古生菌 古生菌 1472 - 3654 1472 - 3646 Hindawi 10.1155 / 2018/9264259 9264259 研究文章 岁石油污泥对土壤理化性质的影响和真菌多样性揭示了高通量测序分析 http://orcid.org/0000 - 0002 - 4480 - 4516 王 慧慧 1 2 http://orcid.org/0000 - 0002 - 9658 - 3102 旷 他 1 2 http://orcid.org/0000 - 0002 - 2674 - 584 x 朗 Qiaolin 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 8147 - 0677 余 Wenjuan 3 道 余 1 环境与安全工程学院 青岛科技大学 青岛 266042年山东 中国 qust.edu.cn 2 山东省黄河三角洲生态环境科学重点实验室 滨州大学 滨州 256600年山东 中国 bztc.edu.cn 3 化学与分子工程学院 青岛科技大学 青岛 266042年山东 中国 qust.edu.cn 2018年 6 9 2018年 2018年 25 04 2018年 06 08年 2018年 6 9 2018年 2018年 版权©2018慧慧王等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

油田土壤被大量污染多年岁油泥生成的石油工业。在这项研究中,物理化学性质,主要污染物的内容,分析了石油sludge-contaminated岁土壤真菌的多样性。结果显示,年龄在油泥显著改变接收土壤的理化性质和增加的内容主要污染物(石油碳氢化合物和重金属)的土壤。与此同时,内部转录间隔区(ITS)测序Illumina公司Miseq平台在每个分类水平表明,石油污染物的毒理学效应明显影响土壤中真菌的多样性和群落结构。此外,发现存在三个属( Cephalotheca, Lecanicillium, Septoriella岁)出现在石油sludge-contaminated土壤。促进了某些属的增长和石油污染物 子囊菌类(70.83%)和 担子(10.78%)等 黑星病菌, 链格孢属, Piloderma。然而,的发展 Mortierella(9.16%), Emericella(6.02%)和 Bjerkandera(0.00%)是集中有限。这项研究将帮助彻底了解在受到石油污染的土壤中微生物多样性,从而为土壤生物修复提供新的角度。

 山东省生态环境科学重点实验室 2015年kfjj01 中国国家自然科学基金 41541025 41673112 1。介绍

油泥是其中一个最重要的危险固体废物产生在中国石油工业( 1]。主要是来自钻探过程中,开发、运输、炼油和存储的原油。大量油泥由许多有害化学物质,如石油碳氢化合物(phc)和重金属(HMs),这是关心的潜在毒性的人类,已经排放到当地环境( 2- - - - - - 5]。在接收土壤、油泥的有毒成分可能导致营养缺乏或限制种子和植物的生长 6]。油泥堆放在露天的不断减少挥发组分(主要是一些轻油组件)和水分,产生大量的年龄油泥(代谢) 7]。随着时间的流逝,危险化学品的市场被不断排放到当地的环境,导致慢性对接收土壤污染的影响。与油泥相比,市场具有更高的重油的特点的内容,再污染,和更少的综合利用 7]。

在以前的研究中,已经受到了人们足够的重视,正确的处理和充分治疗的叠加油泥( 7, 8]。溢油污泥产油地区,尤其是在油井,忽略了几年甚至几十年,形成大量的土壤AOS-contaminated网站。直到现在,最有害的组件在代谢 9),总石油烃(tph energy)的内容和HMs以及长期的油污染土壤真菌多样性仍未知,很少提到,全球报道。

近几十年来,在各种生物技术,高通量测序技术有更好的检测稀有物种的能力( 10)被认为是一种高效的工具研究微生物群落的整个配置文件( 11]。已经证明,对污染土壤微生物更敏感比土壤、动物或植物( 12- - - - - - 14),在受到石油污染的土壤中微生物的证据显然是不同于在土壤背景( 15, 16]。一些领域的细菌类群 变形菌门土壤污染有不同的受体,如( 17和活性污泥 11]。然而,随着污染的良好指标,在受污染的土壤真菌多样性很少报道。

这是第一个研究了真菌污染的典型指标来评估土壤中微生物的变化引起的代谢。在这项研究中,一个先进的网站4年的土壤被选为抽样的点源污染,土壤中真菌的多样性和群落结构与高通量测序技术的方法进行了探讨。本研究旨在评估从先进的理化性质,影响真菌群落结构和多样性的土壤,以及筛选优势或核心耐油真菌属潜在土壤生物修复使用。结果和相关的研究结果将有助于深入理解微生物结构在受到石油污染的土壤和土壤生物修复提供新的角度。

