改善患有叶酸受体自身免疫和营养紊乱的婴儿自闭症的预后:一项自我对照试验gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba．与多种罕见的单基因异常相比，在婴儿自闭症儿童及其父母中常见的生物标志物是针对叶酸受体α (FR)的血清自身抗体gydF4y2BaαgydF4y2Ba的）定位在血脑和胎盘屏障，损害生理叶酸传递到大脑和胎儿。由于行为干预后结果仍然差，试验的目的是治疗的叶酸受体α（FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba)自身免疫结合纠正因饮食习惯异常引起的营养不良。gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba．所有患有非综合征性婴儿自闭症的参与者都接受了常规的CBC、铁、维生素、辅酶Q10、金属和微量元素检测。血清FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba在患者，父母和健康对照中评估了自身抗衡性。一种自控治疗试验治疗营养紊乱，如果fr，则添加高剂量叶酸gydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体检测呈阳性。童年自闭症评定量表（CARS）监测在基线和未来2年的治疗进行了比较，以作为参考未处理自闭症儿童的汽车。gydF4y2Ba结果gydF4y2Ba．在这个自我控制的试验中(82名儿童;平均年龄±SD: 4.4±2.3岁;男:女比例:4.8:1)，FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba在75.6%的儿童、34.1%的母亲和29.4%的父亲中发现了自身抗体，而在健康对照组中仅为3.3%。与未治疗的CARS评分保持不变的自闭症患者(n=84)相比，经过2年治疗后，最初的CARS评分从严重(平均±SD: 41.34±6.47)降低到中度或轻度自闭症(平均±SD: 34.35±6.25;配对t检验p<0.0001)，有17/82名儿童(20.7%)完全康复。FR越高，预后越差gydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体滴度，母体FR阳性gydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体，或FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba父母双方的抗体。gydF4y2Ba结论gydF4y2Ba．纠正营养不足联合大剂量的叶酸改善了自闭症的结果，尽管由于母亲FR的不良预后的趋势gydF4y2BaαgydF4y2Ba抗体或FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba父母双方的抗体可能需要在怀孕前和怀孕期间进行叶酸干预。gydF4y2Ba

1.介绍gydF4y2Ba

自闭症谱系障碍表现为神经发育障碍，其特征是交际和非交际技能的定性损伤、社交能力受损和刻板印象的兴趣有限。早期的分类区分了婴儿自闭症、阿斯伯格综合症、儿童解体障碍、广泛性发育障碍和雷特综合症。gydF4y2Ba

到目前为止，还没有确定单一病因或共同的最终途径来解释所有自闭症谱系障碍的共同特征，尽管一些不同的单基因、传染性、毒性或环境原因与少数病例相关[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在胎儿期，叶酸充足递送至胚胎发育是必要的，以防止神经管缺陷（NTD）以及可能的其它先天性畸形[发生gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．母亲叶酸缺乏不仅会增加NTD的风险，而且还会增加自闭症谱系障碍(ASD)的风险[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．即使母体叶酸水平正常，母体血清FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba针对FR的自身抗体gydF4y2BaαgydF4y2Ba显示在胎盘屏障的局部化，以阻止穿过胎盘穿过胎盘的足够叶酸递送，易于宫内叶酸缺乏，随后的先天性畸形或自闭症谱紊乱[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．出生后血清FR的发展gydF4y2BaαgydF4y2Ba-针对FR的自身抗体gydF4y2BaαgydF4y2Ba约1/3的病例中，依附于血脑屏障上的脉络膜丛上皮细胞导致了与自闭症相关的所谓婴儿型脑叶酸缺乏(CFD)综合征。随后的研究也证实了血清FR的高患病率gydF4y2BaαgydF4y2Ba在没有神经缺陷的自闭症谱系障碍中的自身抗体，其中这些frgydF4y2BaαgydF4y2Ba在该儿童及其父母身上均发现了抗体[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此前对自闭症的研究表明，氧化应激易感性增加和甲基化能力下降是导致自闭症的因素[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．然而，现有的证据是异质的，并且由于许多研究受到小尺寸的限制，因此尚无定论[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．进一步的研究假设氧化应激下的线粒体功能障碍[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．氧化应激是指前氧化因子和抗氧化剂之间的不平衡，导致活性氧(ROS)的大量产生，即超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基。这些ROS具有高度活性的未配对电子，能够引发对蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、脂类和DNA分子的损伤的级联生化反应。由于自闭症患者经常表现出进食困难，因此维生素、金属和微量元素的过量或多重缺乏就不足为奇了，其中一部分是中间脑代谢和抗氧化防御的必要营养素和辅助因子，如抗氧化酶和自由基清除剂的辅助因子[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．因此，除了线粒体功能障碍，自闭症患者的进食障碍和吸收不良可能代表了氧化应激的其他机制，这是由于增加的前氧化因子和/或抗氧化防御机制的失败。喂养干扰扰乱营养浓度的另一个方面是这些异常的营养浓度对大脑发育、培养、结构、神经代谢过程和基因表达调控的负面影响。gydF4y2Ba

