AV 病毒学的进步 1687 - 8647 1687 - 8639 Hindawi出版公司 514681年 10.1155 / 2011/514681 514681年 研究文章 内部控制、通用实时PCR与Serotype-Specific量化和多路实时PCR探针的血清学分型登革病毒感染 表示“状态” 桑德拉 1 泰国 Khoa t D。 2、3、4 Nga Tran T T。 4 Phuong 黄平君L。 2、4 Klatser 保罗 1 Wolthers 卡佳C。 5 太平 Tran Q。 4 德弗里斯 彼得·J。 2、3 秃头的 马塞尔 1 布朗 杰伊·C。 1 皇家热带研究所 生物医学研究工具 Meibergdreef 39 1105年阿兹阿姆斯特丹 荷兰 kit.nl 2 传染病部门的 学术医学中心 热带医学与艾滋病 Meibergdreef 9 1105年阿兹阿姆斯特丹 荷兰 3 感染和免疫中心(影剧院) 学术医学中心 阿姆斯特丹大学的 1105年阿兹阿姆斯特丹 荷兰 uva.nl 4 微生物学,曹射线医院 b气Nguyen Thanh街201号 区5 胡志明市 越南 choray.org.vn 5 的医学微生物学 学术医学中心 部分临床病毒学 Meibergdreef 9 1105年阿兹阿姆斯特丹 荷兰 2011年 5 12 2011年 2011年 25 07年 2011年 10 09年 2011年 2011年 版权©2011年桑德拉表示“状态”等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

登革热已经成为一个全球性的公共健康问题和早期阶段的敏感的诊断测试检测能够拯救生命。一个内部控制,开发通用的实时PCR和验证的测试序列稀释DENV积极控制RNA的存在一个固定数量的结果显示良好的线性集成电路( R 2 = 0.9967 至少)和LOD 1.95 × 10 4 拷贝/毫升。应用程序的通用PCR对136患者样本显示敏感性为95.8%,特异性为100%。新开发的多路实时PCR与serotype-specific探测器允许DENV的血清学分型80 92(87%)的通用实时PCR阳性的病人。结合这些实时pcr提供一个方便的敏感和具体量化的诊断工具DENV在临床标本血清学分型的可能性。

 1。介绍

蚊媒黄病毒感染登革热等迅速传播,是最重要的,世界上可怕的传染病的发病率和死亡率( 1, 2]。最近的估计表明,超过35亿人( ~世界人口的55%)生活在地区登革热的风险( 3]。全球有50 - 100例登革热感染,每年导致25000人死亡。登革热已成为一个主要的国际公共卫生问题由于矢量的扩大地理分布在热带和亚热带国家 1]。增加国际旅行伴随着增加传输或重新崛起和登革热的流行病学变化在不同(子)热带国家有助于稳步上升证实登革热在ill-returned旅行者( 4]。登革热是由RNA病毒(DENV)。DENV主要是通过叮咬传播的感染 埃及伊蚊蚊子。大多数DENV感染,与任何四种不同病毒的血清型(DENV-1, DENV-2、DENV-3 DENV-4),轻度无症状,往往难以识别在感染的早期阶段,因为是特异性的症状和体征,像其它发热性疾病。只有一小部分DENV感染(~ 5%)将导致严重疾病的形式( 5, 6]。最DENV感染的诊断工具用于确认是基于检测的抗体(Ab),或者最近,NS1抗原(Ag)检测 7]。然而,Ab和Ag)检测方法不区分各自的DENV种血清型。测试基于检测和血清型登革病毒提供更好看的可能性之间的关系威胁生命的并发症的登革出血热和DSS,血清型和连续感染( 8, 9]。DENV感染其它实时PCR检测是基于特定类型的引物,但没有内部控制(IC) [ 8, 10, 11]。可靠的检测和排除假阴性结果的使用IC是至关重要的( 12]。血清学分型的DENV是很重要的,因为四种不同DENV的缺乏可交叉反应的免疫血清型可能导致危及生命的并发症( 9]。在这项研究中我们开发和验证一个内部控制的通用实时PCR检测和量化的所有已知DENV血清型和血清型的歧视基于多重PCR serotype-specific调查。

