新生儿七氟醚暴露后，糖胺致小鼠神经元凋亡增强

摘要

在啮齿动物中，新生儿七氟醚暴露诱导新生儿大脑凋亡并导致学习缺陷。Sugammadex是一种新的选择性神经肌肉阻滞(NMB)粘合剂，麻醉师可以使用它来实现NMB的立即逆转，而且副作用很少。鉴于其分子量为2178,sugammadex被认为无法通过血脑屏障(BBB)。挥发性麻醉剂可影响血脑屏障的开放和完整性。因此，我们研究了腹腔注射sugammadex是否会通过改变血脑屏障完整性而加剧新生儿2%七氟醚暴露后的神经元损伤。用Cleaved caspase-3免疫印迹法检测细胞凋亡，透射电镜观察血脑屏障的超微结构。暴露于2%七氟醚6 h可导致新生小鼠海马血脑屏障超微结构异常。Sugammadex单独不含七氟醚不能诱导细胞凋亡。与仅为2%的七氟醚相比，sugammadex与七氟醚联合给药对新生小鼠的脑内神经细胞凋亡显著增加(150%)。在新生儿麻醉中，舒美达与七氟醚联用可影响神经毒性。 Exposure to 2% sevoflurane for 6 h resulted in BBB ultrastructural abnormalities in the hippocampus of neonatal mice.

1.介绍

Sugammadex是一种新型选择性神经肌肉阻滞(NMB)粘合剂[1，2］．它仅用于逆转氨基类固醇肌肉松弛剂[2］．它是由8个甜甜圈形状的糖分子组成，它的配方是将NMB以不可逆的形式封装在其空腔中[3.］．麻醉学家使用Sugammadex来实现NMB的立即逆转，并且几乎没有副作用。最近，sugammadex被证明在原代培养中诱导神经元凋亡[4］．

由于它的电荷和高分子量(2178)，人们认为sugammadex不能通过血脑屏障(BBB)和胎盘[5］．然而，在不同的临床条件下，如脑损伤，它可能更容易穿过血脑屏障[6]和败血症[7，8和未成熟的中枢神经系统[9］．

挥发性麻醉药可影响老年大鼠血脑屏障开放和完整性[10，11]和脑损伤[12］．临床浓度的挥发性麻醉药诱导新生儿和老年啮齿动物神经元凋亡和认知障碍[13- - - - - -19］．我们之前研究了新生儿七氟醚暴露小鼠的神经元凋亡和认知功能障碍[14，19］．神经元损伤是由于未成熟的中枢神经系统[20.］．

发育中的大脑很容易受到七氟醚的影响[14，15，19］．我们推测，sugammadex与新生儿七氟醚共同给药可能会由于血脑屏障完整性的改变而加剧神经元凋亡。因此，在本研究中，我们研究了新生儿七氟醚暴露是否改变了血脑屏障的完整性，以及腹腔注射sugammadex是否增强了新生儿2%七氟醚暴露相关的神经元损伤。

2.材料和方法

东京医科和牙科大学动物护理和使用委员会批准了目前的研究方案(0160072A)。

2．1．动物

出生后5日龄C57BL/6小鼠(雌雄，平均体重2.7 g)随母鼠(日本静冈市SLC日本)一窝购买。小鼠饲养于光照周期为12 h的黑暗环境中(光照时间为08:00 - 20:00)，室温维持在°C。实验使用相同数量的每窝幼仔，以减少与使用不同窝仔有关的变异性(使用的幼仔总数为48只，雌雄数量相同)。所有的老鼠随意获得水和食物。

同一窝的幼崽被随机分为四组:(1)非麻醉组(NA组，对照组小鼠)，(2)sugammadex治疗组(sugammadex组，腹腔注射sugammadex小鼠)，(3)2%七氟醚暴露组(SEVO组，2%七氟醚持续6h)， (4) sugammadex联合七氟醚(sugammadex + SEVO组，小鼠腹腔注射2%七氟醚6小时和舒格美dex)。

2．2．麻醉治疗

如前所述进行七氟醚麻醉[19］．简单地说，出生后第6天的小鼠在离开母鼠笼后立即被放置在一个潮湿的房间。七氟醚(2%)以40%氧气作为载氧气体给予6 h。对照组小鼠暴露在40%的氧气中。总气体流量为1 L/min。

