古生菌 古生菌 1472 - 3654 1472 - 3646 Hindawi 10.1155 / 2017/4237079 4237079 研究文章 建筑表达航天飞机Haloarchaeon向量 Natrinemasp。J7基于其染色体起源的复制 王 将尝试 1 程ydF4y2Ba 贝贝 1 硅镁层 Linshan 1 曹 Mengzhuo 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 3475 - 3436 程ydF4y2Ba 王向东 1 2 福井 Toshiaki 1 病毒学国家重点实验室 生命科学学院 武汉大学 武汉430072 中国 whu.edu.cn 2 湖北省工业发酵的协同创新中心 武汉430072 中国 2017年 1 3 2017年 2017年 20. 08年 2016年 28 11 2016年 26 12 2016年 1 3 2017年 2017年 版权©2017王将尝试et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Haloarchaeon Natrinema第一个报道,sp。J7 archaeon窝藏质粒和chromosome-based温带病毒,是一种有用的模型为研究古细菌病毒-宿主和virus-virus交互。然而,缺乏遗传工具这样的研究有限。的基础上自动复制J7染色体和序列 pyrF标记,我们七个向量,构造六被证实具有复制能力 pyrF -删除的导数J7 (J7-F)。其中向量,pFJ1、pFJ4 pFJ6可以转化为宿主菌株效率相对较高(约103菌落/ μg DNA),出席每一个副本染色体。这三个向量可以稳定维持在J7-F没有选择和被用于外源蛋白表达。只有pFJ6被发现出现在转化细胞在一个完全游离,非整合状态(每个染色体一份)。相比之下,一些pFJ1和pFJ4 DNA可能是集成到J7-F染色体。此外,pFJ6被发现在J7兼容pYCJ细胞,这表明这两个向量可以用于virus-virus和病毒-宿主相互作用的进一步研究。

 中国国家自然科学基金 31570174 国家培养人才的基本科学基金 J1103513 武汉大学 1。介绍

极端嗜盐古生菌构成的一组微生物生长在高盐环境中,包括太阳能盐场和天然盐湖。这组由大约48属177种( 1),形成古生菌的一个重要组成部分 2]。与其他组古生菌相比,这些haloarchaea尤其适用于研究目的,因为他们很容易在实验室培养和操纵。他们也可以作为有用的模型为研究古细菌病毒,而表现出显著的形态多样性和独特基因的内容。然而,这些haloarchaea及其病毒的研究受到适当的遗传工具的可用性。haloarchaea 48属中,只有三个属的遗传工具已经开发出来,也就是说, Haloferax( 3, 4), Halobacterium( 5),而 Haloarcula( 6]。考虑到没有一个热点是代表域作为一个整体,甚至自己的特定群体,这将是重要的遗传工具开发的许多haloarchaea仍然缺乏这些资源。

大多数haloarchaeal航天飞机向量源于内生质粒,如pGRB1 [ 7],pHH1 [ 8],pNRC100 [ 9从 Halobacterium salinarum或pHK2 [ 4, 10],pHV2 [ 11, 12],pHV1/4 [ 13从 Haloferax volcanii。一些飞船向量的复制功能源于噬菌体元素或染色体复制起源(oriCs),如pUBP1和pUBP2。这些都是构建基于ΦH复制子( 5)和pBBori7,使用oriC / orc7创建 Halobacteriumsp。NRC-1 [ 14]。大多数haloarchaea建立遗传工具可以使用聚乙二醇(PEG)的转换。然而,只有少数选择标记可用于haloarchaea。新生霉素抑制DNA促旋酶( gyrB)[ 15),和mevinolin抑制β-还原酶( 16古生菌)是两种广泛使用的抗生素。营养缺陷型的选择标记参与氨基酸或核苷酸生物合成也被使用。其中包括 ura3和 pyrE2在尿嘧啶生物合成有关的基因( 17, 18), trpA在色氨酸生物合成基因, leuB基因参与白氨酸生物合成, hdrB基因用于胸苷生物合成( 12]。在这些标记, ura3和 pyrE2基因敲除或更换研究尤其有用,因为他们可以使用5-fluoroorotic counterselected酸( 18]。

