建筑表达航天飞机Haloarchaeon向量Natrinemasp。J7基于其染色体起源的复制

文摘

HaloarchaeonNatrinema第一个报道,sp。J7 archaeon窝藏质粒和chromosome-based温带病毒,是一种有用的模型为研究古细菌病毒-宿主和virus-virus交互。然而,缺乏遗传工具这样的研究有限。的基础上自动复制J7染色体和序列pyrF标记,我们七个向量,构造六被证实具有复制能力pyrF -删除的导数J7 (J7-F)。其中向量,pFJ1、pFJ4 pFJ6可以转化为宿主菌株效率相对较高(约10³菌落/μg DNA),出席每一个副本染色体。这三个向量可以稳定维持在J7-F没有选择和被用于外源蛋白表达。只有pFJ6被发现出现在转化细胞在一个完全游离,非整合状态(每个染色体一份)。相比之下,一些pFJ1和pFJ4 DNA可能是集成到J7-F染色体。此外,pFJ6被发现在J7兼容pYCJ细胞,这表明这两个向量可以用于virus-virus和病毒-宿主相互作用的进一步研究。

1。介绍

极端嗜盐古生菌构成的一组微生物生长在高盐环境中,包括太阳能盐场和天然盐湖。这组由大约48属177种(1),形成古生菌的一个重要组成部分2]。与其他组古生菌相比,这些haloarchaea尤其适用于研究目的,因为他们很容易在实验室培养和操纵。他们也可以作为有用的模型为研究古细菌病毒,而表现出显著的形态多样性和独特基因的内容。然而,这些haloarchaea及其病毒的研究受到适当的遗传工具的可用性。haloarchaea 48属中,只有三个属的遗传工具已经开发出来,也就是说,Haloferax(3,4),Halobacterium(5),而Haloarcula(6]。考虑到没有一个热点是代表域作为一个整体,甚至自己的特定群体,这将是重要的遗传工具开发的许多haloarchaea仍然缺乏这些资源。

大多数haloarchaeal航天飞机向量源于内生质粒,如pGRB1 [7],pHH1 [8],pNRC100 [9从Halobacterium salinarum或pHK2 [4,10],pHV2 [11,12],pHV1/4 [13从Haloferax volcanii。一些飞船向量的复制功能源于噬菌体元素或染色体复制起源(oriCs),如pUBP1和pUBP2。这些都是构建基于ΦH复制子(5)和pBBori7,使用oriC / orc7创建Halobacteriumsp。NRC-1 [14]。大多数haloarchaea建立遗传工具可以使用聚乙二醇(PEG)的转换。然而,只有少数选择标记可用于haloarchaea。新生霉素抑制DNA促旋酶(gyrB)[15),和mevinolin抑制β-还原酶(16古生菌)是两种广泛使用的抗生素。营养缺陷型的选择标记参与氨基酸或核苷酸生物合成也被使用。其中包括ura3和pyrE2在尿嘧啶生物合成有关的基因(17,18),trpA在色氨酸生物合成基因,leuB基因参与白氨酸生物合成,hdrB基因用于胸苷生物合成(12]。在这些标记,ura3和pyrE2基因敲除或更换研究尤其有用,因为他们可以使用5-fluoroorotic counterselected酸(18]。

的halobacterial属Natrinema11月,将军McGenity等人提出的基于的系统发育分析16 s rRNA物种基因序列和分类属性的成员。菌株在这个属需要至少10%的盐浓度,以便基本细胞生长和最优增长19.8%到25.1% (19]。七个物种被发现到目前为止在本属。其中之一是Natrinemasp。J7被隔离在一个营盐矿在湖北省,中国。这是唯一毒株的基因操纵工具成立(20.,21和基因组序列测序完成的22]。J7衍生品的研究集中在蛋白酶SptA [23,24和技术学院25),热休克蛋白70 (26,27),DNA片段赋予启动子活动三个领域的生活。J7-1,值得注意的是,它的一个衍生品是第一个港口archaeon报道两种温带haloarchaeal病毒:sphaerolipovirus SNJ1 [28,29日)和pleolipovirus SNJ2 [30.]。因此,J7-1可以作为一个优秀的模型为研究病毒-宿主和virus-virus古生菌的相互作用。然而,遗传工具的缺乏阻碍了这些研究。

