来那度胺治疗自闭症的初步研究的安全性和观察

摘要

在美国，自闭症影响1:88的儿童。自身免疫性疾病的家族病史，当有一个以上的自闭症后代时母亲血清中的自身抗体，以及自闭症患者脑脊液和脑组织中的神经胶质反应提示免疫变量可能与这种情况有关。来那度胺有可能引起TNF-的变化α毒性比沙利度胺小。这项初步研究评估来那度胺降低TNF-的作用α以及TNF升高的孤独症儿童行为和语言的改善-α．TNF-升高的受试者α每天服用2.5毫克来那度胺，持续12周。进行药效学和安全性评价。在6周和12周后，研究人员测量了语言和自闭症行为的变化。虽然大多数措施没有达到统计学意义，但有改善的趋势。6周后，平均接受语言能力增加:60.67±12.06 - 65.00±15.10 (P= 0.11)，自闭症症状减少(40.75±5.96 vs 38.67±7.90，P= 0.068)。12周后,CSF-TNF -α下降57%±25%，由80.5±41.03降至38.0±31.27 (P= 0.068)。血清肿瘤坏死因子-α下降57%(92.50±68.92至40.25±44.53)P= 0.048)。这项研究表明来那度胺作为一种治疗自闭症儿童的药物是可以耐受的，并且作为一种潜在的细胞因子炎症的药物应该被进一步研究。

1.介绍

在美国和世界上大多数国家，自闭症是导致发育障碍的主要原因。截至2010年，美国每88个新生儿中就有1人患有这种疾病。1］.自闭症最好被定义为一系列异质性发育障碍，主要涉及三个核心方面的行为:(1)语言和沟通;(2)社会利益与互动;(3)刻板的行为或癖好[2].从历史上看，孤独症的发病率一直在上升；然而，这是否反映了简单的人口增长、重新分类和认识的提高，或者受影响人口的百分比是否真的增加，存在争议[3.］.尽管存在争议，但大多数专家和普通民众都认为，自闭症的发病率已经大幅上升，特别是在像加州这样的州，该州的教育记录显示，在过去20年里，自闭症儿童的发病率大幅上升了600% [4- - - - - -6］.

目前还没有一致同意的单一基因或其他病因风险因素已经被证明是导致自闭症的孤立因素。目前认为，可能需要发生多种风险因素，如家庭因素、环境因素(如极端早产或感染)和免疫触发因素。

自闭症患者可能有功能失调的免疫系统，特别是神经系统。有证据表明，血清炎症标志物包括细胞因子、自身抗体升高、用于免疫防御的正常免疫球蛋白水平降低、脑脊液(CSF)或脑组织中的神经胶质和细胞因子活化[7，8］.正如Vargas等人和其他人所描述的那样，先天神经胶质免疫失调已经表现为额扣带皮层和脑脊液中白介素-6和其他促炎标志物的升高[9- - - - - -11］.只有一项关于自闭症患者脑脊液和血清中细胞因子水平的研究已经完成，该研究描述了TNF-的升高α脑脊液水平与血清水平的比率[7］.

来那度胺是沙利度胺的类似物，有可能引起TNF更显著的变化-α和其他比沙利度胺毒性小的免疫调节细胞因子。来那度胺可能是临床上可行的口服药物在自闭症亚型的早期过程中，可能是首选的注射剂。来那度胺对肿瘤坏死因子- α (TNF-)升高的患者的病程可能有帮助α)，以及其他细胞因子水平升高的患者，如白细胞介素1 (IL-1)、白细胞介素6 (IL-6)或甲基cpg结合蛋白1 (MeCP-1)。

