高通量测序分析表明，老化油泥对土壤理化性质和真菌多样性的影响

摘要

油田土壤多年来受到石油工业产生的大量老油泥的污染。本研究对油泥污染土壤的理化性质、主要污染物含量及真菌多样性进行了分析。结果表明，老化油泥显著改变了接收土壤的理化性质，增加了土壤中主要污染物(石油烃和重金属)的含量。同时，利用Illumina Miseq平台在各分类水平上的ITS测序结果表明，石油污染物的毒理学效应明显影响了土壤真菌多样性和群落结构。此外，发现有三属(Cephalotheca，Lecanicillium,Septoriella)出现在老化的油泥污染土壤中。而石油污染物促进了某些属的生长子囊菌类(70.83%)和担子(10.78%)等黑星病菌，链格孢属,Piloderma．然而，增长的Mortierella(9.16%),Emericella(6.02%)和Bjerkandera(0.00%)被集中限制。本研究将有助于深入了解石油污染土壤中微生物的多样性，从而为土壤生物修复提供新的视角。

1.介绍

油泥是我国石油工业产生的最重要的危险固体废弃物之一[1］．它主要产生于原油的钻探、开采、运输、提炼和储存过程。大量油泥由许多有害化学物质组成，如石油碳氢化合物(PHCs)和重金属(HMs)，这些物质对人类有潜在的毒性，已被排放到当地环境中[2- - - - - -5］．在接收土壤上，油泥中的有毒成分可能导致营养缺乏或限制种子和植物的生长[6］．油泥露天堆放，挥发性组分(主要是部分轻油组分)和含水率不断下降，产生大量的陈化油泥(AOS) [7］．随着时间的推移，AOS中的有害化学物质不断排放到当地环境中，对接收土壤造成了慢性污染影响。与油泥相比，AOS具有重油含量高、污染周期长、综合利用率低的特点[7］．

在以往的研究中，对堆存的油泥进行适当的处置和充分的处理是非常重要的[7，8］．在产油区，特别是油井周围，泄漏的油泥多年甚至几十年被忽视，在土壤上形成了大量的aos污染点。到目前为止，作为AOS中最有害的组件[9]，长期石油污染土壤中石油烃总量和HMs含量以及真菌多样性的研究在全球范围内仍属未知，很少有文献报道。

近几十年来，在各种生物技术中，具有更好检测稀有物种能力的高通量测序技术[10]被确定为研究微生物群落整体概况的高效工具[11］．已经证明，土壤微生物对污染远比土壤、动物或植物敏感[12- - - - - -14]，有证据表明受石油污染土壤中的微生物与背景土壤中的微生物明显不同[15，16］．有些领域细菌类群变形菌门都存在于不同的受污染受体中，例如土壤[17]及活性污泥[11］．然而，真菌多样性作为污染土壤的良好指标却很少报道。

这是首次将真菌作为污染的典型指标来评价AOS引起的土壤微生物变化。本研究选择土壤上一个4年AOS站点作为采样点源污染，采用高通量测序技术对土壤中的真菌多样性和群落结构进行研究。本研究旨在评价AOS对土壤理化性质、真菌群落结构和多样性的影响，筛选具有优势或核心抗油真菌属，以期在土壤生物修复中发挥潜在的作用。研究结果将有助于深入了解石油污染土壤中的微生物结构，为土壤生物修复提供新的视角。

2.材料和方法

2．1．采样地点

陈年油泥样品取自胜利油田最大的原油产出厂孤岛油厂。孤岛位于纬度37°47的暖温带半干旱季风气候区N 84 37°北纬118°39度E 119°8E.孤岛土壤为盐碱地，芦苇为主要植被。孤岛位于黄河三角洲地区，境内有国家级自然保护区，保护动物数百种，分布面积4500多公里²湿地。由于石油勘探的原因，孤岛上有很多油井，土壤上有大量的油泥溢出点，导致油井周围的AOS点相对较小且分散。

2．2．实验装置

选择了4年前钻的一口直径约为40厘米的油井周围的一个AOS点。AOS点水平中心的2个土壤样品分别采集于土壤表层垂直下0 cm和20 cm处(标记为S1和S2)。然后，选取另一个离AOS中心120 m的表层土壤，没有含油污泥环境的土壤样品作为空白(标记为S3，无污染土壤样品)(图3)1）.所有的样本都被储存在一个冰柜里，并在4小时内取出石头和植物残留物，带回实验室。这些土壤样品被分为两部分。一部分用于理化性质的测定，HMs和TPHs(风干和100目筛处理)。另一部分采用高通量测序分析。