在之前的研究中，我们发现超氧阴离子的生成gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba可在1小时内将5-甲基四氢叶酸分解75%，可通过与自由基清除剂抗坏血酸预孵育加以预防[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．本研究还发现，kb细胞培养暴露于超氧阴离子和过氧化氢可减少FR介导的细胞叶酸掺入gydF4y2BaαgydF4y2Ba或RFC1传输机制。因此，在ROS存在的情况下，由这些转运体介导的胎盘和脉络膜丛的跨膜叶酸通道将受到损害，并容易导致宫内叶酸缺乏和大脑叶酸缺乏。gydF4y2Ba

出于这些原因，我们的研究设计的第一个目的是识别和校正异常营养紊乱，特别是那些通过升高的促氧化物和/或缺乏抗氧化因子介导的氧化应激的标记。此外，我们筛查了血清FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba在发现抗体阳性结果后，对自闭症儿童及其父母进行高剂量的叶酸补充。我们根据FR的发现，选择了一项针对每个个体的自我控制治疗试验gydF4y2BaαgydF4y2Ba抗体和异常营养价值。与年龄和性别相匹配的未接受治疗的患者的CARS变化相比较，我们在基线和治疗两年后对CARS进行了监测，患者作为自己的对照组。gydF4y2Ba

2.患者和方法gydF4y2Ba

2．1.参与者gydF4y2Ba

诊断调查包括ADI-R和ADOS测试、儿童自闭症评分量表(CARS)、发育和语言评估、广泛的心理和精神评估，以及在学校或国内情况下的观察。每位患者都有完整的病史、体格和神经检查，并接受了脑MRI和长时间的脑电图登记。gydF4y2Ba

CARS评分是基于15个独立项目的累积得分，得分低于30表示没有足够的自闭症迹象和症状，得分在30到36之间gydF4y2Ba符合轻度至中度自闭症，37至60分符合重度自闭症[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．常规调查包括代谢筛查，测定尿氨基酸和有机酸，以及肌酸和胍乙酸排泄。基因检测包括Angelman综合征、脆性x综合征、MECP2基因缺陷、染色体分析和阵列CGH检测微缺失或微重复。gydF4y2Ba

在排除脑异常、难治性癫痫、代谢和可识别的遗传异常或综合征后，只招募诊断为非综合征性婴儿自闭症且无遗传异常的患者。gydF4y2Ba

2.2。自控治疗试验设计gydF4y2Ba

这项自我控制干预试验得到了纽约州立大学伦理委员会和列日大学医院伦理委员会的批准(方案:FOL040113)。部分资金由Autism Speaks(第8202号Grant to EVQ)提供，用于检测叶酸受体自身抗体。gydF4y2Ba

招募的非综合征性幼儿自闭症患者被分为两组，未治疗的患者作为参考组(n=84)和参与并完成自我对照试验的治疗组(n=82)。根据年龄、性别、CARS评分和FR对两组进行匹配gydF4y2BaαgydF4y2Ba-儿童和父母的抗体谱。在2013年至2018年进行的自我控制治疗研究中，两组的所有自闭症患者都进行了空腹抽血，以检测全血细胞计数(CBC)、血清和红细胞叶酸、维生素BgydF4y2Ba ，gydF4y2Ba血浆同型半胱氨酸、肾功能和肝功能、甲状腺功能(TSH、T3、T4)、乳酸、CPK、碱性磷酸酶、血清铁、转铁蛋白和铁蛋白、钙、镁、胆固醇和载脂蛋白B、铜和蓝蛋白、锌、锰、硒、辅酶Q10、维生素E和生育酚、维生素A和-胡萝卜素、血清样本检测抗麦胶蛋白抗体和FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba患者及其父母体内的结合和阻断型自身抗体(见下文)。gydF4y2Ba