的halobacterial属 Natrinema11月,将军McGenity等人提出的基于的系统发育分析16 s rRNA物种基因序列和分类属性的成员。菌株在这个属需要至少10%的盐浓度,以便基本细胞生长和最优增长19.8%到25.1% ( 19]。七个物种被发现到目前为止在本属。其中之一是 Natrinemasp。J7被隔离在一个营盐矿在湖北省,中国。这是唯一毒株的基因操纵工具成立( 20., 21和基因组序列测序完成的 22]。J7衍生品的研究集中在蛋白酶SptA [ 23, 24和技术学院 25),热休克蛋白70 ( 26, 27),DNA片段赋予启动子活动三个领域的生活。J7-1,值得注意的是,它的一个衍生品是第一个港口archaeon报道两种温带haloarchaeal病毒:sphaerolipovirus SNJ1 [ 28, 29日)和pleolipovirus SNJ2 [ 30.]。因此,J7-1可以作为一个优秀的模型为研究病毒-宿主和virus-virus古生菌的相互作用。然而,遗传工具的缺乏阻碍了这些研究。

以前,基于孤立的营养缺陷型的整合质粒突变体J7衍生品被建造,用来表达外源蛋白在J7 [ 20.]。最近,一位穿梭载体(pYCJ)基于SNJ1复制子(核苷酸1 - 4481)也是构建和验证外源蛋白的表达和纯化 21]。子和基因元素控制病毒基因组复制、维护和拷贝数确定在SNJ1复制子。此外,负责重复感染的关键元素排斥和裂解/溶原性转换SNJ1病毒也位于这个区域(未发表的数据)。因为任何突变SNJ1质粒的复制子会损害自我复制能力,pYCJ向量不适合调查这些监管机构和元素。因此,必须开发额外的基因工具使研究这些病毒和宿主。在这项研究中,七个航天飞机向量来自于预测oriCs J7染色体的构建。每一个向量包含了 pyrF基因和自主复制序列(ARS,一个或两个预测oriCs)。6这些向量(pFJ1、pFJ3 pFJ4, pFJ5, pFJ6,和pFJ7)成功转化为J7-F,但只有pFJ1, pFJ4, pFJ6可以转换效率相对较高(103菌落(cfu) / μg DNA)。这三个航天飞机向量被进一步研究,发现稳定维持在大约每染色体在一份J7-F没有选择。pFJ1和pFJ4可能存在质粒形式或整合到宿主染色体,而pFJ6复制只有在非整合状态,兼容pYCJ J7细胞。所有三个向量都验证J7-F淀粉酶的稳定表达蛋白的细胞,使它们仪器为进一步研究SNJ1病毒,以及J7衍生品。

 2。材料和方法 2.1。菌株,媒体,和增长的条件

表列出菌株用于这项研究 1。不同的衍生品 Natrinemasp。J7生长在《光晕2》中在45°C,如前所述[ 28, 30.]。J7-F菌株缺乏染色体 pyrF基因的礼物对黄教授(武汉大学生命科学学院)。基本培养基(MM;18%),修改后的生长培养基(米高梅;18%)准备按照Halohandbook [ 31日]。 大肠杆菌菌株DH5 α和JM110用于质粒DNA在Luria-Bertani培养基培养建设,经常在37°C。琼脂(1.5%)时添加固体模拟上述媒体的需要。