2．3.分析方法

2.3.1。土壤理化性质的测定

使用pH计(梅特勒-托莱多仪器，上海，中国)在土壤/水溶液比例为1:2.5的去离子水中测试pH [18］．水分含量采用重量法测定，称量样品在105℃烘箱干燥24 h前后[19］．盐度是通过固体经过洗涤、过滤、氧化处理后的重量差来确定的₂O₂，在100~105°C烘干至恒重。本研究采用Walkley-Black法测定土壤样品中有机碳的干质量[17］．

采用原子吸收分光光度计(AAS7000，日本岛津，日本)，在微波消解仪中分别以硝酸、氢氟酸和过氧化氢体系(体积比5:2:1)进行消解前处理，测定重金属(铜、锌、铬)含量[20.］．使用吹扫捕集样品浓缩器(Eclipse 4660, OI, USA)与气相色谱(7890A with FID检测器，Agilent Technologies)联合测定TPHs的含量[21］．

2.3.2。基因组DNA提取及PCR扩增

根据制造商的协议，使用土壤DNA试剂盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA)分离和提取三种土壤样品的基因组DNA。DNA提取存储在−20°C的PCR扩增(95°C 5分钟,其次是27个周期为30年代在95°C, 55°C 30年代和72°C 45 s在72°C和最后一个扩展为5分钟)执行的ABI GeneAmp 9700(美国)。利用通用引物ITS1F (5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3)及资讯科技署2r (5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3)，其中条形码是每个样品唯一的八个碱基序列。对3个重复20进行PCR反应μL混合物含4μ5倍FastPfu缓冲液，2μL 2.5 mM dNTPs, 0.8μ每个引物(5μ0.4米),μL的FastPfu聚合酶，10 ng的模板DNA。

2.3.3。Illumina Miseq PE2500测序

扩增子从2%琼脂糖凝胶中提取，根据制造商说明使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(AxyPrep Biosciences, Union City, CA, USA)进行纯化，并使用QuantiFluor:商标:-ST (Promega, USA)进行定量。将纯化的扩增子等摩尔聚合，在Illumina Miseq平台上按照标准方案进行配对测序(2 × 250)。

2.3.4。数据分析

必须对原始数据进行处理，以去除低质量数据[22，以便进一步分析。去除适配器、引物和低质量reads后，将对端reads重叠，用FLASH软件组装最终序列。重叠判断标准为重叠长度>10 bp，默认阈值≤0.2。UCHIME (version 4.2.40)使用Gold数据库进一步过滤Chimera标签，最终生成有效标签。操作分类单元(OTU)分析使用Uparse包(版本7.0.1001)进行，具有97%的序列一致性。使用核糖体数据库项目(RDP)分类器将每个OTU分类分配到UNITE数据库中。OTUs通过去除叶绿体序列、线粒体序列和非分类序列进行处理。最后，保留相对丰度大于1%的otu。

香农-韦弗多样性指数()及辛普森索引()来表示土壤真菌群落的多样性，其计算公式如下: 在哪里是otu的数量，序列的数目在里面吗 ，和为OTUs中所有序列的和。

所有测定至少有三次重复。在0.05的置信水平上确定统计学意义。

3.结果与讨论

3．1.土壤理化性质变化综述

老化油泥粘度高，可固定在土壤孔隙中或吸附在土壤矿物成分表面，导致土壤保水能力和水力导电性降低[1，23，24］．这将导致含油土壤物理化学性质的最终改变。测定了样品的主要理化性质，列于表中1．3个土壤样品的pH值在8.11 ~ 8.56之间。S1(0.27%)和S2(0.36%)的盐度远低于S3(1.45%)，表明aos污染土壤中生物量较高[15］．由于石油的输入，S1和S2区总有机碳(TOC)远高于S3区。S1含水率(21.05%)和S2含水率(22.55%)普遍高于S3含水率(13.95%)，这与以往研究不一致[1，7］．这可能是因为AOS中重油组分形成的疏水结皮限制了水分的蒸发和土壤的水/空气交换[25］．因此，AOS排放的土壤为干旱盐碱地;同时，AOS显著改变了其理化性质。已经证明，土壤性质的差异，如pH和水分，往往与土壤真菌群落的差异有关，不仅在丰富程度上，而且在组成和结构上[17，26，27］．