 2。材料和方法 2.1。引物和探针

所有已知的完整基因组序列DENV基因库中发现使用向量对齐NTI版本10和ClustalW前进。使用的通用引物对扩增DENV和DENV-1 在体外RNA作为积极的控制(DENV 在体外RNA)位于3′utr区域。DENV通用引物,引物的非竞争性内部控制RNA (IC)(一份RNA;罗氏诊断),探测序列扩增和检测表中列出 1。特定的一份RNA引物、探针和特征是由我们设计的。所有的引物、探针和连接器从Biolegio (Biolegio,奈梅亨,荷兰)。

引物和fluorescence-labeled调查DENV和非竞争性的IC(一份RNA)。

引物或探针 序列(5′3′) 5′记者 3′冷却器
DENV-F(10546)通用 GGTTAGAGGAGACCCCTCCC
DENV-R(10711)通用 GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT
MS2-F CATAAGTTAGATGGCCGTCTGT
MS2-R TAGAGACGACAACCATGCCAAAC
DENV-generic-MGB探针 AAACAGCATATTGACGCTGGGA FAM公司 BHQ1
一份调查 TCCAGACAACGTGCAACATATCGCGACGTATCGTGATATGG 十六进制 BHQ1
DENV-1-MGB探针 AACACCATGGGAAGCTGTACCCTG FAM公司 BHQ1
DENV-2-MGB探针 GAGATGAAGCTGTAGTCTCACTGG 十六进制 BHQ1
DENV-3-MGB探针 TGAGGGAAGCTGTACCTCCTTGCA 德克萨斯红 BHQ2
DENV-4-MGB探针 CCCGAAGCCAGGAGGAAGCTGTACTCC CY5 BHQ2

核苷酸对通用引物编号DENV-F和- r是相对于DENV-1(参考应变AF226685)。

F:正向引物;R:反向引物;MGB:小沟结合;BHQ1或2:黑洞冷却器1或2。

 2.2。建设DENV-1体外<斜体> < /斜体> RNA阳性控制(DENV体外RNA)

DENV建设 在体外RNA两个连接器设计、命名DENV-hyb-1 DENV-hyb-2。DENV-hyb-1的顺序(斜体DENV通用引物序列)5′- GGTTAGAGGAGACCCCTCCCAAGTCACAACGCAGCAGCGGGGCCCAACACCAGGGGAAGCTGTACCCTGGTGGTAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCCGCGCAACAATAAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3′, 5′- DENV-hyb-2 GAGACAGCAGGATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTTTATTGTTGCGCGGGGGGTCTCCTCTAACCTCTAGTCCTTACCACCAGGGTACAGCTTCCCCTGGTGTTGGGCCCCGCTGCTGCGTTGTGACTTGGGAGGGGTCTCCTCTAACC-3′。DENV 在体外RNA是构造如前所述 12, 13]。

 2.3。RNA量化

DENV的 在体外RNA, RNA是一份量化通过测量光密度在260海里。连续稀释的rna是储存在−70°C到使用。

 2.4。核酸提取、互补和通用实时PCR

DENV 在体外RNA和136年病人样本中提取的固定数量的IC和互补。集成电路是飙升在提取之前包含样品裂解缓冲。核酸的提取(NA)是在200年 μL血清或血浆样品和5 μ100年L IC和筛选了 μL TE-buffer [ 14]。80年 μL的NA提取用于互补脱氧核糖核酸合成(RT-reaction)早些时候描述( 12)使用随机引物(罗氏诊断)和互补产品储存在−20°C。制备的cDNA DENV 在体外RNA的DENV 在体外RNA和IC飙升到裂解缓冲区包含DENV -人类血清之前提取。通用PCR混合包含12.5 μL 2 x探测器主混合(罗氏诊断),500海里的底漆(每个),DENV-generic-MGB调查的300 nM和100 nM的一份调查,和10 μL (cDNA(提取对应1/12.5)25 μL体积。PCR反应进行Bio-Rad iQ5实时机器(Bio-Rad)后:10分钟50°C和10分钟在95°C,紧随其后的是45周期的20年代在95°C,和1分钟60°C退火和延伸。数据分析使用Bio-Rad iQ5软件2.1版本(Bio-Rad)。病人样本被认为是积极的普通PCR如果Cq值低于40。-结果真正-如果IC的样本中检测出。否则样品被认为是不适合分析和PCR是重复新提取。