本2期试点研究的目的是确定来那度胺在TNF-升高的自闭症儿童中的安全性和药效学α的水平。我们还研究了来那度胺降低TNF-的潜力α并改善行为和语言功能。

2.方法

2．1．主题

受试者包括7名6至12岁的男性，他们被诊断为DSM-IV-TR定义的孤独症，父母报告他们的语言和社交能力有退化史。这些患者的一级亲属或母亲在怀孕期间或之后有自身免疫功能障碍史。由于有退化史，在本研究之前对所有患者进行了全面评估，以评估他们的孤独症并排除退行性疾病。该评估包括神经成像、24小时脑电图、基因测试、代谢测试以及血清和脑脊液取样以获得细胞因子组。脑脊液肿瘤坏死因子升高的患者-α(>50 pg/mL)。由于与女性相比，男性被诊断为自闭症的比例更高，而且来那度胺的潜在致畸作用，因此本研究只选择男性。患有以下疾病的患者被排除在研究之外:DSM-IV-TR的PPD-NOS和亚斯伯格症、遗传疾病、活动性自身免疫疾病，如克罗恩病或桥本甲状腺炎，或任何血液学、肝脏或肾脏疾病，如果他们参与研究，将使受试者处于不可接受的风险。

参与是自愿的，没有任何补偿。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration)批准了本研究的研究新药申请(IND102897)。在基线来访时，研究协调员获得了至少一位受试者父母的书面知情同意。该研究得到了萨特健康中心机构审查委员会的批准。患者药效学数据由Celgene实验室收集和分析。细胞因子测量由加州英格伍德的InterScience实验室(经CLIA批准)进行分析，使用他们的血清和CSF的商业协议，这些血清和CSF被冷冻并运送给他们。

2．2．药物和剂量

来那度胺2.5 mgs每天给药12周。选择此低剂量是为了将不良反应风险降至最低。此外，由于这是一项试点研究，目标是测试可能导致改善的最低剂量。

2．3.测量

基线行为和神经心理学评估包括接受和表达单字图片词汇测试、自闭症诊断观察量表(ADOS)、儿童自闭症评分量表(CARS)以及临床整体印象改善量表(CGI-I)。行为和神经心理学评估在基线来访时进行测量，并在基线6周和12周后再次进行测量。

2.3.1。接受表达单字图片词汇测试

接受性单字图片词汇测验[12是一种独立管理的标准参考测试，对个人的英语听力词汇进行评估。对于每一个项目，考生会看到考官说的一个词，以及四个插图。考生选择描述单词含义的插图。如果考生在8个连续的项目中有6个不能正确地辨认出图片中单词的意思，那么考试将停止。

单字图片词汇测验[13向考生展示一系列插图，并要求他们在展示时说出每个插图的名字。当考生不能正确说出连续的六个项目时，考试将停止。

表达性和接受性单字测试都是标准化的，适用于2到18岁的个体。

2.3.2。自闭症诊断观察表(ADOS)

自闭症诊断观察表(ADOS) [14是一种半结构化的、标准化的评估，针对的是可能患有自闭症或其他广泛性发育障碍的个体，对沟通、社会互动、游戏或对材料的想象力使用进行评估。ADOS由标准活动组成，允许检查者观察对不同发育水平和实际年龄的自闭症谱系障碍诊断具有重要意义的行为。ADOS由四个模块组成，每个模块都有自己的协议，专为特定发展和语言水平的儿童或成人设计，从没有表达语言到成年人口头流利。考官根据孩子的语言表达能力和实际年龄选择最适合他/她的模块。总体评分在管理后立即完成。通过使用为每个模块提供的诊断算法，可以使用这些评级来制定诊断。

2.3.3。儿童自闭症评定量表

儿童自闭症评定量表(CARS) [15]用于评估孤独症症状的变化。此15项行为评定量表有助于识别患有孤独症的儿童，并将其与其他诊断区分开来。每个项目包括特定的特征、能力或行为。在观察儿童并检查家长报告和其他记录中的相关信息后，考官对每个项目的孩子进行评分。他或她使用7分制来表示孩子的行为偏离同龄正常孩子行为的程度。当孩子在15个项目中的每一个项目上进行评分后，通过个人评分的总和来计算总分。得分高于给定分的孩子将被归类被称为自闭症。此外，自闭症范围内的分数可分为两类：轻度至中度自闭症和重度自闭症。该评分量表的分数降低反映症状改善。

2.3.4。临床全球Impression-Improvement

研究人员使用临床整体印象评分(CGI-I)在基线、6周和12周对每个儿童进行评估。CGI的设计是为了反映在多次检查中核心自闭症症状和行为的变化[16］.该量表得分的下降反映了症状的改善。