菌株和质粒用于这项研究。

应变 描述 源
Natrinemasp。J7-1 与SNJ1前病毒的基因组pHH205,不能被SNJ1感染 ( 28, 34]
Natrinemasp。J7-F Δ pyrF可以被SNJ1感染 是的,武汉大学,武汉,中国
大肠杆菌DH5 α 表44Δ 湖169 ( φ 80年 虫胶ZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi1 relA1 CCTCC
大肠杆菌JM110 大坝dcm挂表44 hsdR17 这低浓缩铀rpsL花边galK高尔特ara tonA刺tsxΔ( 虫胶- - - - - - 箴AB) F′( 交易D36 箴AB+ l 一个 c 我 问 虫胶ZΔM15) CCTCC
质粒
pNBK-F AmpR MevR,用于克隆 P 都不会 - - - - - - pyrF电阻片段 是的,武汉大学,武汉,中国
pUC-M pUC19与 系统网络体系结构(Sna)BI, Mfe我, 年龄我之间插入 Bam你好, Xbal 我们的实验室
pUC-M-pyrF pUC-M插入0.95 kb Bam你好, 系统网络体系结构(Sna)BI P 都不会 - - - - - - pyrF电阻片段 本研究
pFJ1 pUC-M-pyrF的插入2.8 kb 系统网络体系结构(Sna)BI - Mfe我预测染色体ARS-1 本研究
pFJ2 pUC-M-pyrF的插入3.3 kb 系统网络体系结构(Sna)BI - Mfe我预测染色体ARS-2 本研究
pFJ3 pUC-M-pyrF的插入3.2 kb 系统网络体系结构(Sna)BI - Mfe我预测染色体r ARS-3 本研究
pFJ4 pUC-M-pyrF的插入2.2 kb 系统网络体系结构(Sna)BI - Mfe我预测染色体ARS-4 本研究
pFJ5 pUC-M-pyrF的插入2.3 kb 系统网络体系结构(Sna)BI - Mfe我预测染色体ARS-5 本研究
pFJ6 pUC-M-pyrF的插入2.0 kb 系统网络体系结构(Sna)BI - Mfe我预测染色体ARS-6 本研究
pFJ7 pUC-M-pyrF的插入1.1 kb 系统网络体系结构(Sna)BI - Mfe我预测染色体ARS-7 本研究
pFJ1-Apro-amyH pFJ1插入1.5 kb Mfe我- - - - - - Sph我Apro-amyH片段包含 Afl二世, Spe我, 不我, 新人道我和 Nsi我 本研究
pFJ1-M pFJ1-Apro-amyH消化和 不我然后结扎本身 本研究
pFJ4-Apro-amyH pFJ4插入1.5 kb Mfe我- - - - - - Sph我Apro-amyH片段包含 Afl二世, Spe我, 不我, 新人道我和 Nsi我 本研究
pFJ4-M pFJ4-Apro-amyH消化和 不我然后结扎本身 本研究
pFJ6-Apro-amyH pFJ6插入1.5 kb Mfe我- - - - - - Sph我Apro-amyH片段包含 Afl二世, Spe我, 不我, 新人道我和 Nsi我 本研究
pFJ6-M pFJ6-Apro-amyH消化和 不我然后结扎本身 本研究
pFJ1-M-pro3916 200 - bp pFJ1-M的插入 Nsi我- - - - - - Sph我pro3916 本研究
pFJ4-M-pro3916 200 - bp pFJ4-M的插入 Nsi我- - - - - - Sph我pro3916 本研究
pFJ6-M-pro3916 200 - bp pFJ6-M的插入 Nsi我- - - - - - Sph我pro3916 本研究
2.2。预测oriCs J7染色体

基于web的工具Ori-Finder 2是用来预测oriCs古细菌基因组( 32]。OriCs预测基于一个集成的碱基组成不对称使用z曲线的方法,分析原产地分布识别框(orb)确定使用找到个人主题发生( 33,基因的发生经常接近oriCs。

 2.3。质粒构建

质粒和引物用于这项研究在表中列出 1和 2,分别。0.95 kb Bam你好, 系统网络体系结构(Sna)BI片段组成的 pyrF基因和启动子区域的200个基点 都不会基因(P 都不会) Haloferax volcaniiDS2从pNBK-F克隆质粒进入 Bam你好, 系统网络体系结构(Sna)BI pUC-M向量生成pUC-M-pyrF的网站。

引物用于这项研究。

引物 5′3′序列 限制的网站
P 都不会 -pyrF-F AATGGATCCATCTCGGCTTATTCTTTTGATT Bam嗨
P 都不会 -pyrF-R TAATACGTATTATTCTCGATACTGATTGAGTCGCTTC 系统网络体系结构(Sna)BI
PARS-1-fwd AATTACGTACGCCCCCGGTGCCTCCTCTCGGA 系统网络体系结构(Sna)BI
PARS-1-rev ATTCAATTGACTCGCCGCCGACTACCTCCCCGTCG Mfe我
PARS-2-fwd AATTACGTATAGCCCGGGAAATACTATCTTTGAGTTCT 系统网络体系结构(Sna)BI
PARS-2-rev ATTCAATTGGATCGACGCTGGGATATGAAAAGC Mfe我
PARS-3-fwd AATTACGTAAACGGCTTTCGGATCGAAAGCAGC 系统网络体系结构(Sna)BI
PARS-3-rwd ATTCAATTGTTCGGTCTGCGGTCCCCATTTCC Mfe我
PARS-4-fwd AATTACGTAGACACACACCACTGTTGCAAGTGAAG 系统网络体系结构(Sna)BI
PARS-4-rev ATTCAATTGGTGGCCGCACAAGATCGA Mfe我
PARS-5-fwd AATTACGTACGATCGTGCCGACGTTACCCGGT 系统网络体系结构(Sna)BI
PARS-5-rev ATTCAATTGCGATCCCGAAGACGACCGCGT Mfe我
PARS-6-fwd AATTACGTAGGAGACGGTCAGAGTTACTGGTCAGT 系统网络体系结构(Sna)BI
PARS-6-rev TAACAATTGCAAGGGTTCGTCTGAAACCGTGT Mfe我
PARS-7-fwd ATATACGTAAGGCTGACTGTATGCGAGT 系统网络体系结构(Sna)BI
PARS-7-rev ATACAATTGGCACGACAGTAACAGT Mfe我
3916 pro (R) - f AATATGCATGAGTAAAGTTCGTGTTTCCTTGATTA Nsi我
3916 pro - R (R) ATAGCATGCCGGACAAGACGCCCATTTG 系统网络体系结构(Sna)BI
Apro-AmyH-M-F AATCAATTGCTTAAGACTAGTGCGGCCGCGGGAGCCGGAAACGCGGTAGAGATA Mfe我, 年龄我, Spe我, 不我
Apro-AmyH-M-R AAGCATGCTATGCATAGCTAGCGCGGCCGCAAGGTAGTGGAAAGCGAGCCAGCGC 不我, Nsi我, 濒死经历我, Sph我
pyrF test-F CGATCACCGTCAACCCCTACATGG /
pyrF test-R TACTGATTGAGTCGCTTCTTCAGTCGTTT /
MevR test-F TCGCCTCCCTCGAAGTCGGCACCGT /
MevR test-R GAACAACGGCGAAGAAAAGGCAGTCCA /