2.3。Sugammadex治疗

将Sugammadex溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，腹腔注射30 mg/kg剂量。注射量为10μL.对照组给予相同体积的PBS。诱导前30分钟腹腔注射Sugammadex, 2%七氟醚麻醉。

２.４.免疫印迹分析

前脑蛋白裂解液的Western blot分析如前所述[19］．七氟醚麻醉6小时后迅速切除前脑。主要抗体包括anti-cleaved caspase-3 (#9661, rabbit polyclonal, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)、anti-cleaved poly[adenosine diphosphate-ribose] polymerase (PARP) (#9544, rabbit polyclonal, Cell Signaling Technology)和anti-cleaved caspase-3 (#9661, rabbit polyclonal, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)β-actin (AC-15，小鼠单克隆，Sigma，圣路易斯，美国MO)。二抗包括辣根过氧化物酶(HRP)连锁抗兔IgG (ab98493，驴多克隆，Abcam，剑桥，MA，美国)和HRP连锁抗小鼠IgG (NA9310，绵羊，GE Healthcare, Little Chalfont，英国)。一只老鼠β-actin抗体作为负载对照。使用化学发光检测系统(SuperSignal West Pico;皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州，美国)。

2．5．免疫组织化学

免疫组化如前所述[19］．七氟醚麻醉6 h后灌注组织。简而言之，振动切片(50μ用含0.3% Triton X-100的PBS洗涤，1% H阻断内源性过氧化物酶活性₂O₂涂抹30分钟。接下来，切片在4℃下与抗cleaved caspase-3 (#9661, rabbit polyclonal, Cell Signaling Technology)在TBS/Tween 20中稀释1%阻断试剂(Roche, Basel, Switzerland)过夜。二抗包括酶联抗兔IgG (ab98493，驴多克隆，Abcam)。

用DAB-镍基(0.05% DAB, 0.05% NiSO)观察Cleaved caspase-3信号₄, 0.015% H₂O₂， 0.05% 1 M Tris-HCl, pH 6.7)。切片置于载玻片上，用苏木精进行反染色。

2．6．血脑屏障完整性评估

七氟醚麻醉6小时后，用新鲜制备的多聚甲醛(4%)和戊二醛(2.5%)灌注组织。大脑被切除，海马CA1区域被切割，并在4°C下保存在同一固定物中过夜。通过分级甲醇系列脱水后，将大脑区域嵌入Epon 812，在60°C下聚合过夜。用切片机切割超薄切片(90 nm)，按照标准程序用醋酸铀酰和柠檬酸铅双染色[21，透射电镜检查(H-7100;日立、茨城县、日本)。

2.7。统计分析

数据用平均值±SEM表示。Western blot检测的蛋白表达水平以对照组(NA组)的百分比表示。采用SPSS统计软件包进行统计学分析。24.0, IBM, Armonk, NY, USA)。单因素方差分析(ANOVA)，然后是事后比较采用Newman-Keuls多重比较检验。值< 0.05认为有统计学意义。

3.结果

3．1.血脑屏障的超微结构

对照组毛细血管超微结构连续完整(图)1(一))，内皮间隙和血管周间隙正常。相比之下，七氟醚暴露6h后，血脑屏障的超微结构完整性似乎被破坏，血管周围间隙扩大(图)1 (b))．综上所述，2%七氟醚暴露6 h可导致P6小鼠血脑屏障超微结构的破坏。

3．2．细胞凋亡

新生儿七氟醚暴露6h可增加cleaved caspase-3的浓度(图)2(一个)和3.)和另一种凋亡标志物，裂解的PARP(图2 (b))，而P6小鼠则在暴露后立即与对照组进行了对比。Sugammadex单独不能引起神经元凋亡。有趣的是，腹腔注射sugammadex可显著增强新生儿2%七氟醚暴露相关的神经元凋亡(图)2和3.)．凋亡的增加是强劲的，联合使用sugammadex和2%七氟醚的凋亡反应遵循其他麻醉药物和乙醇报道的模式[13- - - - - -15，22］．

4.讨论

暴露于2%七氟醚6 h可导致新生小鼠海马血脑屏障超微结构异常。此外，本研究表明，与单独给予2%的七氟醚相比，sugammadex和七氟醚共同给药对新生小鼠的大脑神经细胞凋亡有显著增加。