在本研究之前，未接受治疗的患者(n=84)的年龄在1 - 16.8岁之间，他们的CARS被绘制成年龄的函数，提供了未接受治疗的患者CARS随着年龄的进展而发生的变化。同样，完成自我对照试验的参与患者(n=82)的CARS在基线和治疗2年后绘制。后者患者的年龄在1 - 15.9岁之间。gydF4y2Ba

基于以往抗氧化缺乏和血清FR的病例对照研究的经验gydF4y2BaαgydF4y2Ba在发现抗体后，我们为每个个体制定了一套适合的治疗方案，旨在通过口服补充剂纠正营养紊乱(营养不足或过量)(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.在至少两年的研究期间，每3-4个月复查一次血液水平，并据此调整补充用药。此外，开始口服高剂量的叶酸，剂量为0.5-1 mg/kg/天，如果FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体呈阳性[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．如果6个月后没有出现临床反应，可将叶酸剂量增加至2毫克/公斤/天，每日最大剂量为50毫克[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．在这项自我对照试验中，CARS评分在治疗两年多后重复进行，并与基线时的CARS评分进行比较。我们还观察了CARS评分随初始血清FR的变化gydF4y2BaαgydF4y2Ba儿童自身抗体滴度和作为一个功能的八个不同的组合为每个家庭FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba孩子和父母双方的自身抗体检测呈阴性，或FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba抗体只在孩子、母亲、父亲或其任何组合中呈阳性。gydF4y2Ba

２.３.血清FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体gydF4y2Ba

阻断和结合FR的检测gydF4y2BaαgydF4y2Ba自体抗体以前已经被描述过。阻塞FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体以pmol叶酸与FR结合受阻的形式表达gydF4y2BaαgydF4y2Ba每毫升血清和结合FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体以每ml血清IgG抗体pmol的形式表达[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．对30名健康对照(年龄范围:1-18岁)及其父母的血清进行FR检测gydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体。gydF4y2Ba

3.结果gydF4y2Ba

3．1.治疗自闭症患者gydF4y2Ba

一组84名患者没有同意参加治疗试验，但同意进行上述常规实验室检测。年龄(平均±SD: 4.45±2.62;范围:1-16.8岁)，性别(男女比例:5.46:1)，血清FR抗体谱(71.4%儿童检测阳性;30.8%的母亲和27.4%的父亲血清样本检测呈阳性)，与同意参与并完成自我对照治疗试验的82人相匹配。与82例接受治疗的患者的CARS基线评分相比，84例未接受治疗的患者的CARS评分匹配，从2岁至6岁及以上年龄组的各个年龄组的功能无统计学差异(图)gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba）.未经治疗的患者组CARS评分的演变没有随着年龄的增长而发生显著变化。然而，治疗组6岁或6岁以上儿童的基线CARS评分高于2岁和3岁最小年龄组的基线CARS评分(见图)gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba、表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

３．２．自控治疗试验gydF4y2Ba

知情同意后，共115名诊断出患有严重的自闭症儿童的两年间最初招募了自控治疗试验。十个孩子在底层，因为综合征或遗传因素的研究排除参与。一个孩子的父母是第一线的堂兄弟;从鲁宾斯坦 - 泰比综合征遭遇一个孩子，另一个孩子和他的母亲有MECP2重复，一个孩子得了gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba1例患者为SLC6A4 p.G56A基因和SLC29A4 p.D326E基因杂合子，分别编码SERT和PMAT蛋白。在另外5个有12p11.21微缺失的儿童和另外4个有微重复的儿童(位于2q22.2-q23.3、8p23.3、16p11.2)以及1个在染色体15q11.2和15q26.3处有两个微重复的儿童中发现了拷贝数变异。在所有被调查的自闭症婴儿患者中，没有人患有先天性代谢错误、食物过敏或乳糜泻。gydF4y2Ba

105名自闭症儿童中，82名儿童(年龄平均±标准差:4.4±2.3;范围:1 - 15.9年;男/女比例:4.8-1)完成自检试验(图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)， 23名儿童因检查结果不完整、依从性差或未参加随访而被排除。血清中含有FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba- 在所有儿童的75.6％中，在母亲的34.1％和29.4％的父亲中发现这些抗体。相比之下只有3％的健康控制（年龄范围：1-18岁），父母对血清FR进行了阳性gydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体。考虑到孩子、母亲和父亲的每个三人组中存在或不存在自身抗体，每个三人组中存在8种特定抗体谱的可能组合。我们只发现9/82个家庭(11%)属于FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba孩子和父母的抗体检测均为阴性。在89%的家庭中，FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba-自身抗体存在于孩子和/或父母一方或双方。gydF4y2Ba