七个 系统网络体系结构(Sna)BI - Mfe我领悟了ars包含一个或两个预测oriCs放大从J7基因组被绑定到消化pUC-M-pyrF质粒创建pFJ1 pFJ2, pFJ3, pFJ4, pFJ5 pFJ6, pFJ7。12的特定位置预测oriCs和七个ars如表所示 3。1.7 kb片段包含 amyH200个基点及其启动子(Apro-amyH)放大 Haloarcula hispanicaDSM4426。限制性内切酶序列 Mfe我, Afl二世, Spe我和 不我添加了5′末端片段 不我, 新人道我, Nsi我和 Sph我的网站被添加到3′末端。的 MfeI-Apro-amyH - Sph我分段结扎成pFJ1、pFJ4 pFJ6生成pFJ1-A, pFJ4-A和pFJ6-A分别。消化后 不我随后self-ligation Apro-amyH片段被从每个向量构造pFJ1-M, pFJ4-M, pFJ6-M。的物理地图pFJ1-M pFJ4-M, pFJ6-M图所示 1。200个基点片段包含上游地区的3916个基因(3916 pro)位于J7染色体被放大和结扎成pFJ1-M, pFJ4-M,和pFJ6-M生成质粒pfj1 - m - 3916, pfj4 - m - 3916和pfj6 - m - 3916,分别用于质粒拷贝数的决心。

特点,预测oriCs和复制区域用于穿梭载体建设。

的特征预测oriCs

OriCs 位置 许多ORB元素 GC含量(%) 毗邻 cdc 6基因
1 120445 - 121114 2 51.27% Y
2 122480 - 123045 1 60.30% Y
3 399506 - 400667 3 56.44% NgydF4y2Ba
4 434294 - 435598 8 54.87% Y
5 1277983 - 1279633 5 59.37% Y
6 1280840 - 1281049 1 66.67% Y
7 2211660 - 2211903 2 60.51% Y
8 2213131 - 2213664 2 62.89% Y
9 2573530 - 2574443 1 55.78% Y
10 2860326 - 2861584 7 52.74% NgydF4y2Ba
11 3151118 - 3151637 3 60.17% Y
12 3153862 - 3154084 1 68.61% Y

航天飞机向量的特征和复制的能力

航天飞机向量 农业研究所 OriCs包含 染色体的位置ars(职位) 包含 cdc 6基因 转化效率 一个
pFJ1 1 1、2 120345 - 123145 Y ( 1。7 ± 0.6 )×103
pFJ2 2 4 434194 - 437483 Y 0
pFJ3 3 5、6 1277883 - 1281049 Y (3.9±0.4)×101
pFJ4 4 7、8 2211560 - 2213764 Y (2.1±0.1)×103
pFJ5 5 9 2572200 - 2574543 Y < 10
pFJ6 6 10 2860000 - 2862000 NgydF4y2Ba (2.2±0.5)×103
pFJ7 7 3 399506 - 400667 NgydF4y2Ba < 10

C o l o n y 一个 得很深单位/ μg DNA。

的物理地图pFJ1-M (a), pFJ4-M (b),和pFJ6-M (c)质粒。

 2.4。转换方法

J7-F细胞遗传转化进行了在室温下使用挂钩,如前所述[ 21]。毫米(18%)制备了用于选择和传播 Natrinemasp。J7-F转化株。

 2.5。航天飞机的稳定性和维护向量

评估向量的结构稳定性,我们孤立pFJ1 pFJ4,和pFJ6 J7-F转化株,back-transformed成 大肠杆菌放大,提取质粒,并对其进行了限制性内切酶消化。质粒DNA提取 大肠杆菌(没有变成J7-F细胞),消化,作为一个积极的控制。