以前,基于孤立的营养缺陷型的整合质粒突变体J7衍生品被建造,用来表达外源蛋白在J7 [20.]。最近,一位穿梭载体(pYCJ)基于SNJ1复制子(核苷酸1 - 4481)也是构建和验证外源蛋白的表达和纯化21]。子和基因元素控制病毒基因组复制、维护和拷贝数确定在SNJ1复制子。此外,负责重复感染的关键元素排斥和裂解/溶原性转换SNJ1病毒也位于这个区域(未发表的数据)。因为任何突变SNJ1质粒的复制子会损害自我复制能力,pYCJ向量不适合调查这些监管机构和元素。因此,必须开发额外的基因工具使研究这些病毒和宿主。在这项研究中,七个航天飞机向量来自于预测oriCs J7染色体的构建。每一个向量包含了pyrF基因和自主复制序列(ARS,一个或两个预测oriCs)。6这些向量(pFJ1、pFJ3 pFJ4, pFJ5, pFJ6,和pFJ7)成功转化为J7-F,但只有pFJ1, pFJ4, pFJ6可以转换效率相对较高(10³菌落(cfu) /μg DNA)。这三个航天飞机向量被进一步研究,发现稳定维持在大约每染色体在一份J7-F没有选择。pFJ1和pFJ4可能存在质粒形式或整合到宿主染色体,而pFJ6复制只有在非整合状态,兼容pYCJ J7细胞。所有三个向量都验证J7-F淀粉酶的稳定表达蛋白的细胞,使它们仪器为进一步研究SNJ1病毒,以及J7衍生品。

2。材料和方法

2.1。菌株,媒体,和增长的条件

表列出菌株用于这项研究1。不同的衍生品Natrinemasp。J7生长在《光晕2》中在45°C,如前所述[28,30.]。J7-F菌株缺乏染色体pyrF基因的礼物对黄教授(武汉大学生命科学学院)。基本培养基(MM;18%),修改后的生长培养基(米高梅;18%)准备按照Halohandbook [31日]。大肠杆菌菌株DH5α和JM110用于质粒DNA在Luria-Bertani培养基培养建设,经常在37°C。琼脂(1.5%)时添加固体模拟上述媒体的需要。

2.2。预测oriCs J7染色体

基于web的工具Ori-Finder 2是用来预测oriCs古细菌基因组(32]。OriCs预测基于一个集成的碱基组成不对称使用z曲线的方法,分析原产地分布识别框(orb)确定使用找到个人主题发生(33,基因的发生经常接近oriCs。

2.3。质粒构建

质粒和引物用于这项研究在表中列出1和2,分别。0.95 kbBam你好,系统网络体系结构(Sna)BI片段组成的pyrF基因和启动子区域的200个基点都不会基因(P_都不会)Haloferax volcaniiDS2从pNBK-F克隆质粒进入Bam你好,系统网络体系结构(Sna)BI pUC-M向量生成pUC-M-pyrF的网站。

七个系统网络体系结构(Sna)BI -Mfe我领悟了ars包含一个或两个预测oriCs放大从J7基因组被绑定到消化pUC-M-pyrF质粒创建pFJ1 pFJ2, pFJ3, pFJ4, pFJ5 pFJ6, pFJ7。12的特定位置预测oriCs和七个ars如表所示3。1.7 kb片段包含amyH200个基点及其启动子(Apro-amyH)放大Haloarcula hispanicaDSM4426。限制性内切酶序列Mfe我,Afl二世,Spe我和不我添加了5′末端片段不我,新人道我,Nsi我和Sph我的网站被添加到3′末端。的MfeI-Apro-amyH -Sph我分段结扎成pFJ1、pFJ4 pFJ6生成pFJ1-A, pFJ4-A和pFJ6-A分别。消化后不我随后self-ligation Apro-amyH片段被从每个向量构造pFJ1-M, pFJ4-M, pFJ6-M。的物理地图pFJ1-M pFJ4-M, pFJ6-M图所示1。200个基点片段包含上游地区的3916个基因(3916 pro)位于J7染色体被放大和结扎成pFJ1-M, pFJ4-M,和pFJ6-M生成质粒pfj1 - m - 3916, pfj4 - m - 3916和pfj6 - m - 3916,分别用于质粒拷贝数的决心。