根据实验室结果，每个个体的治疗方案包括补充剂联合大剂量叶酸(0.5-1 mg/kg/天)，如果FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体被发现。所有82名自闭症儿童的CARS在基线时的平均值与重度自闭症相符(平均值±SD: 41.34±6.47)，治疗2年后，CARS显著下降至34.35的平均值，表明轻度至中度自闭症(平均值±SD: 34.35±6.25;配对学生t-检验= 11.72,p<0.0001)。82名儿童中有17名(20.7%)在接受治疗后，CARS得分低于30分，这与没有自闭症特征一致。大多数(14/17)后一种儿童在5岁前开始治疗。gydF4y2Ba

汽车得分在每年群体的治疗范围内显着降低，从2年或超过6岁或以上。然而，由于在60岁或以上的儿童的平均±5.2岁的平均值±6.2岁的平均值±5.2岁的平均±5.2岁以上，患者达到39.35±6.46的基线汽车（UNAIRAPED T-TEST 2.23和P = 0.038）尽管对自闭症核心标志类似的治疗效果类似，但最终的汽车结果仍然持平。因此，随着儿童增长的增长和治疗开始于5年后的后期（见图，最终结果变得越差（见图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba）.然而，在未治疗组中，随着年龄的增长，CARS评分没有显著变化，因为他们的CARS评分在2岁时的平均值为41.92，在6岁或更大的儿童中为41.75。gydF4y2Ba

我们评估了所有父母FR阴性的儿童的治疗效果gydF4y2BaαgydF4y2Ba-抗体，作为FR的功能gydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体滴度。对于15名自闭症儿童的组织，在治疗后，汽车得分（δ汽车）的下降显着较大gydF4y2BaαgydF4y2Ba与17名儿童相比，阻断型自身抗体呈阴性或低滴度，达到0.44 p mol FR阻断/ml血清(Δ CARS均值±SD: 7.4±5.22)gydF4y2BaαgydF4y2Ba抗体滴度在0.44以上(Δ CARS均值±SD: 4.2±3.36;t = 2.08, p = 0.0455)。gydF4y2Ba

每一个特定的profile在68个家庭中，阳性或阴性FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba在儿童、母亲或父亲中可获得的抗体，与服用补充剂和叶酸治疗前后CARS相关(见图)gydF4y2Ba1（c）gydF4y2Ba）.两个家庭都没有显示在图gydF4y2Ba1（c）gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba因为他们代表了一个只有FR的家庭gydF4y2BaαgydF4y2Ba父亲和一个家庭的自身抗体检测呈阳性，但孩子呈阴性。在只有父亲呈FR阳性的家庭中gydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体，他女儿最初的CARS从36下降到30gydF4y2Ba纠正她的抗氧化剂和维生素B后gydF4y2Ba缺陷。在父母双方检测均为阳性的家庭中，尽管进行了治疗，但在42岁时的初始CARS在2年后没有显著变化(CARS 41.5)。gydF4y2Ba

其他家庭的结果表明，存在阳性的母亲FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba往往是具有较高CARS相关抗体得分在基线，也导致了两年后处理较差的最终结果。但是，组之间的基线分数CARS阳性母体抗体（N = 5），并与在子（N = 9）中不存在抗体和父母组相比没有达到统计学上显著差异。特别是，当父母和孩子检测呈阳性，高初始CARS得分治疗后下降，但这个并不代表高度显著变化（P = 0.0398）。有趣的是，九个科，那里的孩子和父母双方均无FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体但只具有抗氧化或其它营养缺乏，具有高的平均得分CARS在42.05±6.8，其处理后显著下降到一个CARS得分的33.88±8.19。gydF4y2Ba

３．３．营养紊乱gydF4y2Ba

对参与自我对照治疗试验的82名儿童(n=82)的血液参数测量结果显示，维生素、金属和微量元素普遍缺乏或过量，远远低于或高于为年龄匹配的健康对照建立的参考值的上下限。gydF4y2Ba

