGB探针	CCCGAAGCCAGGAGGAAGCTGTACTCC	CY5	BHQ2.

通用引物DENV-F和-R的核苷酸编号与DENV-1(参比株AF226685)相对。
F:正向引物;R:反向引物;MGB:小槽绑扎;BHQ1或2:黑洞猝灭器1或2。

2．2．DENV-1型的建设在体外RNA阳性对照(DENV体外RNA)

为了建造丹佛体外设计两个连接子，分别命名为DENV-hyb-1和DENV-hyb-2。DENV-hyb-1序列为(DENV属引物序列为斜体)5 ' -GGTTAGAGGAGACCCCTCCCaagtcacaacgcagcagcggcccaacaccaggggaagctgtaccctggtggtagagactagagagagaccccccgcgcaacaataaacagcatattgacgctgggagagaccagagatcctgctgtctc -3 '和DENV-hyb-2是5 ' -gagacagcaggatctctggtctctccc.AGCGTCAATATGCTGTTTATTGTTGCGCGGGGGGTCTCCTCTAACCTCTAGTCCTTACCACCAGGGTACAGCTTCCCCTGGTGTTGGGCCCCGCTGCTGCGTTGTGACTTGGGAGGGGTCTCCTCTAACC-3”。DENV体外RNA的构造如前所述[12，13]．

2．3.RNA量化

DENV的体外RNA和MS2 RNA在260 nm处测定光密度。连续稀释的rna保存在−70°C直到使用。

２.４.核酸提取，cDNA和通用实时荧光定量PCR

DENV体外在固定数量的IC存在下提取RNA和136例患者样本，并制作cDNA。萃取前将IC加入到含有样品的裂解缓冲液中。核酸(NA)的提取μL血清或血浆样本μl IC并在100中洗脱 μL TE-buffer [14]．80年μ如前所述，NA提取物的L用于cDNA合成(rt -反应)[12使用随机引物(Roche Diagnostics)， cDNA产品在−20°C保存。用于DENV cDNA的制备体外RNA丹佛体外提取前将RNA和IC插入含DENV阴性人血清的裂解缓冲液中。PCR混合基因包含12.5μ2个probe Master Mix (Roche Diagnostics)的L，引物(每个)的500 nM, DENV-generic-MGB探针的300 nM, MS2探针的100 nM，以及10μL的cDNA(对应于提取的1/12.5μl卷。PCR反应在Bio-rad IQ5实时机（Bio-Rad）中进行，如如下所示：在50℃下10分钟，在95℃下10分钟，然后在95°C下为20 s的45个循环，1分钟在60°C时进行退火和延伸。使用Bio-Rad IQ5软件版本2.1（BIO-RAD）进行分析数据。如果CQ值低于40.如果在样品中检测到IC，则在通用PCR中被认为是患者样品在通用PCR中阳性。如果在样品中检测到IC。否则，将样品被认为是不适合的分析，并重复PCR以进行新的提取。

2．5．血清学

采用DENV IgM和IgG Capture ELISA (PANBIO)和Tran等人先前描述的方法测定抗DENV抗体[15]．

2．6．临床样本

纳入109例登革热抗体阳性患者和27例登革热抗体阴性患者的血清或血浆样本。109例血清抗DENV阳性患者中26例原发性DENV感染患者和83例继发性DENV感染患者进行了分层。136例患者可进一步分为3组:46例返回者(原发感染21例，继发感染16例，抗体阴性9例)[16]， 72例来自越南(5例原发感染，67例继发感染)，[17其中16例丙型肝炎(HCV)抗体及PCR阳性，2例甲型肝炎(HAV)抗体及PCR阳性。136名患者中有118名(46名患病的归国旅客和72名来自越南的患者)接受了我们的通用PCR检测，之前采用了前面描述的类型特异性引物PCR检测[11]．18例HCV或HAV患者仅在我们的通用PCR中进行检测。