2.4。转换方法

J7-F细胞遗传转化进行了在室温下使用挂钩,如前所述[21]。毫米(18%)制备了用于选择和传播Natrinemasp。J7-F转化株。

2.5。航天飞机的稳定性和维护向量

评估向量的结构稳定性,我们孤立pFJ1 pFJ4,和pFJ6 J7-F转化株,back-transformed成大肠杆菌放大,提取质粒,并对其进行了限制性内切酶消化。质粒DNA提取大肠杆菌(没有变成J7-F细胞),消化,作为一个积极的控制。

维护pFJ1、pFJ4 pFJ6航天飞机向量是评估通过计算每一个质粒的速度失去了每一代在非选择性生长,如前所述[21]。简单地说,克隆被培养来指数期大约五天在5毫升18%毫米45°C。文化被稀释1:100年5毫升新鲜的《光晕2》中、孵化24 h。这个稀释过程重复12次(J7细胞的倍增时间~ 2.9小时)。每两个稀释,文化被传播到18%米高梅板块(J7-F细胞的非选择性条件)。50个随机克隆选择和受移植者在米高梅18%或18%毫米板。克隆的数量,对这两种类型的盘子。生存18%毫米板表示向量的维护。

2.6。印迹分析

印迹分析确定航天飞机向量(pFJ1、pFJ4 pFJ6)集成到J7-F染色体并测量他们的数字拷贝。J7-F细胞转化pFJ1、pFJ4或pFJ6被种植在200毫升18%毫米和收获指数的阶段。他们的基因组DNA是孤立如前所述[34),在唯一的消化欣dIII网站在航天飞机向量,由1% (w / v)琼脂糖凝胶电泳。在碱性溶液中变性(1 M氯化钠,0.5 M氢氧化钠),DNA样本被转移到一个带正电的尼龙膜。随后,DNA被孵化固定在80°C 2 h和探索使用pyrF片段贴上digoxigenin——(挖)dUTP随机引物,根据指令的DIG-High ' DNA标记和检测Starter Kit(罗氏)。确定质粒拷贝数,200年英国石油公司上游J7 3916基因的片段,每个染色体,出席一个副本被放大和结扎成pFJ1, pFJ4, pFJ6。然后,总DNA隔绝J7-F / pfj1 - 3916 pro, J7-F / pfj4 - 3916 pro, J7-F / pfj6 - 3916 pro是消化分3 ai进行印迹分析如上所述,使用DIG-labeled 3916 pro作为探针序列。

2.7。淀粉酶活性测定

特定的淀粉酶活性的上层清液从长江/ pYCJ-Apro-amyH CJ7-F / pFJ1-Apro-amyH CJ7-F / pFJ4-Apro-amyH, CJ7-F / pFJ6-Apro-amyH测量如前所述[21]。淀粉酶活动的一个单位被定义为所需数量的淀粉酶水解淀粉的1毫克1 h。

3所示。结果

3.1。分析和克隆复制区域的J7染色体

建造航天飞机向量J7衍生品,oriCs J7染色体的预测使用基于web的Ori-Finder 2工具。如表所示3(一)12 oriCs预测J7染色体;他们中的大多数有一个相对较低的GC含量比J7染色体(64%)和它们包含的球体。除了oriC3和oriC10,另oriCs都毗邻cdc 6基因,编码replication-initiating蛋白质。然而,一些oriC对的位置,如oriC1 oriC2, oriC5 oriC6, oriC7 oriC8,以及oriC11 oriC12,非常接近和毗邻一样cdc 6基因(表3(a))。五个假定ars包含一个或两个oriCs及其附近cdc 6基因(表而被放大3(b))。这些被绑定到pUC-M-pyrF构造pFJ1, pFJ2, pFJ3, pFJ4, pFJ5航天飞机向量。此外,oriC12 oriC3,没有毗邻cdc 6基因,也放大,用来构造pFJ6 pFJ7,分别。如表所示3(b),所有成功转化为向量除了pFJ2 J7-F细胞。转换效率pFJ1、pFJ4 pFJ6大约是10³cfu /μg DNA,略低于SNJ1 replicon-based向量,pYCJ [21]。只有少数转化株获得改造后与pFJ3 JF-7细胞,pFJ5, pFJ7。这些结果表明,至少有六个地区J7染色体具有复制能力,这是符合的存在多个复制的染色体起源最haloarchaeal菌株(35]。