 2.5。血清学

DENV测量使用DENV IgM抗体和免疫球蛋白捕获ELISA (PANBIO)和方法所描述的早些时候Tran et al。 15]。

 2.6。临床样本

样品(血清或血浆)抗体阳性患者从109年登革热血清学和27个负面登革热血清学抗体被包括在内。109患者anti-DENV积极血清学分层在26个主要DENV感染患者和83例继发性DENV感染。136名患者可进一步分为3组:46 ill-returned旅行者(21原发性感染,16继发感染,和9抗体阴性)( 16从越南),72名患者(67主要感染和继发感染),( 17)和18例从他16岁患者抗体和PCR阳性丙型肝炎病毒(HCV)和2患者抗体和PCR阳性甲型肝炎(甲肝病毒)。136名患者的118(46从越南返回的旅行者和72患者)被我们通用的PCR检测早期描述特定类型和以前的引物PCR ( 11]。18例丙肝病毒或甲型肝炎患者只在我们通用的PCR检测。

 2.7。血清学分型,SYBR-Green

SYBR绿色反应进行的Bio-Rad iQ5实时机器(Bio-Rad)使用互补(10 μ在25 L) μ12.5 L体积组成的 μL智商SYBR绿色Supermix (Bio-Rad), 500 nM通用DENV底漆。使用下列PCR扩增程序:10分钟在95°C,紧随其后的是45周期的20年代在95°C,和1分钟60°C退火和延伸。熔化温度( T 米 )曲线分析了放大,包括一个周期后变性在95°C 1分钟,其次是60°C 1分钟和斜坡到95°C 0.1°C的速度连续荧光测量,使用iQ5实时PCR机器,数据分析使用Bio-Rad软件2.1版本(Bio-Rad)。

 2.8。在多路实时PCR测定血清学分型

血清型测定使用通用DENV底漆对和4个不同serotype-specific DENV-probes在一个多重PCR反应。多重PCR反应进行描述为通用500海里的PCR DENV底漆(每个)和300海里的serotype-specific DENV-probe 1 - 4(表 1)。

 2.9。统计分析

使用SPSS统计分析软件对windows(版本16.0)。频率、手段或中位数计算来描述背景变量。协议被科恩kappa值表示。劳厄的特定类型引物PCR等人作为黄金标准计算的敏感性和特异性检测( 11]。

 3所示。结果 3.1。确定内部控制的动态范围,通用实时PCR DENV

可靠的检测和排除假阴性结果IC使用提取的整个过程,互补脱氧核糖核酸的合成,PCR反应。确定内部控制的动态范围提取、互补脱氧核糖核酸的合成,PCR过程进行连续稀释的IC飙升到裂解缓冲区包含负面的血清。IC限制稀释结果显示10张/ PCR的检测极限以100%的命中率(表 2)。然而,对于集成电路的可靠检测一个双工试验输入对应500册IC / PCR被选没有影响DENV的检出限 在体外RNA(结果未显示)。在后续实验中一个固定的数量 6.25 × 10 3 IC副本飙升的裂解缓冲之前提取和互补脱氧核糖核酸的合成。集成电路显示良好稳定Cq-values(意味着Cq-value 33.34)在验证。

动态范围的集成电路一个。

在提取IC册 在RT IC册 在PCR IC册b 阳性IC (%;意味着Cq-value & SD)
1.25 × 10 7 107 106 4/4 (100%;20.74;0.23)
1.25 × 10 6 106 105 4/4 (100%;24.80;0.43)
1.25 × 10 5 105 104 4/4 (100%;27.92;0.48)
1.25 × 10 4 104 103 4/4 (100%;32.08;0.71)
1.25 × 10 3 103 102 4/4 (100%;34.53;0.56)
1.25 × 10 2 102 101 4/4 (100%;36.93;0.72)
0 0 0 0/4

一个连续稀释10倍的动态范围确定IC飙升到裂解缓冲区包含DENV -人类血清作为背景,4为每个稀释复制。

b复制份数cDNA / PCR被计算为1/12.5提取RNA,假设提取效率100%,逆转录(RT)和PCR。

SD:标准差。

确定普通PCR的动态范围,我们连续稀释DENV上升10倍 在体外RNA与一个固定数量的IC为裂解缓冲包含DENV -血清前提取和互补脱氧核糖核酸的合成。随后10 μL的cDNA用于PCR。限制稀释DENV 在体外RNA导致定量检出限103/ PCR以66.7%的命中率(表副本 3)和回归系数为0.9967和6.25×10的动态范围3-6.25×107拷贝/毫升(图 1)。