2.7。血清学分型,SYBR-Green

SYBR Green反应在Bio-Rad iQ5实时机器(Bio-Rad)中使用cDNA (10μ25 .选cμL卷组成12.5μL IQ SYBR Green SuperMix（Bio-rad），500 nm通用丹佛底漆对。为了扩增，使用以下PCR程序：在95℃下10分钟，然后在95℃下为20 s的45个循环，在60℃下在60℃下进行退火和延伸。熔化温度（)曲线分析了放大,包括一个周期后变性在95°C 1分钟,其次是60°C 1分钟和斜坡到95°C 0.1°C的速度连续荧光测量,使用iQ5实时PCR机器,数据分析使用Bio-Rad软件2.1版本(Bio-Rad)。

2.8。多重实时荧光定量PCR检测血清型

利用DENV通用引物和4种不同血清型特异性DENV探针在一次多重PCR反应中确定血清型。用500nm的DENV引物和300nm的每个血清型特异性DENV探针进行多重PCR反应(表1)1)．

2.9。统计分析

使用SPSS软件进行统计分析(windows版本16.0)。计算频率、平均值或中位数来描述背景变量。一致性用Cohen的kappa值表示。采用Laue等人的类型特异性引物PCR作为计算我们检测的灵敏度和特异性的金标准[11]．

3.结果

3．1.DENV实时荧光定量PCR动态范围的测定

为了可靠的检测和排除假阴性结果，在提取、cDNA合成和PCR反应的整个过程中都使用了IC。为了确定内控的动态范围，将IC连续稀释后添加到含阴性血清的裂解缓冲液中，进行提取、cDNA合成和PCR程序。限稀释结果显示，检测限为10拷贝/PCR，命中率为100%(表1)2)．然而，为了可靠地检测双链测定中的IC，选择对应于500份IC / PCR的输入，对DenV的检测限没有影响体外RNA(结果未显示)。在以后的实验中，一定数量的在提取和cDNA合成之前，在裂解缓冲液中掺入IC拷贝。在验证期间，IC显示出良好的稳定CQ值（平均CQ值为33.34）。


提取中的IC拷贝	RT中的IC副本	PCR中的IC拷贝数^b	阳性IC (%;平均Cq-value & SD)

	10⁷	10⁶	4/4 (100%;20.74;0.23)
	10⁶	10⁵	4/4 (100%;24.80;0.43)
	10⁵	10⁴	4/4（100％; 27.92; 0.48）
	10⁴	10^3.	4/4 (100%;32.08;0.71)
	10^3.	10²	4/4 (100%;34.53;0.56)
	10²	10¹	4/4 (100%;36.93;0.72)
0	0	0	0/4

^一个根据含有Denv阴性人血清的裂解缓冲液的10倍连续稀释液确定动态范围，作为丹佛阴性人血清，作为每个稀释的4重复。
^bcDNA/PCR拷贝数计算为提取RNA的1/12.5，假设提取、逆转录(RT)和PCR效率为100%。
SD:标准差。

为了确定通用PCR的动态范围，我们将10倍的串行稀释液掺入Denv体外RNA在提取和cDNA合成之前，RNA与含有DENV阴性血清的裂解缓冲液。随后10 μ以cDNA的L片段进行PCR。限制DENV稀释体外RNA的定量检测限为10^3.拷贝/PCR的准确率为66.7%3.)，回归系数为0.9967，动态范围为6.25 × 10^3.-6.25×10⁷拷贝/毫升(图1)．


DENV体外RNA拷贝提取	DENV体外RT中的RNA拷贝	DENV体外PCR中的RNA拷贝^b	PCR中的IC拷贝数^b	阳性DENV数量体外RNA（％;平均CQ值：SD）	阳性IC (%;南达科他州意味着Cq-value:)