3.2。维护和结构稳定性J7-F oriC-Based向量的细胞

评估所有航天飞机向量的结构稳定性(pFJ1、pFJ3 pFJ4, pFJ5, pFJ6,和pFJ7)和验证其能够独立复制J7-F细胞,从每个向量转化株和back-transformed提取的质粒DNA大肠杆菌(posttransformed质粒)、分离和酶消化。航天飞机向量提取大肠杆菌(pretransformed成J7-F细胞)作为积极的控制。如图2pretransformed(通道2)和posttransformed(车道4)质粒消化资料显示相似,表明结构稳定性的结构是保持J7-F细胞,这六个向量独立复制的染色体。如上所述,pFJ3、pFJ5 pFJ7可成功转化为J7-F细胞,但他们的转换效率太低是适合J7细胞的基因操作。因此,这三个向量被排除在进一步的研究。

维护pFJ1、pFJ4 pFJ6决心通过计算生存频率在18%毫米非选择性增长。如图3,所有向量可以稳定维持在J7-F细胞培养后12天(~ 100代),表明他们可以稳定隔离到子细胞在细胞生长。

3.3。存在pFJ6转化细胞游离,非整合状态

南方污点分析来确定pFJ1 pFJ4, pFJ6集成到J7-F染色体。总DNA提取三个独立J7-F每个质粒的转化株消化了欣dIII,由1% (w / v)琼脂糖凝胶电泳(图4(一)),然后进行印迹分析。质粒提取大肠杆菌被用作控制和DIG-labeled吗pyrF基因是用作探针。只有一个欣dIII限制站点在pFJ1被发现,pFJ4, pFJ6质粒。因此,消化非整合质粒从总DNA样本预测线性化5.86 kb, 5.66 kb,和5.35 kb,分别区分他们从整合质粒。如图4 (b)在每个位置上都可以看到,杂交信号的线性化质粒DNA,在欣dIII-digested提取DNA样本大肠杆菌(通道1、5、9)或在欣dIII-digested J7-F总准备从文化中提取DNA克隆携带pFJ1(通道2 - 4),pFJ4(道6 - 8),和pFJ6(车道10 - 12)。然而,相比单杂交信号获得使用总DNA提取pFJ6-transformed J7-F细胞(车道10 - 12),调查也相对较大片段的杂化从pFJ1提取的总DNA样本,pFJ4-transformed J7-F细胞(通道2 - 4和6 - 8,resp)。这些数据表明,只存在于一个游离pFJ6 J7细胞非整合状态,而pFJ1和pFJ4可能融入CJ7-F染色体。需要额外的实验来证实这些结果。