动态范围的通用实时PCR一个。

DENV 在体外在提取RNA复制 DENV 在体外在RT RNA复制 DENV 在体外在PCR RNA复制b 在PCR IC册b 阳性DENV数量 在体外RNA (%;意味着Cq-value: SD) 阳性IC (%;南达科他州意味着Cq-value:)
1.25 × 10 7 107 106 500年 12/12 (100%;26.59;0.54) 12/12 (100%;35.82;1.08)
1.25 × 10 6 106 105 500年 12/12 (100%;30.59;0.46) 12/12 (100%;32.67;0.79)
1.25 × 10 5 105 104 500年 12/12 (100%;34.35;1.09) 12/12 (100%;32.97;0.74)
1.25 × 10 4 104 103 500年 8/12 (66.7%;37.22;0.73) 12/12 (100%;33.73;0.63)
1.25 × 10 3 103 102 500年 1/12 (8%;40.71) 12/12 (100%;32.24;0.60)
0 0 0 0 0/12 0/12

一个通用的动态范围PCR确定DENV 10倍稀释系列 在体外RNA在存在固定数量的IC飙升到裂解缓冲区包含DENV -人类血清作为背景和12复制/稀释。

b复制份数cDNA / PCR被计算为1/12.5提取的RNA。假设提取效率100%,逆转录(RT)和PCR。

SD:标准差。

泛型的PCR的动态范围。意味着Cq-values DENV十二复制每10倍稀释 在体外RNA提取的固定数量的 6 。 25 × 10 3 IC副本在背景提取DENV -血清和测试的通用实时PCR结果的动态范围 6 。 25 × 10 3 -6.25×107拷贝/毫升DENV 在体外RNA回归系数为0.9967。

 3.2。测定下限检测(LOD)

确定通用的LOD PCR试验2倍DENV系列稀释 在体外与每稀释20复制RNA进行固定数量的IC DENV -人血清分别飙升的背景在裂解缓冲之前提取。的LOD DENV 在体外RNA至少312册/ PCR对应1.95×104拷贝/毫升(表 4)。

LOD的通用实时PCR一个。

DENV 在体外在PCR RNA复制一个 在PCR IC册b 积极DENV数量 在体外RNA (%;意味着Cq-value: SD) 许多积极的IC (%;意味着Cq-value: SD)
2500年 500年 20/20 (100%;35.98;0.99) 20/20 (100%;33.43;0.65)
1250年 500年 12/20 (60%;36.96;1.13) 20/20 (100%;32.84;0.53)
1000年 500年 10/20 (50%;37.33;0.94) 20/20 (100%;33.66;0.53)
625年 500年 8/20 (40%;38.72;1.82) 20/20 (100%;32.61;0.59)
312年 500年 5/20 (25%;39.17;2.67) 20/20 (100%;32.69;0.34)
0 0 0/20 0/20

一个LOD的普通PCR是由2倍稀释系列DENV 20复制/稀释 在体外RNA在存在固定数量的IC飙升到裂解缓冲区包含DENV -人血清作为背景。

b复制份数cDNA / PCR被计算为1/12.5提取RNA,假设提取效率100%,逆转录(RT)和PCR。

LOD:降低检测极限;SD:标准差。

 3.3。内部,Inter-Assay变异

内部和inter-assay变化测量四个复制每稀释10倍稀释系列IC的定额DENV -血清的背景:intra-assay变化决定的三分在一天(结果未显示)和inter-assay变化表现在三个连续运行超过3天。分析变异显示稳定Cq-values DENV的IC,每个系列稀释 在体外RNA(表 5)。