 2。材料和方法 2.1。采样地点

年龄油泥的样品从孤岛石油工厂,获得最大的输出装置在胜利油田的原油。孤岛在于温暖半干旱温带季风气候区在纬度37°47岁 ′ N 84 37° ′ N和经度118°39 ′ E 119°8 ′ e .孤岛是盐碱地的土壤和提高芦苇为最主要的植被。孤岛位于黄河三角洲的区域内,有国家级自然保护区的数以百计的保护动物和植物分布在4500公里2湿地。石油勘探的原因,有很多油井在孤岛和大量溢油污泥网站土壤,导致相对较小和分散市场网站的油井。

 2.2。实验装置

一个市场现货的油井钻4年前的近似直径40厘米被选中。两个土壤样本的水平中心市场现货收集从0厘米,下面20厘米垂直表面的土壤,分别(贴上S1和S2)。然后,另一个土壤样本得到的表层土壤和120米距离《超能中心不含油污泥环境被选为空白(标记为S3,未被污染的土壤样本)(图 1)。所有的样品都存储在一个冰柜删除石头和植物残体,进行4小时内实验室的支持。这些土壤样本被分成两个部分。一部分用于理化性质的测定,HMs和tph energy(脱水和加工100 -孔筛)。另一部分由高通量测序分析。

抽样地点。

 2.3。分析方法 2.3.1。土壤理化性质的测定

在去离子水pH测试土壤/水解决方案1:比2.5用酸度计(梅特勒-托利多仪器,中国上海) 18]。含水率与重量法测定多种称量样品烘干前后24小时在105°C ( 19]。盐度是由固体的重量的差异在洗的过程中,过滤、氧化与H2O2在100 ~ 105°C,干燥恒重。Walkley-Black方法被用于这项研究确定有机碳在土壤样品的干燥质量( 17]。

内容的重金属(铜、锌、铬)是由原子吸收分光光度计(AAS7000、日本岛津公司、日本),由硝酸消化预处理,氢氟酸,和过氧化氢系统(5:2:1卷),分别在微波消解仪 20.]。内容tph energy测量使用净化&陷阱样本集中器(美国OI Eclipse 4660)结合GC (7890 a和FID检测器,安捷伦科技)( 21]。

 2.3.2。提取基因组DNA, PCR扩增

基因组DNA的三个土壤样本分离和提取使用DNA工具包(美国GAωBio-tek, Norcross)后,制造商的协议。DNA提取存储在−20°C的PCR扩增(95°C 5分钟,其次是27个周期为30年代在95°C, 55°C 30年代和72°C 45 s在72°C和最后一个扩展为5分钟)执行的ABI GeneAmp 9700(美国)。真菌rDNA-ITS区域放大使用通用引物ITS1F (5 ′ -CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ′ )和ITS2R (5 ′ -GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3 ′ ),条码是一种eight-base序列样本的不同而各异。20 PCR反应进行了一式三份 μL混合物4 μL 5 x FastPfu缓冲区,2 μL(2.5毫米核苷酸,0.8 μ每个引物(5 L μ0.4米), μL FastPfu聚合酶,10 ng的模板DNA。

 2.3.3。Illumina公司Miseq PE2500测序

扩增子从2%琼脂糖凝胶中提取和纯化使用AxyPrep DNA凝胶萃取工具包(美国联盟城市Axygen生物科学,CA)根据制造商的指示和量化使用QuantiFluor:商标:-(美国Promega)。纯化扩增子克分子数相等的汇集,paired-end测序(2×250)在一个Illumina公司Miseq平台根据标准协议。

 2.3.4。数据分析

原始数据必须消除低质量数据处理( 22为进一步分析。删除适配器后,引物和劣质读取,pair-end读取重叠使用FLASH软件组装最后的序列。标准的重叠,重叠长度> 10 bp和默认阈值≤0.2。嵌合体标签被UCHIME进一步过滤掉使用黄金数据库(4.2.40版),最后生成的有效标记。操作分类单位(OTU)分析使用Uparse包(版本7.0.1001)97%的序列的身份。每个OTU分类学的分配统一数据库使用核糖体数据库项目(RDP)分类器。辣子鸡被移除叶绿体序列加工,线粒体序列,和非机密的序列。最后,辣子鸡相对丰度高于1%的保留。

Shannon-Weaver多样性指数( H )和辛普森指数( D )被用来表达土壤真菌群落的多样性,计算如下: (1) H 年代 h 一个 n n o n = − ∑ 我 = 1 年代 o b 年代 n 我 N ln n 我 N , D 年代 我 米 p 年代 o n = ∑ 我 = 1 年代 o b 年代 n 我 n 我 − 1 N N − 1 , 在哪里 年代 o b 年代 是辣子鸡的数量, n 我 序列的数量吗 O T U 我 , N 是所有的总和辣子鸡的序列。