	10⁷	10⁶	500.	12/12 (100%;26.59;0.54)	12/12 (100%;35.82;1.08)
	10⁶	10⁵	500.	12/12 (100%;30.59;0.46)	12/12 (100%;32.67;0.79)
	10⁵	10⁴	500.	12/12 (100%;34.35;1.09)	12/12 (100%;32.97;0.74)
	10⁴	10^3.	500.	8/12（66.7％; 37.22; 0.73）	12/12 (100%;33.73;0.63)
	10^3.	10²	500.	1/12 (8%;40.71)	12/12 (100%;32.24;0.60)
0	0	0	0	0/12	0/12

^一个对10倍稀释的DENV序列进行了PCR动态范围的测定体外在含有DENV阴性人血清的裂解缓冲液中加入固定数量的IC，每稀释12个重复。
^bcDNA/PCR的拷贝数为提取的RNA的1/12.5。假设提取、逆转录(RT)和PCR的效率为100%。
SD:标准差。

图1

体外 ⁷ 体外 PCR属的动态范围。每10倍稀释DENV 12个重复的平均cq值提取固定数量的RNA在DENV阴性血清背景中提取IC拷贝，并在通用实时PCR中进行检测，得出动态范围-6.25×10拷贝/毫升DENVRNA的回归系数为0.9967。

3．2．检测下限(LOD)的确定

确定通用PCR测定的LOD 2倍串联稀释液体外在提取DENV阴性人血清前，在裂解缓冲液中分别添加固定数量的IC，每稀释20个重复的RNA。DENV的LOD体外RNA至少为312拷贝/PCR，对应1.95 × 10⁴拷贝/毫升(表4)．


DENV体外PCR中的RNA拷贝^一个	PCR中的IC拷贝数^b	积极DENV数量体外RNA（％;平均CQ值：SD）	正数IC (%;意味着Cq-value: SD)

2500	500.	20/20 (100%;35.98;0.99)	20/20 (100%;33.43;0.65)
1250	500.	12/20（60％; 36.96; 1.13）	20/20 (100%;32.84;0.53)
1000	500.	10/20 (50%;37.33;0.94)	20/20 (100%;33.66;0.53)
625.	500.	8/20 (40%;38.72;1.82)	20/20 (100%;32.61;0.59)
312	500.	5/20 (25%;39.17;2.67)	20/20 (100%;32.69;0.34)
0	0	0/20	0/20

^一个采用2倍稀释法，每稀释DENV 20个重复，测定PCR的LOD体外RNA以固定数量的IC加入到含DENV阴性人血清的裂解缓冲液中作为背景。
^b计算cDNA/PCR拷贝数为提取RNA的1/12.5，假设提取、逆转录(RT)和PCR效率为100%。
LOD：检测限额下限;SD:标准差。

3．3.分析内和分析间的变异

内部和inter-assay变化测量四个复制每稀释10倍稀释系列IC的定额DENV -血清的背景:intra-assay变化决定的三分在一天(结果未显示)和inter-assay变化表现在三个连续运行超过3天。检测结果显示，DENV的IC和每个系列稀释度的cq值稳定体外RNA(表5)．


运行和DENV体外PCR中的RNA拷贝^一个	PCR中的IC拷贝数^b	积极DENV数量体外RNA（％;平均CQ值：SD）	正数IC (%;意味着Cq-value: SD)	SD之间的3次运行

运行1
10⁶	500.	4/4 (100%;26.28;0.43)	4/4 (100%;36.21;1.21)	0.27
10⁵	500.	4/4 (100%;30.40;0.39)	4/4 (100%;33.10;1.37)	0.35
10⁴	500.	4/4 (100%;33.78;0.38)	4/4 (100%;32.17;0.30)	0.22
10^3.	500.	2/4 (50%;36.99;0.37)	4/4 (100%;33.64;0.29)	0.65
10²	500.	0/4	4/4 (100%;32.47;0.20)	- - - - - -
0	0	0/4	0/4	- - - - - -