3.4。相对数量的副本pFJ1、pFJ4 pFJ6 J7-F细胞

航天飞机向量包含染色体oriCs通常出现在每一个副本染色体(36]。我们测试这个是否适用于pFJ1, pFJ4, pFJ6。200 bp单副本3916 pro段被放大和结扎成航天飞机向量用于这项研究。总DNA随机选择从三个独立J7-F包含pfj1 - m - 3916的转化株,pfj4 - m - 3916和pfj6 - m - 3916,分别是消化分3 ai, 1%琼脂糖凝胶电泳分离,并受使用DIG-labeled 3916 pro印迹分析调查。686个基点片段包含3916 pro J7染色体消化后的解放分3人工智能,而1119个基点、978个基点和1266个基点片段包含3916 pro产生pfj1 - m - 3916, pfj4 - m - 3916, pfj6 - m - 3916(图5(一个))。如图5 (b)DIG-labeled 3916 pro的686个基点的片段序列杂交J7染色体和相应的片段的质粒。杂交信号的强度产生pFJ6 - m - 3916和染色体DNA片段几乎是相同的,表明pFJ6出席大约每一个副本在J7-F细胞染色体。相比之下,杂交信号的强度由pfj1 - m - 3916和pfj4 - m - 3916略强于相应染色体的DNA片段,这意味着pfj1 - m - 3916和pfj4 - m - 3916每个染色体出席多个副本。这些结果可能归因于这一事实的一部分pFJ1 pFJ4可以融入J7染色体;然而,需要额外的实验来证实。

3.5。航天飞机的效用向量pFJ1, pFJ4, pFJ6

确定这些航天飞机的效用向量,Haloarcula hispanicaDSM 4426艾米H基因及其启动子插入pFJ1 pFJ4, pFJ6。改造后长江细胞与各自的质粒(pFJ1-A、pFJ4-A pFJ6-A),三个随机选择的殖民地/质粒转移到18%米高梅盘子补充2% (w / v)的可溶性淀粉。如图6(一)、透明晕周围发现了殖民地与碘溶液向盘子后,表明淀粉酶表示。相比之下,殖民地J7-F细胞窝藏只有pFJ1 pFJ4,或pFJ6没有淀粉酶活性,证实了淀粉酶在淀粉消费的作用。如图6 (b)、淀粉酶活性的上层清液CJ7-F / pFJ1-Apro-amyH CJ7-F / pFJ4-Apro-amyH, CJ7-F / pFJ6-Apro-amyH文化在同一OD600普遍低于长江/ pYCJ-Apro-amyH。这个结果可以解释的拷贝数pYCJ(每个染色体一至三册)(21),高于pFJ1 pFJ4, pFJ6。淀粉酶活性发生在CJ7-F / pFJ6-Apro-amyH最高,表明pFJ6开车比pFJ1和pFJ4更大的蛋白表达。

3.6。兼容性pFJ6和SNJ1 Replicon-Based pYCJ

兼容的航天飞机向量是优秀的调查原核生物蛋白质和protein-DNA交互的工具。以前,我们首先报道了Natrinemasp。J7大肠杆菌穿梭载体,pYCJ,构造基于SNJ1复制子和验证稳定表达外源蛋白。因为在J7 pFJ6也可以维持细胞和没有融入J7染色体,我们测试是否pFJ6 pYCJ互相兼容。pFJ6和pYCJ cotransformed成J7-F细胞和转化株被选为18%包含5毫米μ克/毫升mevinolin。pFJ6的存在和pYCJ转化株被使用引物PCR检测目标pyrF分别和mevR。结果表明,pyrF和mevR被发现在所有随机选择转化株(数据未显示),表明这两个经由互相兼容。

4所示。讨论

HaloarchaeonNatrinemasp。J7是第一个已知archaeon港两个质粒,chromosome-based温带病毒,SNJ1 SNJ2。这两个病毒显示许多有趣的特性。首先,SNJ2只能实现高效生产与SNJ1 J7病毒合并感染,表明SNJ1促进了SNJ2[的复制30.]。然而,很少有人知道这背后的机制virus-virus交互。其次,SNJ1能感染长江,没有港口pHH205,但不能感染J7-1(港pHH205),表明溶原性SNJ1病毒可能建立重复感染排除或免疫力,古生菌的现象知之甚少。第三,几个子元素和遗传控制病毒基因组复制、维护和拷贝数最近发现SNJ1病毒(21]。然而,这些遗传因素和基因的机制是完全未知的。所有这些观察结果表明,J7及其病毒是优秀的模型为研究病毒-宿主和virus-virus古生菌的相互作用。到目前为止,SNJ1 replicon-based pYCJ一直唯一的穿梭载体使J7遗传操纵细胞。因为pYCJ穿梭载体包含SNJ1复制子(21),它不能用于SNJ1大多数研究,尤其是对功能性研究调控蛋白编码的SNJ1复制子。此外,考虑到只有一个穿梭载体可供J7细胞,研究蛋白质或protein-DNA交互也有限。在这项研究中,七个向量的基础上预测oriCs J7染色体和pyrF标记构造;6他们可以复制的尿嘧啶营养缺陷型的J7应变(J7-F)。三个质粒(pFJ1 pFJ4, pFJ6)可以转化成J7-F细胞效率高(10³cfu /μg DNA)。这三个向量稳定保持在转换J7-F细胞没有选择和可以用来表达外源蛋白。值得注意的是,其中一个向量,pFJ6,存在质粒在J7细胞并与pYCJ兼容。这些质粒作为有价值的工具,用于进一步的研究应在haloarchaea virus-virus和病毒-宿主相互作用。