所有的决定都至少执行一式三份。统计学意义是0.05的信心水平决定的。

 3所示。结果与讨论 3.1。概述土壤物理化学性质的变化

由于其高粘度,享年油泥可以固定在土壤孔隙或吸附在土壤表面的矿物成分,导致减少土壤的保水能力和渗透系数( 1, 23, 24]。它将导致最终改变石油获得土壤的物理和化学性质。样品的主要物理化学性质测定和列在表 1。这是观察到的pH值三个土壤样本从8.11到8.56不等。的盐度S1和S2(0.27%)(0.36%)远低于S3(1.45%),表明较高的生物量AOS-contaminated土壤( 15]。总有机碳(TOC)在S1和S2远高于在S3中由于石油输入。水分含量S1和S2(21.05%)(22.55%)高出一般与S3(13.95%)相比,这是不符合先前的研究[ 1, 7]。这可能是因为疏水外壳由重油组件市场有限的水的蒸发和土壤水/空气交换( 25]。因此,假如周围的土壤放电是干旱和盐碱地土壤;与此同时,其物理和化学性质被先进的显著改变。已经表明,土壤性质的差异,如pH值和水分,经常与土壤真菌群落的差异,不仅丰富而且在组成和结构( 17, 26, 27]。

石油sludge-contaminated土壤理化性质的年龄。

样本 pH值 盐度(%) MC一个(%) TOCb(%) HMsc(毫克∙公斤−1) tph energyd(毫克∙公斤−1)
铜 锌 Cr
S1 8.44 0.27 21.05 0.41 76.60 131.63 74.55 15.2
S2 8.56 0.36 22.55 0.35 47.93 93.81 111.46 13.6
S3 8.11 1.45 13.95 0.22 12.20 15.68 34.07 < 5

一个主持人:水分含量;bTOC:总有机碳;cHMs:重金属;dtph energy:总石油烃。

连同油泥的发射接收土壤tph energy和HMs的内容集中增加了。浓度的铜、锌、铬在S1与S2差不多的,而6.3,8.4,和2.2倍的S3,分别(表 1)。大多数重金属累积效应,是特别危险的生态受体和人类 1]。真菌社区报道强烈敏感HMs的存在( 28)和宽容金属污染物高于细菌( 20.]。另一方面,S1和S2的tph energy的内容分别为15.2毫克/公斤和13.6毫克/公斤,分别。在S3,没有(或方法)的检测极限下tph energy。更高浓度的tph energy已报告显示更强的毒性影响土壤酶和微生物的活动 23]。特别是,多环芳烃(多环芳烃)的代谢基因毒性对人类极为关注的问题,可以通过土壤剖面(迁移到地下水 13, 29日]。此外,它是发现多环芳烃之间的联合毒性作用和HMs AOS-contaminated土壤,这是我们研究小组研究了。

 3.2。Miseq测序结果和真菌群落结构

通过放大其地区的真菌,Illumina公司高通量测序,采用sequencing-by-synthesis方法( 30.)启用彻底的真菌群落结构的识别,包括那些无法培养或传统方法中发现 31日- - - - - - 34]。96331年完全有效的基因序列得到平均长度为241个基点。RDP分类器是用于分层聚类分析相似度阈值的97%。序列信息和真菌多样性索引表中列出 2。辣子鸡的数字,王牌,曹国伟1,辛普森Shannon-Weaver索引,索引的三个样本显示市场暴露后明显的变化。辣子鸡的数量、Ace和Chao1索引减少从S3 S2和S1,显示更少的辣子鸡和物种丰富度在受污染的土壤 35]。S1 Shannon-Weaver最低指数(4.36)和辛普森指数最高(0.0467),建议最小的真菌群落多样性( 35]。而Shannon-Weaver指数(4.61)和辛普森指数(0.0355)的S2反映最大的真菌群落多样性。良好的报道估计量是用来评估抽样完整性,获得高于0.999的结果,表明一个适当的显示大多数真菌多样性的所有样品( 36, 37]。

序列信息和真菌多样性指标的样本。

样品标识 读取 0.97(辣子鸡的相似性阈值)
辣子鸡 王牌 Chao1 报道 Shannon-Weaver 辛普森
S1 31118年 475年 476年 478年 0.999734 4.36 0.0467
S2 31938年 557年 558年 558年 0.999812 4.61 0.0355
S3 33275年 565年 567年 566年 0.999730 4.44 0.0414