在这个体内模型中，如果没有新生儿七氟醚暴露，Sugammadex本身没有麻醉作用，也不会引起神经元凋亡。挥发性麻醉药可影响老年大鼠血脑屏障开放和完整性[10，11］．在本研究中，我们证实了七氟烷暴露对新生小鼠血脑屏障超微结构的破坏。本研究表明，sugammadex通过新生儿七氟醚暴露破坏的血脑屏障，并且在原代培养中可见sugammadex诱导神经元凋亡[4］．

通过腹腔注射获得的sugammadex浓度略高于临床使用的人类患者(从2到16 mg/kg，人类静脉注射)。在本研究中，我们选择30 mg/kg，因为未经稀释的sugammadex可以用于大多数幼犬。Sugammadex不被代谢，只通过尿液排出。七氟醚麻醉是手术中诱导和维持全身麻醉最常用的挥发性麻醉剂之一。在手术过程中，包括儿科手术，麻醉师使用sugammadex来逆转NMB。因此，sugammadex和七氟醚在手术中同时存在。然而，由于sugammadex与甾体NMB药物形成1:1复合物，大多数sugammadex在细胞外液中保持游离。Sugammadex和七氟醚可能对大脑产生不良影响。

我们之前研究了新生儿七氟醚神经毒性[14，19发现3%七氟醚暴露6小时不会引起缺氧或低通气[14，15］．吸入性麻醉剂有剂量依赖性的呼吸和循环抑制作用。因此，2%的七氟烷浓度对人类儿童和小鼠幼鼠都是安全的。

但sugammadex引起神经元凋亡的机制尚需进一步研究。Palanca等[4研究发现，舒美达改变了胆固醇稳态。长期记忆损害必须在未来的研究中进行检查，因为我们之前发现麻醉后不久高水平的细胞凋亡会导致成人长期记忆损害[14，19］．此外，有必要调查哪些sugammadex的浓度和吸入七氟醚的时间对发育中的大脑有最有害的影响。此外，有必要研究防止神经元凋亡的措施。

5.结论

本研究结果表明，sugammadex与新生儿七氟醚共同使用可增强神经元凋亡。暴露于2%七氟醚6 h可导致新生小鼠海马血脑屏障超微结构异常。

相互竞争的利益

两位作者宣称没有相互竞争的利益。

作者的贡献

Maiko Satomoto构思并设计了实验;佐本舞子和孙忠良进行了实验;Satomoto Maiko和孙忠良分析了数据;Yushi U. Adachi进行了统计分析;佐本舞子写了手稿;所有的作者都对数据的解释和手稿的编辑做出了贡献。佐本舞子和孙忠良对这部作品贡献相当。

致谢

作者感谢Yuriko Sakamaki、Ayako Mimata和Shizuko Ichinose(东京医科和牙科大学医学和牙科科学研究中心，东京，日本)的标本准备和透射电子显微镜技术援助，Ayumi Sakata(东京医科和牙科大学多样性钻石单位，东京，东京，日本)，Yukitoshi Izumi(华盛顿大学医学院精神病学系，MO, USA)对该研究进行了讨论。这项工作得到了2016年东京医学和牙科大学女性研究人员项目的支持，由日本MEXT的“实现研究环境多样性倡议”和日本科学促进协会(日本东京)资助;赠款。16 k10928。