向量发达pYCJ相比,本研究显示许多优点。首先,他们可以稳定复制和隔离到子细胞即使在非选择性生长条件。相比之下,pYCJ报道消失从长江的细胞三天后没有抗生素选择21]。这个属性是特别重要的,因为只有几个标记可用于古生菌。第二,分子量的向量构造都6 kb,这是小得多的比大多数的热点航天飞机向量之前报道(37),包括pYCJ(约9.9 kb)。因此,这些飞船向量应该能够容纳更大的外源片段和遗传操作会更加方便。最后,鉴于其兼容SNJ1 (pHH205)和pYCJ,航天飞机向量构造在这项研究中,特别是pFJ6可以用于研究监管机构位于SNJ1复制子。这将是通过表达SNJ1只有片段或突变区域的复制子。这种分子操纵使用pYCJ无法实现,因为任何突变1 - 4481地区的SNJ1会损害pYCJ[的稳定性21]。此外,向量构造在本研究将提供一个有用的工具为研究几个J7细胞生物过程。这些包括重复感染排斥和裂解/ SNJ1病毒的溶原性转换,其主要决定因素是位于SNJ1 1 - 4481地区(未发表的数据)。

除了病毒研究,这里开发的向量可能有助于调查J7染色体复制和隔离。古细菌oriCs通常由一个长基因间序列包括a / T-rich duplex-unwinding元素。他们通常位于上游的cdc 6/orc1基因编码一个假定的发起者蛋白质同源Orc1真核的兽人复杂或解旋酶装载机cdc 6 (38,39]。十二oriCs J7染色体中预测使用Ori-Finder 2软件;他们中的大多数是相邻的一个假定的cdc 6基因。航天飞机的六个向量包含一个或两个J7-F oriCs能独立复制的细胞,这表明至少六12预测oriCs启动DNA复制的能力。这并不奇怪,因为大多数古生菌包含多个复制起源(38]。然而,值得注意的是,这六个区域的核苷酸序列之间的同源性和复制起始蛋白质的氨基酸序列低。它将感兴趣的测试需要在这些航天飞机向量oriC复制和相邻cdc 6基因也是必不可少的。pFJ6预测oriC10不包含一个假定的cdc 6基因,但它可以复制,这表明一些的疾病预防控制中心基因可能是负责在多个复制起始的起源。此外,航天飞机的三个向量是维持在一个副本每个染色体没有选择,表明他们的复制是协调与染色体和他们忠实地隔离到子细胞。调查等分子机制协调会特别有趣,因为复制起始的控制和协调多个起源于古菌知之甚少。这些向量是优秀的工具在古生菌为研究这一重要问题。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(没有。31570174),国家培养人才的基本科学基金(J1103513)和研究武汉大学实验室基金(创新)。作者感谢失身之后杜博士(美国堪萨斯大学医学中心)对许多有用的讨论和修改的手稿。