维护pFJ1、pFJ4 pFJ6航天飞机向量是评估通过计算每一个质粒的速度失去了每一代在非选择性生长,如前所述[ 21]。简单地说,克隆被培养来指数期大约五天在5毫升18%毫米45°C。文化被稀释1:100年5毫升新鲜的《光晕2》中、孵化24 h。这个稀释过程重复12次(J7细胞的倍增时间~ 2.9小时)。每两个稀释,文化被传播到18%米高梅板块(J7-F细胞的非选择性条件)。50个随机克隆选择和受移植者在米高梅18%或18%毫米板。克隆的数量,对这两种类型的盘子。生存18%毫米板表示向量的维护。

 2.6。印迹分析

印迹分析确定航天飞机向量(pFJ1、pFJ4 pFJ6)集成到J7-F染色体并测量他们的数字拷贝。J7-F细胞转化pFJ1、pFJ4或pFJ6被种植在200毫升18%毫米和收获指数的阶段。他们的基因组DNA是孤立如前所述[ 34),在唯一的消化 欣dIII网站在航天飞机向量,由1% (w / v)琼脂糖凝胶电泳。在碱性溶液中变性(1 M氯化钠,0.5 M氢氧化钠),DNA样本被转移到一个带正电的尼龙膜。随后,DNA被孵化固定在80°C 2 h和探索使用 pyrF片段贴上digoxigenin——(挖)dUTP随机引物,根据指令的DIG-High ' DNA标记和检测Starter Kit(罗氏)。确定质粒拷贝数,200年英国石油公司上游J7 3916基因的片段,每个染色体,出席一个副本被放大和结扎成pFJ1, pFJ4, pFJ6。然后,总DNA隔绝J7-F / pfj1 - 3916 pro, J7-F / pfj4 - 3916 pro, J7-F / pfj6 - 3916 pro是消化 分3 ai进行印迹分析如上所述,使用DIG-labeled 3916 pro作为探针序列。

 2.7。淀粉酶活性测定

特定的淀粉酶活性的上层清液从长江/ pYCJ-Apro-amyH CJ7-F / pFJ1-Apro-amyH CJ7-F / pFJ4-Apro-amyH, CJ7-F / pFJ6-Apro-amyH测量如前所述[ 21]。淀粉酶活动的一个单位被定义为所需数量的淀粉酶水解淀粉的1毫克1 h。

 3所示。结果 3.1。分析和克隆复制区域的J7染色体

建造航天飞机向量J7衍生品,oriCs J7染色体的预测使用基于web的Ori-Finder 2工具。如表所示 3(一)12 oriCs预测J7染色体;他们中的大多数有一个相对较低的GC含量比J7染色体(64%)和它们包含的球体。除了oriC3和oriC10,另oriCs都毗邻 cdc 6基因,编码replication-initiating蛋白质。然而,一些oriC对的位置,如oriC1 oriC2, oriC5 oriC6, oriC7 oriC8,以及oriC11 oriC12,非常接近和毗邻一样 cdc 6基因(表 3(a))。五个假定ars包含一个或两个oriCs及其附近 cdc 6基因(表而被放大 3(b))。这些被绑定到pUC-M-pyrF构造pFJ1, pFJ2, pFJ3, pFJ4, pFJ5航天飞机向量。此外,oriC12 oriC3,没有毗邻 cdc 6基因,也放大,用来构造pFJ6 pFJ7,分别。如表所示 3(b),所有成功转化为向量除了pFJ2 J7-F细胞。转换效率pFJ1、pFJ4 pFJ6大约是103cfu / μg DNA,略低于SNJ1 replicon-based向量,pYCJ [ 21]。只有少数转化株获得改造后与pFJ3 JF-7细胞,pFJ5, pFJ7。这些结果表明,至少有六个地区J7染色体具有复制能力,这是符合的存在多个复制的染色体起源最haloarchaeal菌株( 35]。

 3.2。维护和结构稳定性J7-F oriC-Based向量的细胞

评估所有航天飞机向量的结构稳定性(pFJ1、pFJ3 pFJ4, pFJ5, pFJ6,和pFJ7)和验证其能够独立复制J7-F细胞,从每个向量转化株和back-transformed提取的质粒DNA 大肠杆菌(posttransformed质粒)、分离和酶消化。航天飞机向量提取 大肠杆菌(pretransformed成J7-F细胞)作为积极的控制。如图 2pretransformed(通道2)和posttransformed(车道4)质粒消化资料显示相似,表明结构稳定性的结构是保持J7-F细胞,这六个向量独立复制的染色体。如上所述,pFJ3、pFJ5 pFJ7可成功转化为J7-F细胞,但他们的转换效率太低是适合J7细胞的基因操作。因此,这三个向量被排除在进一步的研究。