随着油泥向受纳土壤排放，TPHs和HMs含量显著增加。S1的Cu、Zn、Cr浓度与S2相近，分别是S3的6.3倍、8.4倍和2.2倍1）.大多数重金属具有累积效应，对生态受体和人类特别危险[1］．据报道，真菌群落对HMs的存在非常敏感[28]，对金属污染物的耐受性较细菌强[20.］．S1和S2的TPHs含量分别为15.2 mg/kg和13.6 mg/kg。而在S3中，未检测到(或未达到方法检测限)TPHs。据报道，高浓度的TPHs对土壤酶和微生物的活性具有更强的毒性作用[23］．特别是AOS中的多环芳烃(PAHs)对人类的遗传毒性非常受关注，可通过土壤剖面迁移到地下水[13，29］．此外，在aos污染土壤中发现多环芳烃和HMs之间存在联合毒性效应，本课题组对此进行了研究。

3．2．Miseq测序结果与真菌群落结构

Illumina高通量测序通过扩增真菌ITS区域，采用合成测序方法[30.]能够彻底识别真菌群落结构，包括那些传统方法无法培养或检测到的结构[31- - - - - -34］．共获得ITS基因有效序列96,331条，平均长度为241 bp。采用RDP分类器进行层次聚类分析，相似度阈值为97%。序列信息和真菌多样性指标列于表中2．AOS暴露后，3个样品的OTUs、Ace、Chao 1、Shannon-Weaver指数和Simpson指数均发生明显变化。污染土壤中OTUs、Ace和Chao1指数从S3降低到S2和S1，表明污染土壤中OTUs和物种丰富度降低[35］．S1的Shannon-Weaver指数最低(4.36)，Simpson指数最高(0.0467)，表明真菌群落多样性最小[35］．S2的Shannon-Weaver指数(4.61)和Simpson指数(0.0355)反映的真菌群落多样性最大。使用Good覆盖度估计值评估取样完整性，得到0.999以上的结果，表明所有样品中大多数真菌多样性的适当揭示[36，37］．

稀疏分析用于验证取样的体积或深度是否足以捕获现有otu [22，36］．如图所示2， 3个土壤样品的稀疏曲线格局基本一致，呈趋于平稳的趋势，说明取样真菌种类充足。通过对真菌群落分布的评价，采用维恩图分析真菌的种类组成。可以直接表达不同样本间otu的相似度和重叠数。如图所示3.AOS暴露后，S1、S2和S3中OTUs的数量分别为475、557和565，其中共有240个OTUs，占总序列的73.09%，S1中有168个OUTs, S2中有219个OTUs是唯一的。与S3相比，有160个OTUs在污染土壤中消失。因此，AOS影响了真菌群落的丰富度，在一定程度上改变了真菌多样性。

3．3.真菌群落的分类复杂性

3个土壤样品的真菌群落组成具有相似的多样性，但丰度不同。数字4提供了门水平的真菌群落信息。在鉴定的6个门中，子囊菌类是否是数量最多的门担子在所有样本。子囊菌类已被报道为迄今为止最大的门，有超过64000种已确认的物种，近6400属[38和土壤中最典型的优势门[39］．在这项研究中,子囊菌类占未污染土壤(S3)总DNA序列的63.67%。而在受污染土壤样品中子囊菌类增加到S1的71.58%，S2的70.08%，说明含油污泥有利于水体的存在子囊菌类．根据阿兰达[40]，多环芳烃污染土壤主要寄生于子囊菌类本地子囊菌能够转化或去除多环芳烃。多环芳烃是AOS中烃类的主要成分。因此，它可以解释富集子囊菌类在长期接触AOS后土壤中。的担子由于其丰富的漆酶、酪氨酸酶和可溶性胞外酶(如木质素修饰酶(LME))的供应，已被认为是降解难降解污染物的主要工具[40，41］．在这项研究中，我们观察到担子(S1和S2的−2.46%和−6.26%)，而S3为15.13%。尽管增长有限，担子仍然是污染土壤中第二大门。