最常见的缺乏是维生素A(65.8%)和维生素D(62.2%)，血清铁(25.6%)，铁蛋白(11%)，血清叶酸(18.3%)和红细胞叶酸(18.3%)，中度载脂蛋白B缺乏(16%)。其他缺陷依次递减，-生育酚(13.4%)、锰(8.5%)、硒(8.5%)、辅酶Q10(7.3%)、-胡萝卜素(6%)、锌(4.8%)、维生素C(3.6%)和维生素E(3.6%)。锌(11%)、硒(8.5%)、锰(6%)、铜(2.4%)和-胡萝卜素(2.4%)的值升高，而铜和锌之间的平衡失调导致铜/锌比例增加，发现24.3%的所有患者。gydF4y2Ba

许多患者同时存在多种维生素、金属和微量元素缺乏症，并接受了补充，建议他们调整饮食，食用富含缺乏症因素的食物。铜/锌比值升高、金属(锌、铜、硒、锰)升高或-胡萝卜素增加(作为氧化剂)的患者接受高剂量维生素C和E治疗，作为脂质和水室自由基清除剂(见表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

对于海拔或不足血营养水平进行复查每3-4个月，和治疗相应的调整。有趣的是，要注意孩子从9个科，其中FR自闭症gydF4y2BaαgydF4y2Ba在治疗两年后，抗体的缺失对营养因子的纠正有反应，并且显示出基线CARS从平均±SD(42.05±6.8)显著下降到平均±SD(33.88±8.19)。gydF4y2Ba

4.讨论gydF4y2Ba

我们的方法改善自闭症的结果，纠正营养失调和FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba-自身免疫已被这些发现证实。这也证明了FR治疗后效果更好gydF4y2BaαgydF4y2Ba抗体缺失或滴度低(< 0.44 pmol FR)gydF4y2BaαgydF4y2Ba阻断/ ml)， FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体不存在于母亲或父母双方。虽然在未治疗组中，随着年龄的增长，基线CARS保持稳定，但治疗组6岁或6岁以上儿童的基线CARS显著高于2岁和3岁年龄组的基线CARS。在两组中，随着年龄的增加，基线CARS的差异是当前研究的一个局限性，可能归因于各年龄组患者相对较少。在两组之间，除了年龄、性别和FR之外，CARS基线的差异是唯一不匹配的参数gydF4y2BaαgydF4y2Ba儿童和父母的自身抗体谱与未治疗组匹配。gydF4y2Ba

因为治疗涉及纠正营养紊乱和FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自体免疫，以下问题仍然存在:就临床改善而言，哪种治疗策略是最有效的?来自9个家庭的有限数量的自闭症儿童gydF4y2BaαgydF4y2Ba孩子体内缺乏自身抗体，父母双方在接受确定的营养紊乱治疗后，CARS评分均有显著改善。这强调了一个重要的问题，即不仅要考虑使用高剂量的叶酸补充剂治疗FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身免疫，也包括纠正由于喂养问题而共存的营养紊乱，这在自闭症谱系障碍患者中经常发生。在这种情况下，应该强调乳糜泻可能是营养吸收不良的原因，应该考虑在自闭症儿童中进行特殊抗体测试。在我们的研究中，我们只在未接受治疗的参照组中发现了1例乳糜泻患儿。伴随营养紊乱而产生的进食问题在自闭症患者中很常见，并被认为是由于对某些食物(尤其是水果和蔬菜)的选择性或厌恶，加上味觉、嗅觉或口腔感觉障碍[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

一些研究表明，孕妇在怀孕期间叶酸缺乏不仅会增加神经管缺陷的风险，而且还会增加患自闭症的风险[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．最近的一项研究发现，孕妇在怀孕期间服用叶酸补充剂可以降低患自闭症谱系障碍的风险。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．虽然这方面和其他研究支持怀孕期间叶酸缺乏的关联，但自闭症的风险增加[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，这些研究没有考虑父母FR的存在gydF4y2BaαgydF4y2Ba自体抗体，我们在自闭症儿童的母亲和父亲中发现的[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在FR的情况下，gydF4y2BaαgydF4y2Ba在母亲的自身抗体检测中，通常在怀孕前和怀孕期间规定的叶酸剂量很可能是不够的[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们的自我对照治疗试验表明，孕妇FR的存在gydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体或FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba在受影响的自闭症儿童中，父母双方的抗体往往与较高的CARS初始基线评分有关。因此，这可能解释了尽管每组患者数量较少，无法进行深入的统计分析，但最终结果和2年治疗后CARS评分的变化相比其他所有组都不太明显。当更多的患者被纳入类似的治疗试验时，这些问题将得到澄清。我们的发现在68个家庭中有7个(10%)没有发现FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba而FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba仅在母亲(N=5)、父亲(N=1)或双亲(N=1)中检测到抗体。虽然每个孩子的喂养和营养问题都必须考虑在内，但这一发现表明，父母的FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba抗体可削弱叶酸转运到卵母细胞和spermatozoides并且还阻止跨过胎盘屏障足够叶酸运输到胚胎和胎儿。因为足够的叶酸池是必不可少的嘌呤和嘧啶的合成，以及用于介导涉及DNA甲基化和组蛋白修饰，初始胚胎发育和神经发育将在很大程度上依赖于足够叶酸可用性的后续阶段，表观遗传机制。因此，自闭症，其预后差在后代的风险与父母的FR相关gydF4y2BaαgydF4y2Ba抗体权证FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba对未来的父母进行测试，然后在怀孕前和怀孕期间进行叶酸干预。gydF4y2Ba