航天飞机的结构稳定性向量J7-F细胞。Pretransformed质粒(提取 大肠杆菌然后再转化成J7-F,通道1和2)和back-transformed质粒(提取 大肠杆菌后转型为J7-F车道3和4)与限制性内切酶消化,比较它们的结构稳定性。米,2 kb + 2标记;通道1和3,未消化的质粒;道2和4,质粒消化 系统网络体系结构(Sna)BI和 Mfe我。

维护pFJ1、pFJ4 pFJ6决心通过计算生存频率在18%毫米非选择性增长。如图 3,所有向量可以稳定维持在J7-F细胞培养后12天(~ 100代),表明他们可以稳定隔离到子细胞在细胞生长。

维护pFJ1、pFJ4 pFJ6航天飞机向量J7-F细胞。J7-F细胞包含不同飞船向量(50 μL)被稀释在5毫升《光晕2》中、增长了24小时。每两个稀释(总共12稀释)整除传播到《光晕2》板块,50个随机选择殖民地和非选择性上发现18%米高梅盘子。维护测量通过计算菌落生长的选择性18%毫米板。

 3.3。存在pFJ6转化细胞游离,非整合状态

南方污点分析来确定pFJ1 pFJ4, pFJ6集成到J7-F染色体。总DNA提取三个独立J7-F每个质粒的转化株消化了 欣dIII,由1% (w / v)琼脂糖凝胶电泳(图 4(一)),然后进行印迹分析。质粒提取 大肠杆菌被用作控制和DIG-labeled吗 pyrF基因是用作探针。只有一个 欣dIII限制站点在pFJ1被发现,pFJ4, pFJ6质粒。因此,消化非整合质粒从总DNA样本预测线性化5.86 kb, 5.66 kb,和5.35 kb,分别区分他们从整合质粒。如图 4 (b)在每个位置上都可以看到,杂交信号的线性化质粒DNA,在 欣dIII-digested提取DNA样本 大肠杆菌(通道1、5、9)或在 欣dIII-digested J7-F总准备从文化中提取DNA克隆携带pFJ1(通道2 - 4),pFJ4(道6 - 8),和pFJ6(车道10 - 12)。然而,相比单杂交信号获得使用总DNA提取pFJ6-transformed J7-F细胞(车道10 - 12),调查也相对较大片段的杂化从pFJ1提取的总DNA样本,pFJ4-transformed J7-F细胞(通道2 - 4和6 - 8,resp)。这些数据表明,只存在于一个游离pFJ6 J7细胞非整合状态,而pFJ1和pFJ4可能融入CJ7-F染色体。需要额外的实验来证实这些结果。

确定是否pFJ1, pFJ4, pFJ6可以融入J7染色体通过印迹分析。 欣dIII-digested总DNA提取文化带着pFJ1 J7-F克隆(通道2 - 4),pFJ4(道6 - 8),或pFJ6(车道10 - 12)质粒(a) 1%琼脂糖凝胶上分离在20 V > 12 h,然后(b)进行印迹分析。pFJ4, pFJ1 pFJ6质粒和传播 大肠杆菌,消化 欣dIII,加载通道1、5、9的控制。的DIG-labeled pyrF被用作杂交探针序列。

 3.4。相对数量的副本pFJ1、pFJ4 pFJ6 J7-F细胞

航天飞机向量包含染色体oriCs通常出现在每一个副本染色体( 36]。我们测试这个是否适用于pFJ1, pFJ4, pFJ6。200 bp单副本3916 pro段被放大和结扎成航天飞机向量用于这项研究。总DNA随机选择从三个独立J7-F包含pfj1 - m - 3916的转化株,pfj4 - m - 3916和pfj6 - m - 3916,分别是消化 分3 ai, 1%琼脂糖凝胶电泳分离,并受使用DIG-labeled 3916 pro印迹分析调查。686个基点片段包含3916 pro J7染色体消化后的解放 分3人工智能,而1119个基点、978个基点和1266个基点片段包含3916 pro产生pfj1 - m - 3916, pfj4 - m - 3916, pfj6 - m - 3916(图 5(一个))。如图 5 (b)DIG-labeled 3916 pro的686个基点的片段序列杂交J7染色体和相应的片段的质粒。杂交信号的强度产生pFJ6 - m - 3916和染色体DNA片段几乎是相同的,表明pFJ6出席大约每一个副本在J7-F细胞染色体。相比之下,杂交信号的强度由pfj1 - m - 3916和pfj4 - m - 3916略强于相应染色体的DNA片段,这意味着pfj1 - m - 3916和pfj4 - m - 3916每个染色体出席多个副本。这些结果可能归因于这一事实的一部分pFJ1 pFJ4可以融入J7染色体;然而,需要额外的实验来证实。