运行2
10⁶	500.	4/4 (100%;26.71;0.56)	4/4 (100%;36.11;0.84)	0.27
10⁵	500.	4/4 (100%;30.35;0.19)	4/4 (100%;32.66;0.65)	0.35
10⁴	500.	4/4 (100%;34.31;0.64)	4/4 (100%;33.32;0.39)	0.22
10^3.	500.	3/4 (75%;37.08;0.86)	4/4 (100%;33.64;0.92)	0.65
10²	500.	1/4 (25%;37.83)	4/4 (100%;32.73;1.09)	- - - - - -
0	0	0/4	0/4	- - - - - -

跑3
10⁶	500.	4/4 (100%;26.79;0.60)	4/4 (100%;35.13;1.06)	0.27
10⁵	500.	4/4 (100%;30.98;0.50)	4/4（100％; 32.47; 0.10）	0.35
10⁴	500.	4/4（100％; 34.27; 0.78）	4/4 (100%;33.24;0.54)	0.22
10^3.	500.	1/4 (25%;38.17)	4/4 (100%;33.91;0.67)	0.65
10²	500.	0/4	4/4 (100%;32.59;0.23)	- - - - - -
0	0	0/4	0/4	- - - - - -

^一个用DENV 10倍稀释法测定测定间变异体外在含有DENV阴性人血清的裂解缓冲液中加入固定数量的IC，每稀释4个重复。差异是在三个不同的天进行的三个独立的运行确定的。
^bcDNA/PCR拷贝数计算为提取RNA的1/12.5，假设提取、逆转录(RT)和PCR效率为100%。
SD:标准差。

3．4．临床样本测试

固定数量的IC (5μL)和200μ在提取和合成cDNA之前，将患者样本的L加入裂解缓冲液中。总体而言，PCR的敏感性为95.8%，特异性为100%6)．所有检测到IC和DENV阴性的患者样本均为真正阴性。只有四份在类型特异性引物PCR中检测呈阳性的患者样本在通用PCR中检测呈阴性。患者样本已于较早前进行了类型特异性引物PCR检测[16，17]和额外的冻融步骤可能影响了这四个样本的RNA质量，在类型特异性引物PCR中，这四个样本的cq值已经很高，接近37或更高。与抗denv阳性的越南患者(95.8%)相比，抗denv阳性的返港旅客的通用PCR检测结果呈阳性的百分比(62.2%)更低，这与返港旅客在就医前患病时间较长有关(见表)6)．


患者特征和测试参数	越南DENV患者		有DENV的不回来的旅客		旅行者发烧的其他原因	患者阳性
患者特征和测试参数	原发感染	继发感染	原发感染	继发感染	OFI	丙肝病毒、甲型肝炎	总计

耐心（n）	5	67	21	16	9	(18）^d	136
年龄;中位数(范围)	10.9 (6.6 - -12.8)	18.9（5.6-53.1）	38.7 (17.4 - -62.6)	33.2（24.6-73.6）	39.5 (26.3 - -64.0)	未知的	26.3 (6.6 - -73.6)
性(M / F)	3／2	48/19	9/12	6／10	6/3	未知的	72/46
患病时的天数;中位数(范围)	1 (1 - 1)	1 (1 - 4)	6 (1 - 12)	8.5 (4-22)	- - - - - -	- - - - - -	2(22页)
DENV病毒血症天数;中位数(范围)	1 (1 - 1)	1 (1 - 4)	4 (1 - 11)	7(4 - 9日)	- - - - - -	- - - - - -	1 (1 - 11)
耐心（)，并产生积极的结果
特定类型聚合酶链反应^一个	5	66	16	9	0	ND	96
通用的聚合酶链反应^b	3.	66	15	8	0	0	92
Multiplex PCR^c	3.	63	11	3.	0	ND	80
通用PCR的分析特征
敏感性;%(95%置信区间)	60.0（23.1-88.2）	100.0 (94.5 - -100.0)	93.8 (71.7 - -99.0)	88.9 (56.5 - -98.0)	- - - - - -	- - - - - -	95.8 (89.8 - -98.4)
κ价值	0.736	1.000	0.944	0.924			0.846
特异性;％					100．0	100．0	100．0