Inter-assay变化的通用实时PCR一个。

运行和DENV 在体外在PCR RNA复制一个 在PCR IC册b 积极DENV数量 在体外RNA (%;意味着Cq-value: SD) 许多积极的IC (%;意味着Cq-value: SD) SD之间的3分
运行1
106 500年 4/4 (100%;26.28;0.43) 4/4 (100%;36.21;1.21) 0.27
105 500年 4/4 (100%;30.40;0.39) 4/4 (100%;33.10;1.37) 0.35
104 500年 4/4 (100%;33.78;0.38) 4/4 (100%;32.17;0.30) 0.22
103 500年 2/4 (50%;36.99;0.37) 4/4 (100%;33.64;0.29) 0.65
102 500年 0/4 4/4 (100%;32.47;0.20) - - - - - -
0 0 0/4 0/4 - - - - - -
运行2
106 500年 4/4 (100%;26.71;0.56) 4/4 (100%;36.11;0.84) 0.27
105 500年 4/4 (100%;30.35;0.19) 4/4 (100%;32.66;0.65) 0.35
104 500年 4/4 (100%;34.31;0.64) 4/4 (100%;33.32;0.39) 0.22
103 500年 3/4 (75%;37.08;0.86) 4/4 (100%;33.64;0.92) 0.65
102 500年 1/4 (25%;37.83) 4/4 (100%;32.73;1.09) - - - - - -
0 0 0/4 0/4 - - - - - -
跑3
106 500年 4/4 (100%;26.79;0.60) 4/4 (100%;35.13;1.06) 0.27
105 500年 4/4 (100%;30.98;0.50) 4/4 (100%;32.47;0.10) 0.35
104 500年 4/4 (100%;34.27;0.78) 4/4 (100%;33.24;0.54) 0.22
103 500年 1/4 (25%;38.17) 4/4 (100%;33.91;0.67) 0.65
102 500年 0/4 4/4 (100%;32.59;0.23) - - - - - -
0 0 0/4 0/4 - - - - - -

一个inter-assay变化确定DENV 10倍稀释系列 在体外RNA在存在固定数量的IC飙升到裂解缓冲区包含DENV -人类血清作为背景和4复制每个稀释。变化确定在三个独立的运行在三个不同的日子。

b复制份数cDNA / PCR被计算为1/12.5提取RNA,假设提取效率100%,逆转录(RT)和PCR。

SD:标准差。

 3.4。检测临床样本

一个固定数量的IC (5 μL)和200 μL病人的样本被添加到裂解缓冲之前提取和互补脱氧核糖核酸的合成。总体而言,通用PCR显示敏感性为95.8%,特异性为100%(表 6)。所有患者样本检测IC和DENV -真的是-。四个测试呈阳性的患者样本特定类型普通PCR引物PCR测试呈阴性反应。病人样品测试前的特定类型引物PCR ( 16, 17)和额外的冻融步骤可能影响的RNA质量这四个样品已经显示一个特定类型的高Cq-value接近37或更高引物PCR。较低(62.2%)的比例anti-DENV积极ill-returned旅行者在普通PCR积极的测试结果与anti-DENV积极越南患者相比(95.8%),与疾病的长期前ill-returned旅行者看到临床医生(表 6)。

总结病人特点和PCR检测的敏感性和特异性。

病人特点和测试参数 越南DENV患者 与DENV Ill-returned旅行者 其他原因发烧的旅行者 患者阳性
原发感染 继发感染 原发感染 继发感染 OFI 丙肝病毒、甲型肝炎 总
患者( n) 5 67年 21 16 9 (18)d 136年
年龄;中位数(范围) 10.9 (6.6 - -12.8) 18.9 (5.6 - -53.1) 38.7 (17.4 - -62.6) 33.2 (24.6 - -73.6) 39.5 (26.3 - -64.0) 未知的 26.3 (6.6 - -73.6)
性(M / F) 3/2 48/19 9/12 6/10 6/3 未知的 72/46
天的疾病报告;中位数(范围) 1 (1 - 1) 1 (1 - 4) 6 (1 - 12) 8.5 (4-22) - - - - - - - - - - - - 2(22页)
天的DENV病毒血症;中位数(范围) 1 (1 - 1) 1 (1 - 4) 4 (1 - 11) 7(4 - 9日) - - - - - - - - - - - - 1 (1 - 11)
患者( n )和一个积极的结果
特定类型聚合酶链反应一个 5 66年 16 9 0 ND 96年
通用的聚合酶链反应b 3 66年 15 8 0 0 92年
多重聚合酶链反应c 3 63年 11 3 0 ND 80年
分析常规PCR的特征
敏感性;%(95%置信区间) 60.0 (23.1 - -88.2) 100.0 (94.5 - -100.0) 93.8 (71.7 - -99.0) 88.9 (56.5 - -98.0) - - - - - - - - - - - - 95.8 (89.8 - -98.4)
κ价值 0.736 1.000 0.944 0.924 0.846
特异性;% 100.0 100.0 100.0