参考文献

1. W. T. Nicholson, J. Sprung，和C. J. Jankowski，《Sugammadex:逆转神经肌肉阻滞的新药物》，药物治疗第27卷第2期8，页1181 - 1188,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. M. Naguib，“Sugammadex:临床神经肌肉药理学的另一个里程碑”，麻醉与镇痛，第104卷，第104号3，页575-581,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. D. Chambers, M. Paulden, F. Paton等，“Sugammadex用于快速顺序插管后神经肌肉阻滞的逆转:系统回顾和经济评估，”英国麻醉杂志第105卷第1期5，页568-575,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. J. M. Palanca, D. Aguirre-Rueda, M. V. Granell等人，“Sugammadex是一种神经肌肉阻断逆转剂，可导致原代培养中的神经细胞凋亡。”国际医学科学杂志，第10卷，第5期。10, pp. 1278-1285, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. j·t·法勒FDA麻醉和生命支持药物咨询委员会会议， Sugammadex, Silver Spring, Md, USA, 2008。
6. B. Obermeier, R. Daneman和R. M. Ransohoff，《血脑屏障的发展、维护和破坏》，自然医学第19卷第2期12, pp. 1584-1596, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 邓艳艳，方敏，朱国发，周勇，曾宏坤，“小胶质细胞在败血症相关脑病发病中的作用”，中枢神经系统和神经系统疾病-药物靶点，第12卷，第2期6，第720-725页，2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. F. Esen, T. Erdem, D. Aktan等，“腹腔内脓毒症大鼠模型中硫酸镁对血脑屏障的影响:一项随机对照实验研究，”急救护理，第9卷，第5期。第1页，R18-R23, 2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. N. R.桑德斯，G. W.诺特和K. M. Dziegielewska，《不成熟大脑中的障碍》，细胞与分子神经生物学，第20卷，第2期。1，页29-40,2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 胡娜，郭德华，王慧等，“血脑屏障开放对老年大鼠骨科手术和高浓度吸入七氟醚后认知功能下降的影响”，大脑研究， vol. 1551, pp. 13-24, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. “异氟醚麻醉可导致老年大鼠海马血脑屏障超微结构和occludin紧密连接蛋白表达的可逆变化”，神经学字母， vol. 587, pp. 51-56, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. S. C. Thal, C. Luh, E.-V。Schaible等人，“挥发性麻醉剂通过调节创伤性脑损伤中紧密连接蛋白的表达影响血脑屏障的完整性。”《公共科学图书馆•综合》，第7卷，第e50752条，2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. V. Jevtovic-Todorovic, R. E. Hartman, Y. Izumi et al，“早期接触普通麻醉药会导致发育中的大鼠脑广泛的神经退化和持续的学习障碍，”神经科学杂志，第23卷，第2期。3，页876-882,2003。视图:谷歌学术搜索
14. M. Satomoto, Y. Satoh, K. Terui等人，“新生儿接触七氟醚可导致小鼠的异常社会行为和恐惧条件反射缺陷，”麻醉学号，第110卷。3，第628-637页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. M. Kodama, Y. Satoh, Y. Otsubo等，“与异氟醚和七氟醚相比，新生儿地氟醚暴露诱发更强烈的神经细胞凋亡，并损害工作记忆，”麻醉学第115卷第1期5, pp. 979-991, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. W.-X。熊,G.-X。Zhou, B. Wang等，“七氟醚-一氧化二氮麻醉对老年大鼠空间学习和记忆的影响与cAMP/CREB信号通路下调有关，”《公共科学图书馆•综合》，第8卷，第2期11、Article ID e79408, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. X.-M。李凡苏，m . h。Ji等人，“海马神经调节蛋白1-ErbB4信号通路的中断有助于异氟醚诱导的老年小鼠海马依赖性认知损伤，”麻醉学号，第121卷。1, pp. 79-88, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. Luo X.， Yang L.， Chen X.， and S. Li，“Tau的过度磷酸化:异氟醚诱导的神经炎症的下游效应，”医学假说，第82卷，第2期1, pp. 94-96, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. Z. Sun, M. Satomoto, Y. U. Adachi, H. Kinoshita, K. Makita，和H. F. Galley，“抑制NADPH氧化酶可以防止小鼠新生儿七氟烷暴露引起的长期记忆损伤，”英国麻醉杂志，第117卷，第117号1, pp. 80-86, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. D. A. Edwards, H. P. Shah, W. Cao, N. Gravenstein, C. N. Seubert, A. E. Martynyuk，“Bumetanide减轻七氟醚对新生大鼠脑的致癫痫和神经毒性作用，”麻醉学，第112卷，第112期。3，页567-575,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. S. Ichinose, T. Muneta, H. Koga等，“骨髓-滑膜-间充质干细胞和软骨细胞体外软骨形成过程中的形态差异，”实验室调查，第90卷，第5期。2，页210-221,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. D. F.沃兹尼亚克，R. E.哈特曼，M. P. Boyle等人，“乙醇诱导的新生小鼠凋亡神经变性与青少年严重的学习/记忆缺陷及成人渐进性功能恢复有关，”疾病的神经生物学，第十七卷，第二期3，页403 - 414,2004。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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