稀疏的分析被用来验证是否音量或取样的深度足以捕捉现有辣子鸡( 22, 36]。如图 2,三个土壤样本通常有相同的稀疏模式曲线显示平整的趋势,表明足够的抽样的真菌的物种。维恩图被用来分析评估的物种组成真菌的分布。它可以提供直接的表达不同样本之间的相似和重叠的辣子鸡。如图 3,辣子鸡的数量在S1、S2和S3是475年,557年和565年,另外,其中240年辣子鸡占总数的73.09%序列是共享的,168出局S1和S2 219辣子鸡是独一无二的,分别在《超能曝光。同时,比较160年S3,辣子鸡消失在受污染的土壤。因此,市场受影响社区丰富的真菌,真菌多样性在一定程度上改变了。

稀疏曲线基于18 s rRNA基因测序。

OTU维恩在不同样本分析。

 3.3。分类真菌群落的复杂性

真菌群落组成三个土壤样本反映多样性相似,但不同的丰度。图 4提供了真菌门社区信息的水平。在总6门, 子囊菌类是最丰富的门后面吗 担子在所有样本。 子囊菌类据报道到目前为止最大的门近6400属(超过64000种识别 38和最典型的土壤中占主导地位的门 39]。在这项研究中, 子囊菌类占63.67%的总DNA序列noncontaminated土壤(S3)。在受污染的土壤样品,的百分比 子囊菌类在S1和S2的70.08%增加到71.58%,表明含油污泥的存在是有益的 子囊菌类。根据阿兰达[ 40),PAH-polluted土壤是主要由殖民 子囊菌类和土著子囊菌能够改变或删除多环芳烃。多环芳烃的主要成分是碳氢化合物代谢。因此,它可以解释的浓缩 子囊菌类在土壤长期市场风险。的 担子一直被认为是杰出的工具,顽固的污染物的降解,由于其丰富的漆酶,酪氨酸酶,酶和可溶性细胞外的酶,如lignin-modifying (LME) ( 40, 41]。在这项研究中,我们观察到减少的百分比 担子(−2.46% S1和S2−6.26%)相比,受污染的土壤与S3 (15.13%)。尽管增长是有限的, 担子仍然是第二大类群在受污染的土壤。

在门级别真菌群落结构的柱状图。

进一步分析进行了分析真菌群落组成家庭的水平。一般来说,总数的91.83%序列被分配有28确定家庭的相对丰度在1%以上。如表所示 3,S1和S2相似的家庭结构和多样性。noncontaminated土壤(S3),三大丰富家庭Mortierellaceae (13.46%)、Aspergi laceae(11.32%),和Meruliaceae (9.33%)。在受污染的土壤,以上家庭的增长非常有限,他们在S1的百分比减少到5.58%,10.76%,甚至0.00%。相反,某些家族的比例显著增加在污染土壤与S3相比,如Cephalothecaceae Cordycipitaceae Pleosporaceae, Thelephoraceae。特别是Cephalothecaceae家族,作为最大的家庭在所有确认的家庭,这是一个new-appeared真菌家庭污染土壤丰富的16.76% S1和S2的12.63%。这个家庭Cephalothecaceae Sordariomycetes(子囊菌类)incertae基准( 42因为不确定的系统发育位置和不同形态( 43]。此外,Cordycipitaceae和Pleosporaceae是子囊菌类的成员,而Thelephoraceae属于担子。

在家庭层面的真菌群落结构和多样性。

OTU ID S1 S2 S3
Cephalothecaceae 16.76% 12.63% 0.00%
曲霉科 10.76% 2.80% 11.32%
不保密的 9.61% 7.63% 7.28%
Mortierellaceae 5.58% 12.74% 13.46%
Thelephoraceae 5.36% 2.18% 0.58%
Nectriaceae 4.22% 5.08% 5.24%
Cordycipitaceae 4.06% 3.09% 1.43%
肉座菌科 3.52% 1.11% 4.22%
发菌科 2.72% 2.36% 3.17%
Pleosporaceae 2.46% 5.44% 0.19%
Lasiosphaeriaceae 2.39% 6.26% 5.50%
Hypocreales_norank 2.27% 3.01% 3.85%
Pseudeurotiaceae 2.15% 0.91% 2.03%
Didymellaceae 1.91% 1.42% 0.80%
毛壳菌科 1.67% 2.97% 3.62%
Venturiaceae 1.60% 0.40% 0.08%
Stachybotriaceae 1.48% 0.33% 1.47%
Sporormiaceae 1.28% 0.35% 1.09%
Atheliaceae 1.21% 0.37% 0.10%
Sebacinaceae 1.17% 0.26% 0.16%
Botryosphaeriaceae 1.15% 3.09% 4.46%
Helotiales_norank 1.12% 0.92% 0.55%
菌科 0.86% 2.09% 2.01%
Cystofilobasidiaceae 0.82% 1.49% 1.38%
Herpotrichiellaceae 0.57% 0.59% 1.15%
Polyporales_norank 0.47% 1.04% 0.94%
麦角菌科 0.42% 1.21% 0.72%
Phaeosphaeriaceae 0.34% 1.74% 0.06%
Meruliaceae 0.00% 0.00% 9.33%