与自闭症相关的常见进食障碍可能会引起氧化应激，这是由于营养状态的改变，通过诱导芬顿化学，升高的金属(铜、锰)或-胡萝卜素作为氧化剂。清除自由基的维生素(维生素A，维生素C，维生素E和-生育酚)以及金属和微量元素(铜，锌，锰和硒)作为抗氧化酶的辅助因素，营养缺乏容易导致抗氧化防御的失败。有相当一部分自闭症患者存在中度载脂蛋白B缺乏，导致脂溶性维生素a、D、E和k缺乏，线粒体代谢所必需的一些维生素和辅酶Q10缺乏，将导致线粒体功能障碍。因此，大脑中的氧化应激一方面是由于线粒体功能障碍、氧化剂升高或缺乏抗氧化剂和FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba另一方面，自身免疫代表自闭症基础上的两个独立变量，每个变量的修正都显示出临床反应，CARS评分下降。因此，除了治疗FRgydF4y2BaαgydF4y2Baautoimmunity [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]，需要特定的补充来纠正营养不足，以改善中间代谢和中和丰富的活性氧(ROS)扰乱大脑代谢和功能。如上所述，我们在这项研究中的发现表明，FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba作为各自车得分显著回落在孩子和父母，只有通过营养紊乱的纠正受益抗体检测阴性。gydF4y2Ba

在我们的研究中，我们还发现18.3%的患者血清和红细胞叶酸缺乏。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究支持氧化应激和紊乱的叶酸稳态之间存在联系的概念。在之前的研究中，我们发现超氧阴离子的生成gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba可在1小时内将5-甲基四氢叶酸分解75%，可通过与自由基清除剂抗坏血酸预孵育加以预防[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．本研究还发现，暴露于超氧化物阴离子和过氧化氢的培养中的KB细胞减少了由Fr介导的细胞叶酸掺入gydF4y2BaαgydF4y2Ba或RFC1传输机制。因此，在ROS存在的情况下，由这些转运体介导的胎盘和脉络膜丛的跨膜叶酸通道将受到损害，并容易导致宫内叶酸缺乏和大脑叶酸缺乏。gydF4y2Ba

ROS在表达神经元非合成酶的神经元内的过氧硝酸盐形成促进氮化胁迫，导致神经元功能障碍和细胞凋亡[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

因此，gydF4y2Ba体内gydF4y2Ba超氧阴离子的生成促进了no -合成酶阳性神经网络中过氧亚硝酸盐的形成(图)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.神经元叶酸缺失将进一步损害叶酸依赖性gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba嘌呤的合成与腺苷和鸟苷的生产。随后的低鸟苷三磷酸(GTP)合成，即限速酶GTP-环水解酶I的底物，将减少四氢生物蝶呤(BH4)的生成[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．低BH4作为色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶和NO合酶的辅助因子，会降低这些酶的活性，减少血清素、多巴胺和NO的产生。此外，在低BH4存在的情况下，NO合酶的酶活性会发生转移，开始产生亚硝基过氧亚硝酸盐而不是NO [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．死后脑组织研究已经证实，在自闭症患者的大脑中存在氧化和亚硝化应激的生物标志物，因为在大脑皮层区域和小脑中发现了高浓度的8-羟基脱氧鸟苷和3-硝基酪氨酸[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．尽管目前的研究没有记录到翼素、神经递质和NO的代谢紊乱，但众所周知的与自闭症相关的共病，如多动症、焦虑、强迫症和睡眠问题，支持了这一假设。gydF4y2Ba