相对副本数量的pFJ1、pFJ4和pFJ6 J7-F质粒的细胞。(一)J7染色体,表示向量的原理图。的具体位置 分3人工智能网站J7染色体和质粒。3916 pro段200个基点,这是用作DIG-labeled探针,用箭头指示和星号。(b) pFJ1-pro3916的拷贝数,pFJ4-pro3916, pFJ6-pro3916印迹测定分析。 分3 ai-digested总DNA与pFJ1 J7-F细胞转化(通道2 - 4),pFJ4(道6 - 8),或pFJ6(车道10 - 12)杂化DIG-labeled 3916 pro序列。总DNA样本J7-F细胞(lane 0), pFJ1-pro3916(巷1),pFJ4-pro3916(巷5),和pFJ6-pro3916(巷9)质粒在传播 大肠杆菌被用作控制。

 3.5。航天飞机的效用向量pFJ1, pFJ4, pFJ6

确定这些航天飞机的效用向量, Haloarcula hispanicaDSM 4426 艾米H基因及其启动子插入pFJ1 pFJ4, pFJ6。改造后长江细胞与各自的质粒(pFJ1-A、pFJ4-A pFJ6-A),三个随机选择的殖民地/质粒转移到18%米高梅盘子补充2% (w / v)的可溶性淀粉。如图 6(一)、透明晕周围发现了殖民地与碘溶液向盘子后,表明淀粉酶表示。相比之下,殖民地J7-F细胞窝藏只有pFJ1 pFJ4,或pFJ6没有淀粉酶活性,证实了淀粉酶在淀粉消费的作用。如图 6 (b)、淀粉酶活性的上层清液CJ7-F / pFJ1-Apro-amyH CJ7-F / pFJ4-Apro-amyH, CJ7-F / pFJ6-Apro-amyH文化在同一OD600普遍低于长江/ pYCJ-Apro-amyH。这个结果可以解释的拷贝数pYCJ(每个染色体一至三册)( 21),高于pFJ1 pFJ4, pFJ6。淀粉酶活性发生在CJ7-F / pFJ6-Apro-amyH最高,表明pFJ6开车比pFJ1和pFJ4更大的蛋白表达。

使用pFJ1淀粉酶J7-F细胞中表达,pFJ4, pFJ6。(一)pFJ1-A pFJ4-A, pFJ6-A质粒转化为J7-F细胞。三个随机转化株被转移到5毫升的《光晕2》中,生长对数期,2 μ每种文化被发现在18%的L米高梅盘子补充2% (w / v)的可溶性淀粉。五天后,碘溶液添加到盘子,晕周围形成立即选择转化株,表明淀粉酶已成功表达。1 - 1:J7-F转换pFJ1(负控制);1 - 2、1 - 3和1 - 4:J7-F转化株窝藏pFJ1-A;4 - 1:J7-F转换pFJ4(负控制);4 - 2、4 - 3和4 - 4:J7-F转化株窝藏pFJ4-A;6 - 1:长江细胞转化和pFJ6(负控制);6 - 2、6 - 3和6 - 4:J7-F转化株窝藏pFJ6-A(负控制)。(b) Amylase-specific活动收集的上清液从长江/ pFJ1-Apro-amyH,长江/ pFJ4-Apro-amyH,长江/ pFJ6-Apro-amyH和长江/ pYCJ-Apro-amyH文化。淀粉酶活动的一个单位被定义为所需数量的淀粉酶水解淀粉的1毫克1 h。

 3.6。兼容性pFJ6和SNJ1 Replicon-Based pYCJ

兼容的航天飞机向量是优秀的调查原核生物蛋白质和protein-DNA交互的工具。以前,我们首先报道了 Natrinemasp。J7 大肠杆菌穿梭载体,pYCJ,构造基于SNJ1复制子和验证稳定表达外源蛋白。因为在J7 pFJ6也可以维持细胞和没有融入J7染色体,我们测试是否pFJ6 pYCJ互相兼容。pFJ6和pYCJ cotransformed成J7-F细胞和转化株被选为18%包含5毫米 μ克/毫升mevinolin。pFJ6的存在和pYCJ转化株被使用引物PCR检测目标 pyrF分别和mevR。结果表明, pyrF和mevR被发现在所有随机选择转化株(数据未显示),表明这两个经由互相兼容。