在科水平上进一步分析真菌群落组成。总体而言，分配的序列占总序列的91.83%，鉴定出相对丰度大于1%的家族有28个。如表所示3.， S1和S2具有相似的家庭结构和多样性。在无污染土壤(S3)中，丰富度最高的3个科分别为被孢霉科(13.46%)、丝孢霉科(11.32%)和麦粉菌科(9.33%)。而在污染土壤中，上述家族的生长受到强烈限制，其在S1中的比例分别降至5.58%、10.76%、甚至0.00%。与S3相比，污染土壤中某些科的比例显著增加，如头藓科、虫草科、Pleosporaceae和Thelephoraceae。特别是头藓科，作为已鉴定的科中最大的科，是污染土壤中新出现的真菌科，在S1中丰度为16.76%，在S2中丰度为12.63%。Sordariomycetes(子囊菌门)中的头藓科为incertae sedis [42]，因为不确定的系统发育位置和不同的形态[43］．此外，虫草科和侧孢子科属于子囊菌科，而土囊菌科属于担子菌科。

在属水平上分析了真菌的相对丰度。共有39个属，丰度在1%以上。据观察，大多数鉴定属的生长受到限制，可能是因为AOS将TPHs排放到接收土壤中。tph由氢和碳组成，但缺乏微生物生长所必需的氮、硫和磷[44］．作为S3的优势真菌，其生长Mortierella(13.46%),Emericella(10.77%)和Bjerkandera(9.33%)在S1中分别为12.74%、2.08%和0.00%5(一个)),而链格孢属，Cephalotheca,LecanicilliumS1的丰度分别为5.31%、12.63%和1.74% (S3的相对丰度分别为0.05%、0.00%和0.00%)5 (b)）.总的来说，有三个新属(Cephalotheca，Lecanicillium,Septoriella)，在非污染土壤中不存在(0.00%);黑星病菌，链格孢属,Piloderma)在S3中几乎不存在，其占总属数的百分比低于0.1%。Cephalotheca真菌属是在Cephalothecaceae家庭的子囊菌类．在aos污染土壤中，它是核心属，丰度分别为12.63% (S1)和16.70% (S2)。Lecanicillium是众所周知的昆虫病原真菌种。温度在10 ~ 25°C之间和较高的水分有利于分生孢子的萌发Lecanicilliumspp。45］．考虑到胜利油田的平均温度为12.9℃，aos污染土壤的水分含量高于未污染土壤(表2)1)，这可能是出现的原因Lecanicillium．此外,Septoriella，黑星病菌,链格孢属真菌属在哪里子囊菌类,Piloderma真菌属在吗担子这可以适应石油环境。它们是未来应用于油脂污染生物修复的有前景的真菌属。

多个样本的分析显示为聚类树(图6)显示三个样本被分为两组。S1和S2聚类在一起，表明真菌群落结构和多样性更加相似。而S3作为非污染样品，被划分为一个单独的组，这意味着与污染土壤相比，真菌群落的结构和多样性有所区别。此外，两簇菌群分离良好，表明两簇菌群的真菌群落结构和多样性有明显区别[17］．

在本研究中，结合高通量测序的结果，在对优势真菌属进行严格筛选、培养和驯化之前，未来还需要进一步研究，探索更多具有强大耐油特性的微生物，如细菌、古菌等。

4.结论

该研究首次评价了AOS污染对土壤理化性质和真菌多样性的显著影响。结果表明，长期的采油使采油土壤干旱、盐碱，不适宜农业生产。污染土壤中TPHs和HMs的含量均明显高于未污染土壤。Miseq平台高通量测序结果显示，真菌群落组成和多样性发生了显著变化。结果表明，含油环境限制了大部分属的生长，同时也促进了某些耐油真菌的生长黑星病菌（子囊菌类)，链格孢属（子囊菌类),Piloderma（担子）.特别是在老油泥污染土壤中出现了3个新属，其中Cephalotheca被鉴定为核心属，在所有保留属中丰度最高，达16.76%。研究结果有助于深入了解石油污染土壤中微生物的多样性，并为土壤的生物修复提供更好的思路。

缩写

其:	国际转录间隔区
过去:	石油碳氢化合物
号:	重金属
代谢:	岁的油泥
tph energy:	总石油烃
:	操作分类单位
RDP:	核糖体数据库项目
目录:	总有机碳
多环芳烃:	多环芳烃
LME三个月期:	Lignin-modifying酶
主持人:	水分含量。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

基金资助:国家自然科学基金项目(No. 41673112, No. 41541025);山东省黄河三角洲生态环境科学重点实验室开放基金项目(No. 2015KFJJ01)。关键词:边坡，边坡稳定性，边坡稳定性

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