与脑叶酸消耗相关的嘌呤合成减少的另一个后果是作为ATP底物的腺苷产量降低，这可能会导致线粒体功能障碍，也会导致线粒体DNA库维护不足。gydF4y2Ba

特定脑营养缺乏的进一步后果会导致氧化应激，影响关键酶和中间代谢的功能，并导致DNA结构和功能的改变。过氧亚硝酸盐使5 -羟色胺和多巴胺合成的限速酶失活，即色氨酸和酪氨酸羟化酶通过巯基氧化在酶底物结合位点，那里的蛋白质富含半胱氨酸残基[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．过氧亚硝酸盐也会使蛋白质酪氨酸残基亚硝基化，但这对酶活性的影响很小[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．此外，氧化诱导神经元色氨酸羟化酶2个聚集体通过二硫化物交联[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．因此，活性氧和过氧亚硝酸盐的生成，由于叶酸的缺乏而增强，减少了多巴胺、NO，特别是血清素的生成，这得到了先前的研究结果的支持，已知低血清素的生成影响了大约1/3的自闭症患者[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

暴露于氧化应激导致多种适应机制与抑制BgydF4y2Ba -gydF4y2Ba依赖的蛋氨酸合成酶活性，对蛋氨酸循环产生负面影响，SAM产量减少，导致>100甲基转移反应失败[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．同时，氧化应激增加了胱硫氨酸- β -合酶的活性，该酶将同型半胱氨酸从蛋氨酸循环转移到硫转途径，以增加半胱氨酸和谷胱甘肽的合成，作为对氧化应激升高的适应机制[gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba］．在这种情况下，低脑甲基四氢叶酸的可用性由于FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身免疫进一步抑制蛋氨酸合酶活性，并加剧蛋氨酸循环向硫转循环的转变。因此，氧化应激将导致抗氧化谷胱甘肽的代偿性增加，并将下调细胞甲基化能力。gydF4y2Ba

ROS还与DNA嘌呤和嘧啶组分直接反应，导致DNA链断裂，反映在淋巴细胞的氧化DNA损伤增加。此外，ROS可在基因启动子位点附近甲基化CpG岛水平诱导DNA氧化损伤，导致多种突变，包括C→T转换、G→T转换和CG→TT串联突变。此外，ROS可将鸟苷转化为8-氧-鸟苷，将5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba］．这些由于氧化应激而修饰的甲基-CpG序列导致甲基化的CpG岛的功能丧失，作为甲基-CpG结合蛋白(MBP)的识别位点，通常需要召集组蛋白去乙酰化酶进行染色质凝聚和基因沉默[gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba］．因此，氧化应激不仅会导致基因序列改变，而且还会导致表观遗传改变，导致甲基化基因失活失败。gydF4y2Ba

因为FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba自身抗体阻断穿过胎盘甲基四氢叶酸的运输到胎儿和脉络丛屏障到达脑，随之脑甲基四氢叶酸耗竭减少生产足够SAM的作为激活的甲基供体在100甲基化反应在大脑中，包括DNA甲基转移酶，其转移甲基基团，其作为甲基-CpG结合结构域蛋白的识别位点（MBD）和组蛋白基因的CpG启动子位点脱乙酰酶所需的基因沉默。在此背景下，FR的组合gydF4y2BaαgydF4y2Ba在神经元发育和分化过程中，自身免疫和氧化应激独立或协同作用扰乱表观遗传机制，控制特定基因的激活和失活。gydF4y2Ba

实验用老鼠H19-7海马细胞系表明folate-deficient神经元增殖率下降,异常细胞极性和迁移,以及失败的分化过程,如神经突产物,树突和谷氨酸受体的表达,导致突触功能异常和可塑性gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba］．海马神经元培养中叶酸缺乏可导致SAM浓度降低和组蛋白去乙酰化酶过表达(HDAC 4,6,7)。组蛋白去乙酰化酶过表达将导致在特定发育阶段正常激活的多个发育基因的抑制[gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba］．这些海马神经元细胞系中叶酸缺乏的另一个后果是同型半胱氨酸积累，形成同型半胱氨酸酰化蛋白(运动蛋白、动力蛋白和动力蛋白等)，导致关键神经元蛋白聚集和功能障碍，影响正常发育，可能产生长期后果[gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