一个结果早期生成的特定类型引物PCR显示根据劳厄et al。 11, 16, 17]。

b内部控制的通用实时PCR DENV。

c多重PCR与特定类型探测器只是做样品一个积极的通用PCRb结果。

d16个病人抗体和PCR阳性丙肝病毒和2患者抗体和甲肝病毒PCR阳性。

OFI:其它发热性疾病;丙肝病毒:丙型肝炎病毒;甲型肝炎:甲肝病毒;M:男性;F:女性;95%置信区间:95%置信区间,ND:没有完成。

 3.5。血清学分型,SYBR-Green

自从SYBR-green实时PCR不需要特定类型引物或探针,结果可以获得一个实时PCR检测项目的具体融化曲线( T 米 )。我们使用了cDNA从面板的病人已知感染DENV血清型1到4普通PCR和先前测试的积极。的 T 米 曲线DENV-1然而,DENV-2、DENV-3 DENV 4互相太近(84.90°C, 83.60°C, 85.80°C,和84.70°C),使所有四种血清型之间的歧视。同时,不同的病毒载量影响融化温度使血清学分型的DENV SYBR-green PCR不可靠(结果未显示)。

 3.6。血清学分型的多路实时PCR Serotype-Specific调查

serotype-specific的多重PCR探针只应用于互补的92患者样本有一个积极的测试结果在普通PCR。这些样品之前的DENV血清型决定使用特定类型的引物PCR(表 7多重PCR)和测试盲目。通用PCR检测所有4 DENV种血清型。特定类型的多重PCR探针正确识别DENV血清型在80年的92(87%)患者样本。这12个患者样本,不能在我们的多路检测血清型Cq-values接近38普通PCR或更高。在三个患者样本感染两种血清型与特定类型引物PCR检测,而由多重PCR serotype-specific探测中,检测出一种感染两种血清型7的80患者样本(表 7)。在第一个血清型病毒血症水平高于第二个血清型。

血清学分型的多路实时PCR serotype-specific调查。

血清型 不。的患者积极的在接下来的化验 不。两种血清型的感染检测到以下化验(DENV感染血清型)c
特定类型聚合酶链反应一个 通用的聚合酶链反应 多重聚合酶链反应b 特定类型聚合酶链反应一个 多重聚合酶链反应b
1 39 Pos (39) 30. 3 ( 1 + 2 ) 4 ( 1 + 4 )
2 19 Pos (19) 17 0 1 ( 2 + 1 )
3 3 Pos (3) 2 0 1 ( 3 + 4 )
4 31日 Pos (31) 31日 0 1 ( 4 + 2 )
总 92年 92年 80年 3 7

Pos:普通PCR可以使血清型之间没有区别。

一个结果早期生成的特定类型引物PCR根据劳厄et al。 11, 16, 17]。

b多路实时PCR与serotype-specific探针只有在普通PCR阳性结果。

c已经指定了一个DENV感染两种血清型的血清型信号先上来,显示最高的病毒载量。

 4所示。讨论

DENV感染已经成为一个主要的国际公共卫生问题由于增加的地理分布向量( 1),国际旅行的增加伴随着增加确认DENV感染ill-returned旅行者( 4),和缺乏可交叉反应的免疫循环的四个不同的DENV血清型和省级行政区呈高度流行)的四种血清型在同一地区。这些都是因素扮演了一个重要的角色在DENV带来的威胁。

一个固有问题在实时PCR扩增抑制剂的存在可能会导致假阴性结果 。一份RNA是一种理想的“非竞争性”作为过程控制的内部控制已经被其他研究证明。为任何用户一份RNA是商用,RNA是一种稳定的、非传染性的缺席人体临床样本,是一个非竞争性的控制不与所选引物和探针DENV反应。我们的通用实时PCR试验能够增强四种已知血清型在一个PCR反应和显示一个好的线性( R 2 = 0.9967 )动态范围为6.25×103-6.25×107拷贝/毫升和LOD至少1.95×104拷贝/毫升。内部和inter-assay变化显示稳定Cq-values (SD < 0.70)为每个DENV系列稀释10倍 在体外RNA。6.25×10的病毒载量3拷贝/毫升仍然可以检测到与确定性Cq-value 40的普通PCR在8%的情况下(表 3)。因此,病人样本被认为是积极的在普通PCR如果Cq-value低于40。DENV通用引物和各种探测器是基于一个高度保守的区域在3′utr的DENV(图 2)。DENV可能导致遗传多样性和准种PCR准确性作为丙肝病毒已被证明,黄病毒的另一个家庭成员。然而,变化和生物变异非常低的比例DENV(未公开的数据)。的目标描述DENV PCR很小(157个基点),我们不能描述quasi-species-like,例如,丙肝病毒,而且没有外部选择压力像DENV-specific抗病毒药物或疫苗影响序列的扩增子DENV用于检测。