2.3.5。肿瘤坏死因子-α化验

CSF和血清TNF-α在基线检查前21个月进行检测。血清TNF-α在12周的访问中再次获得。脑脊液TNF -α对父母选择腰椎穿刺的孩子也进行了测量。腰椎穿刺是在患者入住萨特纪念医院(萨克拉门托，CA)的儿科门诊治疗室后进行的，家长或监护人签署了一份附加同意书，允许进行该操作。麻醉师用异丙酚对患儿进行监测和镇静，以便安全无痛地获取脑脊液中细胞因子的值。对穿刺部位进行表面麻醉，用浸有防腐剂溶液的纱布垫清洗穿刺部位。麻醉生效后，患者进行手术，取出5-10 mL脑脊液进行如上分析，并由主治麻醉师监测患儿直至安全出院。同时获得脑脊液细胞计数、蛋白和葡萄糖，因此不存在其他炎症过程。在基线前12个月以上获得脑脊液的患者()可以选择重复脑脊液水平。对两名患者重复脑脊液水平。所有完成治疗试验的患者脑脊液和血清TNF-水平α按协议重复(）.

２.４.标本采集及制备

脑脊液和血清样本在收集后被冷冻，并由CA Inglewood的ISI (CLIA认证05D0549406)使用固相ELISA技术与TNF-特异性单克隆抗体进行分析α(研发系统/ Quantikine)。实验中包括三个高、中、低浓度的内部对照品。作为标准的前分析程序的一部分，任何CSF样品被观察到含有沉淀物，在1300克离心5分钟，以去除任何颗粒物质。本试验按照标准方案进行。除2例只有较低稀释值的患者外，5例患者在基线时将标本稀释为1:1和1:10,4例患者在12周时将标本稀释为1:10，以建立TNF-的比较值α．连续稀释线性度以前被验证过达到1:32。一个标准点被额外稀释，以扩大较低的报告范围。分析患者脑脊液和血清，计算其比值。

2．5．ISI TNF-的分析灵敏度和重现性α化验

ISI试验的灵敏度超过10个重复。平均灵敏度为0.298 pg/mL，检出限为0.3133 pg/mL。使用高、中、低对照材料建立测定间和测定内差异。在连续20次检测中，对照材料的检测间变异目标值分别为21.7、323.5和628.2 pg/mL，变异系数(CV)分别为9.2、3.5和1.7%。分析内变异的目标值分别为21.8、333.3和621.0 pg/mL, CV分别为9.8、2.7和1.5%。本方法线性良好值为0.9999，并带有r为0.9999，斜率为0.9903;恢复值与观测值相似r-值，斜率为0.9992，平均回收率为102%。

2.6。药代动力学试验

在基线访问时，患者在门诊儿科中心接受检查，并接受简短的体检。受试者的父母可以选择用生理盐水锁抽血或用四针静脉穿刺抽取药动学样本。样本分别在第一次给药后1、2、4和8小时采集。用6ml K2-EDTA管采集血样。样品立即浸入冰中。采集时间15分钟内，取标本至实验室，置于1500g冷藏离心机中，4℃保存10分钟。血浆加入2个预先标记的冷冻瓶中。在采集血液的30分钟内，将冷冻瓶置于−20°C冰箱中。这些样品被冷冻后分批送去分析。采用经验证的HPLC-MS/MS方法测定人血浆样品中的来那度胺浓度。 Lenalidomide was analyzed after the liquid-liquid extraction (with methyl叔-丁基醚(MtBE):乙酸乙酯，50:50,v/v)取自0.2 mL人血浆样品。来那度胺和稳定同位素标记内标的参比标准品[¹³C₅-CC-5013由Celgene Corporation (Summit, NJ)合成。采用高效液相色谱法测定了Synergy极性rp 4-μm柱(Phenomenex, Torrance, CA, USA)。使用三重四极杆质谱仪(API 4000，应用生物系统，福斯特市，CA，美国)进行质谱分析和检测。采用多反应监测(米/z来那度胺(260.3/149.2)和IS(265.1/149.2)在正离子模式下进行电喷雾电离。来那度胺标准曲线呈线性()从1至200 ng/mL血浆。血浆定量下限为5 ng/mL。使用4个浓度(1、3、60和180 ng/m)的验证质量控制样品来确定测定的准确性和精密度。日间测定精度范围从−1.3到6.5%偏离标称浓度。方法验证的日间精度不超过8.0% CV。所有样品采用QPS (Newark, DE, USA)进行分析。