叶酸缺乏对大脑发育的影响在母亲叶酸缺乏或母亲FR存在的自闭症儿童中可能更为突出gydF4y2BaαgydF4y2Ba怀孕期间自身抗体。我们在这些儿童中发现较高的初始基线CARS评分和较差的预后证实了这一假设。总而言之，孕妇FR的存在将对治疗反应产生负面影响gydF4y2BaαgydF4y2Ba通过晚发型治疗与较高的初始CARS评分和抗体滴度升高相关的自身抗体。父亲的法文gydF4y2BaαgydF4y2Ba抗体也可能影响结果，需要进一步研究，因为我们只确定了一个家族。gydF4y2Ba

5.结论gydF4y2Ba

在低功能自闭症的发病机制中，在产前或产后导致氧化应激和叶酸受体自身抗体获得的喂养障碍似乎通过影响中间代谢和潜在的紊乱表观遗传控制机制发挥了重要作用。早期发现和适当的治疗干预可以逆转核心特征和改善结果。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

前者:gydF4y2Ba	自闭症诊断访谈修订gydF4y2Ba
节选:gydF4y2Ba	自闭症诊断观察量表gydF4y2Ba
-gydF4y2Ba女士:gydF4y2Ba	-gydF4y2Ba蛋氨酸合成酶gydF4y2Ba
BH4:gydF4y2Ba	四氢生物蝶呤gydF4y2Ba
汽车:gydF4y2Ba	儿童自闭症评定量表gydF4y2Ba
CBS：gydF4y2Ba	Cystathionine-beta-synthasegydF4y2Ba
CFD:gydF4y2Ba	脑叶酸缺乏gydF4y2Ba
囊肿：gydF4y2Ba	半胱氨酸gydF4y2Ba
FOLR1:gydF4y2Ba	叶酸受体基因gydF4y2Ba
FRgydF4y2BaαgydF4y2Ba：gydF4y2Ba	叶酸受体αgydF4y2Ba
GTPCH:gydF4y2Ba	GTP-cyclohydrolase我gydF4y2Ba
低密度脂蛋白:gydF4y2Ba	低密度脂蛋白gydF4y2Ba
5-Methyl四氢呋喃:gydF4y2Ba	5-Methyl-tetrahydrofolategydF4y2Ba
MTHFR:gydF4y2Ba	中被还原酶gydF4y2Ba
不：gydF4y2Ba	一氧化氮gydF4y2Ba
NOS1:gydF4y2Ba	NO-synthasegydF4y2Ba
被忽视的热带病:gydF4y2Ba	神经管缺陷gydF4y2Ba
PDD-NOS：gydF4y2Ba	无特别说明的广泛性发育障碍gydF4y2Ba
RFC1:gydF4y2Ba	减少叶酸carrier-1gydF4y2Ba
ROS:gydF4y2Ba	活性氧gydF4y2Ba
山姆：gydF4y2Ba	S-adenosyl-methioninegydF4y2Ba
TH:gydF4y2Ba	酪氨酸羟化酶gydF4y2Ba
TPH2:gydF4y2Ba	神经元色氨酸羟化酶gydF4y2Ba
酪氨酸:gydF4y2Ba	酪粉gydF4y2Ba
MTHFR:gydF4y2Ba	中被还原酶。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。gydF4y2Ba

同意gydF4y2Ba

所有患者和志愿者都收到了关于研究目标的书面信息，并在参与前签署了知情同意书。gydF4y2Ba

信息披露gydF4y2Ba

这些研究的概念和设计是由第一作者(Vincent Th。Ramaekers)，与纽约州立大学医学系免疫学/生物学实验室(Edward V. Quadros, Jeffrey M. Sequeira)合作。在自闭症中心Liège，儿童精神病学家(Paule Philippe, Annick Jadot)、儿童神经学家(Vincent Th。Ramaekers)，心理学家(Marco DiDuca, Aurore Thomas, Céline Philippe, Marie Peters)和神经心理学家(Géraldine Vrancken)。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

其中两位作者Jeffrey M. Sequeira和Edward V. Quadros被列为美国专利号。7846672B2叶酸受体自身抗体测定，美国纽约州立大学研究基金会颁发。对于其他作者来说，没有利益冲突或经济利益需要申报。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

这项工作得到了列日大学自闭症中心的支持，部分还得到了FNRS (Fonds National research sciences # 3;4.540.09)的资助。F(致文森特。拉梅克斯)和自闭症演讲#8202(对爱德华V. Quadros)。研究方案由大学医院Liège伦理委员会和纽约州立大学伦理委员会批准。gydF4y2Ba

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