^一个根据Laue et al. [11，16，17]．
^b内部控制的通用实时PCR用于丹佛。
^c只对属PCR阳性的样本进行类型特异性探针的多重PCR^b结果。
^d16名患者是HCV的抗体和PCR阳性，2名患者是抗体和PCR阳性。
OFI:其他发热性疾病;HCV:丙型肝炎病毒;甲型肝炎病毒;M:男性;F:女性;95% CI: 95%置信区间，ND:未完成。

3．5．血清学分型,SYBR-Green

由于SYBR-Green实时PCR不需要类型特异性引物或探针，因此可以用一个实时PCR程序获得结果，用于检测特定的熔化曲线（)．我们使用了一组已知感染DENV血清型1至4的患者的cDNA，这些患者之前在我们的通用PCR检测中呈阳性。的然而，对于DenV-1，DenV-2，Denv-3和Denv 4均均彼此（84.90°C，83.60°C，85.80°C，84.70°C）来实现所有四种血清型之间的歧视。此外，病毒载荷的差异影响熔化温度使SybR-Green PCR不可靠的DENV血清型（结果未示出）。

3.6。利用血清型特异性探针的多重实时PCR进行血清分型

采用血清型特异性探针的多重PCR只对92例患者的基因型PCR检测结果为阳性的样本进行检测。采用引物PCR检测DENV血清型(见表)7）在我们的多重PCR中盲目地测试。通用PCR检测到所有4个Denv血清型。具有类型特异性探针的多重PCR正确地鉴定了92例（87％）患者样品中的80中的DenV血清型。在我们的多重测定中不能血清术中不能血清型的患者样品在通用PCR中具有接近38或更高的CQ值。在三个患者样品中，用特异性引物PCR检测两种血清型的感染，而通过多重PCR用血清型探针的多重PCR在80例患者样品中的7个中检测到两种血清型的感染（表7)．第一血清型的病毒血症水平高于第二血清型。


血清型	不。在接下来的化验中呈阳性的病人			不。通过以下检测两种血清型的感染(感染中的DENV血清型)^c
血清型	特定类型聚合酶链反应^一个	通用的聚合酶链反应	多重PCR.^b	特定类型聚合酶链反应^一个	多重PCR.^b

1	39	Pos (39)	30.	3 (）	4 (）
2	19	Pos (19)	17	0	1 (）
3.	3.	Pos (3)	2	0	1 (）
4	31	Pos (31)	31	0	1 (）
总计	92	92	80	3.	7

POS：通用PCR可以在血清型之间没有区别。
^一个根据Laue et al. [11，16，17]．
^b多重实时PCR与血清型特异性探针只做阳性的通用PCR结果。
^c由两种血清型感染的DENV被分配到两种血清型中最先出现信号并显示出最高病毒载量的血清型。

4.讨论

登革热病毒感染已成为一个主要的国际公共卫生问题，因为病媒的地理分布日益扩大[1]，国际旅行增加，而返港旅客确诊感染登革热的个案亦增加[4]，对4种不同DENV血清型缺乏交叉反应免疫，4种血清型在同一地区存在高地方病循环。这些都是DENV造成威胁的重要因素。

实时PCR的一个固有问题是扩增抑制剂的存在可能导致假阴性结果．MS2 RNA是一种用于过程控制的理想的“非竞争性”内部控制，这已被其他研究证实。任何用户都可以从商业上获得MS2 RNA，该RNA是一种稳定的，非传染性的，不存在于人类临床样本中，是一种非竞争性的对照物，不会与选定的引物和探针发生反应。我们的通用实时PCR方法能够在一次PCR反应中扩增四种已知血清型，并显示良好的线性关系()，动态范围为6.25 × 10^3.-6.25×10⁷拷贝数/mL, LOD≥1.95 × 10⁴拷贝/毫升。每10倍连续稀释DENV的cq值稳定(SD < 0.70)体外RNA。病毒载量为6.25 × 10^3.在我们的通用PCR中，仍有8%的病例在cq值为40的情况下可以确定检测到拷贝/mL(见表)3.)．因此，如果患者样本cq值低于40，则认为该样本为通用PCR阳性。DENV属引物及各种探针均基于DENV 3 ' -UTR高度保守区域(图)2)．DENV的遗传多样性和准物种可能有助于提高PCR的准确性，正如黄病毒家族的另一成员HCV所显示的那样。然而，DENV的变异和生物变异的比例非常低(未发表数据)。所描述的DENV PCR的目标非常小(157 bp)，我们不能描述准物种样，例如HCV，而且没有像DENV特异性抗病毒药物或疫苗那样的外部选择压力，影响我们用于检测DENV的扩增子序列。