2.7。治疗

来那度胺2.5毫克，连续12周。受试者在服用第一剂后进行每周的研究访问。一位家长被告知如何给药来那度胺，包括药物处理的预防措施。随后的剂量由受试者的父母每天给药。在访问之初，进行了实验室检测并进行了处理。调查人员进行了简短的体检并记录了CGI-I。在完成身体检查并收到评估可能与药物毒性有关的情况的实验室结果后，将在下周发放药物。

2.8。统计分析

数据以图形方式显示，并使用描述性统计来评估测量值的分布。采用Wilcoxon秩和检验分析基线、6周和12周随访测量值的差异。曲线下面积(AUC)，最大观测浓度()和采样时间(小时)发生()用于评价药动学试验结果。

3.结果

7名年龄在6-12岁的白人男性被纳入研究1）.所有儿童都有父母病史，报告在12至18个月间出现衰退，4/7的患者失去了眼神交流、语言能力和非语言手势。在研究过程中，没有儿童出现倒退。基线脑脊液TNF -α对7名儿童中的1名进行1:1稀释处理，其余儿童根据实验室建议使用1:10稀释处理(InterScience实验室)。三个孩子最初观察到的是死记硬背和简单的1-2个单词的短语式语言，主要是有提示的，而四个孩子是非语言的。这些功能较差的孩子最有可能是语言变化结果更难观察的原因。预研究血清和脑脊液TNF-α值了基线前几个月重复血清水平。在研究开始前20.7个月获得了一名儿童的初始样本，但在基线随访后9个月获得了重复结果。血清肿瘤坏死因子-α2例患儿用1:1稀释，5例患儿用1:10稀释。所有患者在基线时检测血清细胞因子水平，1例患者重复脑脊液样本。

获得7名受试者的药代动力学(PK)数据(见表)2和图1）.7名儿童中有6名在第一次注射后1小时血清浓度在20至60 pg/mL之间。第一次给药8小时后，所有患儿血清浓度均小于20 pg/mL。受试者5的PK值在1小时时显著高于其他所有受试者，但在2小时时趋于正常。表格2提供每个患者的参数估计。2名受试者的注意力在第二个小时达到峰值，其余5名受试者在第一个小时达到峰值。

两名患者出现皮疹，并停止了研究。一名患者在8周后因中性粒细胞绝对计数短暂下降1200(安全临界值1500)而停止研究。停止来那度胺后所有皮疹均消失，患者停药后ANC恢复正常水平。

3．1.肿瘤坏死因子-α

12周随访时，1:10稀释血清TNF-α在有1个孩子的三个孩子身上获得 : 基线检查时10份稀释血清。使用1份 : 1基线稀释时，使用1 : 1在12周的随访中，1名儿童的血清使用1 : 1稀释至基线，并使用1 : 10随访时稀释；因此，该病例被排除在分析之外（跨科学实验室的方案变更）。CSF TNF-α对完成研究的4名受试者进行了一致的测量(见表)1）.CSF-TNF -α平均下降了从来在4名儿童中，他们的样本得到了一致的测量，并在12周时完成了研究().血清肿瘤坏死因子-α下降了57%(来；）.只有TNF -α作为一种探索性的结果测量，因为其他细胞因子并不总是在所有患者中可用。研究者也观察并报告了自闭症患者脑脊液/血清比率升高[7］.

3．2.语言和行为测量

在6周的随访中，6名初始短语语言患者中有3人的平均接受语言能力从来（)(表3.）.6名完成6周随访的儿童显示，根据CARS评分，自闭症症状减轻，变化显著(基线为40.75±5.96 vs . 6周)，）.