引用

1. r·s·古普塔诺萨德,和美国贝克Phylogenomic分析和分子特征的类Halobacteria和它的两个主要演化支:类Halobacteria建议分为一个校正顺序Halobacteriales和两个新订单,Haloferacales ord。11月和11月Natrialbales ord。这部小说包含家庭Haloferacaceae家人。11月,Natrialbaceae家人。11月,“国际系统与进化微生物学杂志》上,卷65,不。3、1050 - 1069年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. c·r·伍斯o . Kandler, m . l . Wheelis”对生物体的自然系统:建议域古生菌,细菌和真核生物,“美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷87,不。12日,第4579 - 4576页,1990年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. w·l·林和w·f·杜利特尔,”航天飞机archaebacterium向量Halobacterium volcanii”,美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷86,不。14日,第5482 - 5478页,1989年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. m·霍姆斯、f . Pfeifer和m . Dyall-Smith“改进航天飞机向量Haloferax volcanii包括dual-resistance质粒。”基因,卷146,不。1,第121 - 117页,1994。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. Blaseio和f具有“转变Halobacterium halobium:向量和调查的气体泡合成的发展,“美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷87,不。17日,第6776 - 6772页,1990年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. s . w . Cline和w·f·杜利特尔”,与航天飞机成员属Haloarcula向量的变换基于Halobacterium halobium和Haloferax volcanii质粒经由,”细菌学期刊,卷174,不。3、1076 - 1080年,1992页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. m·p·克雷布斯t . haus m·p·海因美国l . RajBhandary和h . g . Khorana”bacterioopsin基因的表达在Halobacterium halobium使用multicopy质粒,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷88,不。3、859 - 863年,1991页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 和p . f . Pfeifer Ghahraman”,质粒pHH1 Halobacterium salinarium:复制子区域的特性,气体泡基因簇和插入元素,”“万人迷”女友分子和遗传学,卷238,不。1 - 2、193 - 200年,1993页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. w l。Ng和美国DasSarma最小复制原点200 -千碱基Halobacterium质粒pNRC100,”细菌学期刊,卷175,不。15日,第4596 - 4584页,1993年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. m·l·霍姆斯和m . l . Dyall-Smith“质粒为嗜盐古细菌类向量和一个可选的标记,“细菌学期刊,卷172,不。2、756 - 761年,1990页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. r . l . Charlebois w·l·兰姆,s . w . Cline和w·f·杜利特尔,”表征的pHV2 Halobacterium volcanii archaebacterium及其在展示转换使用,“美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷84,不。23日,第8534 - 8530页,1987年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. t·阿勒斯H.-P。非政府组织、m . Mevarech和r·g·劳埃德“嗜盐archaeon开发额外的可选的标记Haloferax volcanii基于leuB和trpA基因。”应用与环境微生物学,卷70,不。2、943 - 953年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. c . Norais m·霍金斯a·l·哈特曼j·a·艾森h . Myllykallio t·阿勒斯,“基因和DNA复制的物理映射起源于Haloferax volcanii,”公共科学图书馆遗传学,3卷,不。5,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. b . r . Berquis和s . DasSarma“古细菌染色体自主复制序列元素从一个极端的喜盐生物,Halobacterium NRC-1 sp.压力,”细菌学期刊,卷185,不。20日,第5966 - 5959页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. m·l·霍姆斯和m . l . Dyall-Smith”DNA促旋酶的突变导致嗜盐古细菌类、新生霉素抵抗”细菌学期刊,卷173,不。2、642 - 648年,1991页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. w·l·林和w·f·杜利特尔,”Mevinolin-resistant识别启动子和基因突变eukaryote-like 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme还原酶在archaebacterium Haloferax volcanii,”生物化学杂志,卷267,不。9日,第5834 - 5829页,1992年。视图:谷歌学术搜索