 4所示。讨论

Haloarchaeon Natrinemasp。J7是第一个已知archaeon港两个质粒,chromosome-based温带病毒,SNJ1 SNJ2。这两个病毒显示许多有趣的特性。首先,SNJ2只能实现高效生产与SNJ1 J7病毒合并感染,表明SNJ1促进了SNJ2[的复制 30.]。然而,很少有人知道这背后的机制virus-virus交互。其次,SNJ1能感染长江,没有港口pHH205,但不能感染J7-1(港pHH205),表明溶原性SNJ1病毒可能建立重复感染排除或免疫力,古生菌的现象知之甚少。第三,几个子元素和遗传控制病毒基因组复制、维护和拷贝数最近发现SNJ1病毒( 21]。然而,这些遗传因素和基因的机制是完全未知的。所有这些观察结果表明,J7及其病毒是优秀的模型为研究病毒-宿主和virus-virus古生菌的相互作用。到目前为止,SNJ1 replicon-based pYCJ一直唯一的穿梭载体使J7遗传操纵细胞。因为pYCJ穿梭载体包含SNJ1复制子( 21),它不能用于SNJ1大多数研究,尤其是对功能性研究调控蛋白编码的SNJ1复制子。此外,考虑到只有一个穿梭载体可供J7细胞,研究蛋白质或protein-DNA交互也有限。在这项研究中,七个向量的基础上预测oriCs J7染色体和 pyrF标记构造;6他们可以复制的尿嘧啶营养缺陷型的J7应变(J7-F)。三个质粒(pFJ1 pFJ4, pFJ6)可以转化成J7-F细胞效率高(103cfu / μg DNA)。这三个向量稳定保持在转换J7-F细胞没有选择和可以用来表达外源蛋白。值得注意的是,其中一个向量,pFJ6,存在质粒在J7细胞并与pYCJ兼容。这些质粒作为有价值的工具,用于进一步的研究应在haloarchaea virus-virus和病毒-宿主相互作用。

向量发达pYCJ相比,本研究显示许多优点。首先,他们可以稳定复制和隔离到子细胞即使在非选择性生长条件。相比之下,pYCJ报道消失从长江的细胞三天后没有抗生素选择 21]。这个属性是特别重要的,因为只有几个标记可用于古生菌。第二,分子量的向量构造都6 kb,这是小得多的比大多数的热点航天飞机向量之前报道( 37),包括pYCJ(约9.9 kb)。因此,这些飞船向量应该能够容纳更大的外源片段和遗传操作会更加方便。最后,鉴于其兼容SNJ1 (pHH205)和pYCJ,航天飞机向量构造在这项研究中,特别是pFJ6可以用于研究监管机构位于SNJ1复制子。这将是通过表达SNJ1只有片段或突变区域的复制子。这种分子操纵使用pYCJ无法实现,因为任何突变1 - 4481地区的SNJ1会损害pYCJ[的稳定性 21]。此外,向量构造在本研究将提供一个有用的工具为研究几个J7细胞生物过程。这些包括重复感染排斥和裂解/ SNJ1病毒的溶原性转换,其主要决定因素是位于SNJ1 1 - 4481地区(未发表的数据)。

除了病毒研究,这里开发的向量可能有助于调查J7染色体复制和隔离。古细菌oriCs通常由一个长基因间序列包括a / T-rich duplex-unwinding元素。他们通常位于上游的 cdc 6/ orc1基因编码一个假定的发起者蛋白质同源Orc1真核的兽人复杂或解旋酶装载机cdc 6 ( 38, 39]。十二oriCs J7染色体中预测使用Ori-Finder 2软件;他们中的大多数是相邻的一个假定的 cdc 6基因。航天飞机的六个向量包含一个或两个J7-F oriCs能独立复制的细胞,这表明至少六12预测oriCs启动DNA复制的能力。这并不奇怪,因为大多数古生菌包含多个复制起源( 38]。然而,值得注意的是,这六个区域的核苷酸序列之间的同源性和复制起始蛋白质的氨基酸序列低。它将感兴趣的测试需要在这些航天飞机向量oriC复制和相邻 cdc 6基因也是必不可少的。pFJ6预测oriC10不包含一个假定的 cdc 6基因,但它可以复制,这表明一些的 疾病预防控制中心基因可能是负责在多个复制起始的起源。此外,航天飞机的三个向量是维持在一个副本每个染色体没有选择,表明他们的复制是协调与染色体和他们忠实地隔离到子细胞。调查等分子机制协调会特别有趣,因为复制起始的控制和协调多个起源于古菌知之甚少。这些向量是优秀的工具在古生菌为研究这一重要问题。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(没有。31570174),国家培养人才的基本科学基金(J1103513)和研究武汉大学实验室基金(创新)。作者感谢失身之后杜博士(美国堪萨斯大学医学中心)对许多有用的讨论和修改的手稿。

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