多重序列比对DENV 3′UTR区域推导出完整的基因组序列的登革热血清型1 - 4 (DENV 1 - 4)从基因库中获得显示用于通用引物和探针序列和/或多路实时PCR检测DENV serotype-specific探针 在体外RNA和DENV患者样本。

描述的比较通用的实时PCR和描述特定类型引物PCR早些时候使用118患者样本显示,一个优秀的两者之间的一致性检测的敏感性为95.8%,特异性为100% ( 11]。病人样本中没有检测到我们的普通PCR量化与病毒载量很低(约4.16×104拷贝/毫升)的特定类型引物PCR。造成的额外的冻融步骤血清学测试使用相同的样品管,特定类型的引物PCR分析,对于我们普通PCR分析可能导致退化DENV RNA的RNA样品。患者样本可以分成整除冻融的影响降到最低。

我们尝试SYBR-green实时聚合酶链反应对血清学分型,因为它是便宜和容易执行特定类型相比,引物或探针化验。SYBR-green测定结果表明,病毒载量和四种血清型之间的密切相似影响每个血清型的融化温度(数据未显示),使得它难以获得可靠的结果,这也在先前的研究 10, 18]。因此,我们开发了一种多路实时PCR试验使用四个serotype-specific探测器在一个PCR反应显示可靠的结果区分4 DENV患者样本中的血清型。80年我们能够区分种血清型的92患者样本,曾积极普通PCR结果,与多路复用分析(87%)的敏感性,和7同时感染两种血清型被发现。12个患者样本不能血清型有Cq-values接近38或更高的普通PCR可能是由于通用之间的差异的敏感性和多重PCR在多重PCR和竞争。共有109名患者有积极的抗体DENV - 92病人在我们普通PCR阳性。这种差异可以解释为相对较高的平均日ill-returned旅行者出现症状后访问一个临床医生和多个冻融的步骤。ill-returned旅行者- PCR结果但积极抗体DENV参观了医生后6天的中位数(原发感染;范围1到12天)和8.5天(继发感染;范围4 - 22天)的疾病,可能后的抗体出现DENV已经从血液中消失了。已经假定DENV可以检测到大约到5天出现症状后PCR,不管血清型( 11]。

我们的研究描述了一个具体的、敏感的和内部控制的通用实时PCR检测早期检测DENV和血清型的多路复用的可能性。筛查患者的内部控制,普通PCR测定DENV和应用多重PCR试验类型只有在积极的样品会比执行一个更具成本效益的打字PCR在所有样本。许多发表的多路复用化验使用混合血清型特定类型的引物和探针使试验更敏感、更昂贵的( 10]。其他多重PCR都不是真正的多重PCR检测是因为它是由两个独立的双工的PCR检测,每一对探测器DENV 1 - 3或DENV 2 - 4 ( 18]。

描述分析是一项重要的补充工具DENV诊断的患者在疾病的早期阶段。

 缩写 DENV:

登革病毒

 集成电路:

内部控制

 丙肝病毒:

丙型肝炎

 甲型肝炎:

甲型肝炎

 聚合酶链反应:

聚合酶链反应

 RT:

反转录

 登革出血热:

登革出血热

 决策支持系统:

登革休克综合征

 NS1:

1非结构蛋白

 阿瑟:

抗体

 Ag:

抗原

 LOD:

降低检测极限

 Cq-value:

周期量化。

 确认

作者要感谢Hakima Belkasim技术援助,博士Edou Heddema向他们提供DENV -但是甲肝病毒和丙肝病毒阳性样品,和尼古拉斯·格里芬。k·t·d·支持泰国马赛克奖学金从荷兰科学研究组织(NWO),批准号017.004.074。

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