将所述的通用实时PCR与前面所述的118例患者样本的类型特异性引物PCR进行比较，发现两种检测方法具有良好的一致性，灵敏度为95.8%，特异性为100% [11]．未在我们的通用PCR中检测到的患者样本以非常低的病毒载量(约4.16 × 10)进行定量⁴拷贝数/mL)。使用同一样管进行血清学检测、类型特异性引物PCR检测和我们的通用PCR检测所产生的额外冻融步骤可能会导致样本中的RNases降解DENV RNA。患者标本可分成等份，以减少冻融的影响。

我们尝试了SYBR-green实时PCR进行血清分型，因为与类型特异性引物或探针分析相比，它更便宜，更容易进行。SYBR-green分析结果显示，病毒载量和四种血清型之间的密切相似性影响了每个血清型的熔化温度(数据未显示)，使其难以获得可靠的结果，这在以前的研究中也看到了[10，18]．因此，我们开发了一种多重实时PCR方法，在一个PCR反应中使用4个血清型特异性探针，该方法显示了在患者样本中区分4种DENV血清型的可靠结果。我们通过多重检测(敏感性为87%)，在92例PCR阳性的患者样本中区分了80例血清型，发现了7例两种血清型的同时感染。12例不能进行血清分型的患者样本在通用PCR中cq值接近38或更高，这可能是由于通用PCR和多重PCR之间的敏感性差异以及多重PCR内部的竞争。109例患者抗DENV抗体阳性，92例患者PCR阳性。这种差异可以解释为，在出现症状后去看医生和多次冻融步骤之前，返回不良的旅行者的中位数天数相对较高。PCR阴性但抗DENV抗体阳性的归国旅行者在中位6天后就诊(原发感染;1 - 12天)和8.5天(继发感染;抗体可能是在DENV已经从血液中消失之后才出现的。据推测，无论血清型如何，DENV在出现症状后大约5天内均可通过PCR检测到[11]．

我们的研究描述了一种特异性、敏感性和内控的实时PCR方法，用于DENV的早期检测，并可能通过多路技术进行血清分型。采用内控的DENV通用PCR检测方法筛查患者，并仅对阳性样本进行多重PCR分型，将比对所有样本进行分型PCR更划算。许多已发表的多重检测方法使用血清型特异性引物和探针的混合物，使检测灵敏度降低，价格昂贵[10]．其他多重PCR不是真正的多重PCR检测，因为它们包括两个单独的双PCR检测，每一个都有针对DENV 1-3或DENV 2-4的探针对[18]．

本文所述的检测方法是在疾病早期诊断DENV患者的重要补充工具。

缩写

DENV:	登革病毒
集成电路:	内部控制
HCV：	丙型肝炎
甲型肝炎:	甲型肝炎
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
RT:	反转录
登革出血热:	登革出血热
决策支持系统:	登革休克综合征
NS1:	1非结构蛋白
阿瑟:	抗体
Ag:	抗原
lod：	检测下限
Cq-value:	定量循环。

致谢

作者要感谢Hakima Belkasim的技术援助，Edou Heddema博士为他们提供了DENV阴性但HAV和HCV阳性的样本，以及Nicholas Griffin的审查。K. T. D. Thai是由荷兰科学研究组织(NWO)的Mosaic奖学金资助的。017.004.074。

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