真菌丰度在属的水平也进行了分析。完全,39属的丰度在1%以上分类的样本。观察,大多数确认属的增长是有限的,可能的原因,《超能出院土壤tph energy到接收。tph energy由氢和碳,但缺乏氮、硫和磷微生物生长所必需的( 44]。作为主要真菌在S3中生长的 Mortierella(13.46%), Emericella(10.77%)和 Bjerkandera(9.33%)提出了一个动态降低到12.74%,2.08%,0.00%,S1,分别(图 5(一个)),而 链格孢属, Cephalotheca, Lecanicillium丰度的5.31%、12.63%、1.74%,S1发现oil-tolerant (S3中的相对含量分别为0.05%,0.00%,和0.00%)(图 5 (b))。一般来说,有三个新属( Cephalotheca, Lecanicillium, Septoriella),不存在noncontaminated土壤中(0.00%),和另外三个属( 黑星病菌, 链格孢属, Piloderma)在S3中几乎找不到总数的百分比低于0.1%的属。 Cephalotheca属的真菌 Cephalothecaceae家庭的 子囊菌类。这是核心属丰度高的12.63% (S1)和16.70% (S2) AOS-contaminated土壤。 Lecanicillium众所周知,昆虫病原真菌的物种。温度10至25°C和更高的水分有利于分生孢子的萌发 Lecanicilliumspp。 45]。考虑到胜利油田的平均温度是12.9°C,和AOS-contaminated土壤水分含量高于noncontaminated土壤(表 1),它可能会出现的原因 Lecanicillium。此外, Septoriella, 黑星病菌, 链格孢属属的真菌吗 子囊菌类, Piloderma属的真菌 担子能够适应油情况。他们是有前途的真菌属,可用于将来在石油污染的生物修复。

相对丰富的三个(一个)有限公司属和(b)耐油属样本。

多个样本的分析显示为集群树(图 6)证明了三个样本分为两个集群。S1和S2是集中在一起,表明更类似真菌群落结构和多样性。而作为noncontaminated样本,S3分为分离组织,这意味着区别的真菌群落结构和多样性受污染的土壤。此外,两个集群分离,提出了一个明确的区分的真菌群落结构和多样性之间的两个集群( 17]。

多个样本聚类树。

在目前的研究中,结合高通量测序的结果,进一步的研究应在未来探索更多的微生物如细菌和古生菌耐油性和强大的特性在严格的筛选,培养,驯养的优势菌属。

 4所示。结论

这是第一个研究,评估了显著影响土壤理化性质和真菌多样性代谢造成的污染。结果显示,长期石油暴露接收土壤干旱、盐碱地,不适合农业。tph energy和HMs的内容被污染土壤的土壤与noncontaminated相比明显增加。Miseq平台的高通量测序结果显示重要的真菌群落组成和多样性的变化。这是观察到油的情况下可能会限制大多数属的增长,同时促进某些耐油真菌的生长 黑星病菌( 子囊菌类), 链格孢属( 子囊菌类), Piloderma( 担子)。特别是,有三个new-appeared属岁石油sludge-contaminated土壤,其中 Cephalotheca被确认为核心属丰度最高的16.76%在所有保留属。结果可能在受到石油污染的土壤中微生物多样性的深入了解和更好的了解土壤生物修复。

 缩写 其:

国际转录间隔区

 过去:

石油碳氢化合物

 号:

重金属

 代谢:

岁的油泥

 tph energy:

总石油烃

 :

操作分类单位

 RDP:

核糖体数据库项目

 目录:

总有机碳

 多环芳烃:

多环芳烃

 LME三个月期:

Lignin-modifying酶

 主持人:

水分含量。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项工作是由中国国家自然科学基金资助(41673112号,41541025)和山东省重点实验室开放研究基金项目对黄河三角洲生态环境科学、滨州、山东(2015 kfjj01)。

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