研究者的临床整体印象评分显示，在社会化、语言表达和接受性言语方面有一些改善(见表)4).平均基线CGI表达语言为并在6周时有统计学上的改善(，)及12周时(，）.接受性语言的CGI评估在基线()及6周(，)，但在第12周时，改善在统计上并不显著(，).而社交技能得分在第6周和第6周都有所提高()及12周()，与基线相比差异不显著(）．

4.讨论

这是一项初步研究，以确定来那度胺在少数患者中的安全性和潜在疗效，并没有足够的力量来获得统计上显著的发现。事实上，大多数有回归史的患者在基线时几乎没有表达能力，这在临床上看到的一些回归亚型中并不罕见，但它限制了本研究衡量任何显著变化的能力。本研究提示口服TNF-α来那度胺抑制剂是一种潜在的新机制，用于治疗在TNF-升高的孤独症消退αCSF和血清中的标记物。明确临床降低TNF-α在4名完成12周研究的患者中观察到血清和脑脊液的变化。这些发现建立在先前炎症细胞因子升高和细胞因子治疗后大鼠后代行为改变的动物模型之上[17，18]根据这些初步研究结果，似乎在人类患者中有潜在的应用。除了完成研究的受试者人数外，本研究的一个局限性包括在准确基线和随访时获取脑脊液数据的逻辑局限性，这导致了这些测量之间时间线的可变性。因此，我们不能得出结论，所有观察到的脑脊液水平变化都是由于单独治疗所致。

在试验过程中，成功获得了药代动力学数据，并成功监测了安全性。仅在一位患者的药代动力学数据中发现了变异性。2例患者出现皮疹后恢复。在来那度胺的临床实践中，皮疹是治疗效果的一个潜在反映，许多人将通过皮疹继续治疗，但该方案规定，如果出现皮疹，应停止治疗。轻度绝对中性粒细胞计数(ANC)下降到<1500是FDA对该方案安全要求的临界值。除此单一ANC事件外，未发生肝脏、肾脏、血液学或血栓性改变。

结果显示语言有进步的趋势。父母和研究者观察了7名初始短语语言患者中的3名，发现他们的接受语言和CGI都有改善，反映了社交和接受语言的显著变化。这些观察结果通过单字接受性语言测试分数的提高得到了验证，这表明6周治疗后的临床意义变化是可测量的，但没有统计学意义。随访12周后，没有足够的病例数来计算表达语言和接受语言得分的统计数据。CARS改善平均超过2点，并在6周后显示显著性。这些探索性结果表明治疗有一定的关系，但在开放标签研究中，小样本量限制了治疗影响的结论。

除了样本量小外，本研究还存在一些局限性，其中之一就是与TNF-的实验室处理不一致α，以及脑脊液样本之间的时间不一致。对于自闭症儿童的标准实验室测试分析还没有达成共识。肿瘤坏死因子-α其他细胞因子的测量很少，所以这些实验室的处理没有标准化。目前缺乏商业标准的TNF值和测试方案，这在一定程度上限制了确切的相关性;然而，所有患者的脑脊液和血清TNF样本在基线和12周时处理方式相同，因此我们认为这些值在本研究中分析是有效的，特别是血清水平，它反映了真实的基线与治疗结束时的变化。此外，血清水平值可能与行为和语言评分相关。一致的检测标准是必要的，在治疗方案中评估真正有意义的自闭症细胞因子数据之前，样本的时间是必要的。

患者反复暴露于测试和发育成熟是研究结果的潜在限制。此外，一些患者在实验室工作、与医生的医疗预约和额外的等待时间之后完成了神经心理测试，这导致了可能影响测试结果的行为不合规。无患者发生严重不良反应，3例退出研究的患者均从ANC水平和皮疹中完全恢复。

尽管有局限性，但据我们所知，这项开放标签研究首次尝试通过特异性地针对先天性炎症细胞因子水平的升高来治疗自闭症。该初步研究成功完成了安全性监测和药代动力学数据，临床和细胞因子变化的探索性观察表明有改善的趋势。相关治疗结果与细胞因子水平的变化可能是未来自闭症治疗的目标，特别是那些已知的母亲或出生后免疫危险因素。更大的盲法和安慰剂对照研究评估TNF-自闭症患者的细胞因子测量和细胞因子靶向治疗α或其他炎症细胞因子升高。

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