17. r·f·派克、美国DasSarma和m·p·克雷布斯“同源基因敲除archaeon Halobacterium salinarum与ura3 counterselectable标记,”分子微生物学,35卷,不。3、667 - 676年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. g . Bitan-Banin r . Ortenberg, m . Mevarech”发展的基因敲除系统嗜盐的archaeon Haloferax volcanii利用火葬用的基因,”细菌学期刊,卷185,不。3、772 - 778年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. t . j . McGenity r t。基梅尔和w·d·格兰特,”提议新的halobacterial属Natrinema创。11月,有两个物种Natrinema pellirubrumnom. 11月和Natrinema螺旋体nom. 11月。”国际期刊的细菌学,48卷,不。4、1187 - 1196年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. j . Lv王,y, y黄和陈x,“隔离和营养缺陷型的突变体的分子识别开发基因操纵系统haloarchaeon natrinema sp, J7-2”古生菌文章ID 483194卷,2015年,16页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. l . y . Wang硅镁层,j . Lv et al .,”标识、描述和应用程序的复制子地区嗜盐的温带sphaerolipovirus SNJ1,”细菌学期刊,卷198,不。14日,第1964 - 1952页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. j .冯b . Liu z . Zhang et al .,”的完整基因组序列natrinema sp, J7-2 haloarchaeon能力增长合成媒体没有氨基酸补充剂,”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。7篇文章ID e41621 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. 杜x, z徐t . Li f . Gan b . Tang和x。唐、“功能性洞察的c端延伸halolysin SptA haloarchaeonNatrinemasp, J7。”《公共科学图书馆•综合》》第六卷,没有。8篇文章ID e23562 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. w·史,x。黄,y, f·甘,b . Tang和p .沈,“一个细胞外嗜盐的蛋白酶SptA从嗜盐的archaeonNatrinemasp。J7:基因克隆、表达和描述,”极端微生物,10卷,不。6,599 - 606年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. x y, m . Wang Du et al .,“甲壳素加速活化小说haloarchaeal丝氨酸蛋白酶,脱朊chitin-containing生物量、”应用与环境微生物学,卷80,不。18日,第5708 - 5698页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. h·张,p .崔l .林沈p, b . Tang和Y.-P。黄”,hsp70基因的转录分析haloarchaeon Natrinema sp。J7冷热压力下,“极端微生物,13卷,不。4、669 - 678年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. g . w . Chen Yang y他et al .,“核苷酸侧翼起始密码子hsp70mrna用短5 ' haloarchaea -UTRs极大地影响基因表达”,《公共科学图书馆•综合》,10卷,不。9篇文章ID e0138473 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. z, y, s . Wang et al .,“温带membrane-containing嗜盐古细菌病毒SNJ1圆形dsDNA基因组与质粒pHH205,”病毒学,卷434,不。2、233 - 241年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. y y梅,c .他黄et al .,“盐度调控的互动halovirus SNJ1 halovirus复制策略的主机和改变生态系统适应变量,“《公共科学图书馆•综合》,10卷,不。4篇文章ID e0123874 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. y y . Liu j . Wang刘et al .,“识别和表征SNJ2,第一个温带pleolipovirus融入的基因组SNJ1-lysogenic古细菌菌株,”分子微生物学,卷98,不。6,1002 - 1020年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. m . Dyall-SmithHalohandbook:用于Haloarchaeal遗传学的协议Austrulia墨尔本,Haloarchaeal遗传学实验室,2008年。
32. h·罗C.-T。张,f·高,“Ori-Finder 2,一个集成的工具来预测古细菌基因组复制起源,”微生物学前沿,5卷,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. c·e·格兰特,t·l·贝利和w·s .高贵,“FIMO:扫描出现的一个给定的主题,“生物信息学,27卷,不。7,1017 - 1018年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. p .沈和y陈”,质粒从Halobacterium halobium及其限制地图,”易保川雪,21卷,不。5,409 - 416年,1993页。视图:谷歌学术搜索
35. 吴z h . Liu j . Liu x Liu和h,“多样性和进化haloarchaea多个兽人/ cdc6-adjacent复制起源的“BMC基因组学,13卷,不。1,货号。478年,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. h . Atomi t Imanaka, t·福井”概述古生菌的遗传工具”,微生物学前沿,3卷,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. j·法卡斯,j .挑选和t . Santangelo“古生菌的基因技术,”年度回顾的遗传学47卷,第539条,2013年。视图:谷歌学术搜索
38. z, j·刘,h·杨和h .香“古生菌DNA复制的起源,”微生物学前沿卷,5篇文章。179年,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. s . a . n . h . Wang Peng Shah l .黄问:她,“古细菌染色体外遗传因素,”微生物学和分子生物学的评论,卷79,不。1,第152 - 117页,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2017尝试王等。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。