描述的ATP-Dependent Lon-Like蛋白酶Methanobrevibacter smithii

文摘

朗蛋白酶是高度进化的守恒的。然而,很少有人知道经度的肠道微生物群落。一个基因编码一个Lon-like蛋白酶(Lon-like-Ms)识别和特征Methanobrevibacter smithii的主要archaeon人类肠道生态系统。系统发育和序列分析表明,Lon-like-Ms及其同系物新发现朗家族的成员。一种重组酶被亲和色谱法纯化,及其催化性能研究。重组Lon-like-Ms展出atp酶活性和乳沟活动向fluorogenic肽和酪蛋白。的肽酶活动Lon-like-Ms严格依赖毫克^{2 +}(或其他二价阳离子)和ATP。这些结果强调一种新的Lon-like蛋白酶,不同于细菌。

1。介绍

ATP-dependent朗(La)蛋白酶是最依赖资源的高度保守的成员蛋白酶在细胞溶质的线粒体和过氧化物酶体的原核生物和真核生物(1- - - - - -3]。朗蛋白酶的表型而得名大肠杆菌朗基因突变体,形成长,不可分割的细丝在紫外线照射(4]。朗蛋白酶是一种蛋白质质量控制系统的重要组成部分,已经在所有细胞抵御有害的影响展开的蛋白质。这些系统的关键组件包括ATP-dependent蛋白酶,陪伴,热休克蛋白,和监管分子(5]。ATP-dependent蛋白酶属于AAA蛋白质总科(ATP酶与不同的细胞活动相关),包括26 s蛋白酶体,HslUV, Clp复合物,包括单独的子单元ATP水解蛋白水解作用;相比之下,朗homooligomer相同的亚基组成,包括atp酶和蛋白酶域。为避免不必要的细胞蛋白质的降解,衬底选择质量控制蛋白酶是严格监管。大肠杆菌朗可以识别特定芳香residue-rich序列中访问的多肽但隐藏在最原生结构。朗也展开和降解稳定蛋白质折叠与可识别标签(6]。

两亚科朗蛋白酶,洛娜和LonB定义基于序列分析(7]。的洛娜亚科主要包括细菌和真核酶模仿经典朗蛋白酶大肠杆菌。的LonB亚蛋白质只存在于古生菌,这是矛盾的检测LonB-like蛋白酶的细菌。LonB蛋白酶与膜结合产权首先是与世隔绝的Thermococcus kodakarensis(8]。LonB蛋白酶可能具有相同功能的唯一细菌膜结合ATP-dependent蛋白酶FtsH,不存在古生菌。许多古LonB同源染色体特征,包括t . kodakarensisTK1264 (TkLonB) [8),热原体属acidophilumTa1081 (助教LonB) [9),Methanocaldococcus jannaschiiMJ1417 (乔丹LonB) [10),Archaeoglobus fulgidusAF0364 (房颤LonB) [11),而Haloferax volcaniiHVO_0783 (高压LonB) [12]。所有LonB蛋白酶有类似域组织,其中包括一个氨基端AAA域有两transmembrane-spanning螺旋和一个c端蛋白酶域。生化研究LonB仅限于重组蛋白的纯化大肠杆菌,如全身TkLonB,助教LonB,房颤LonB以及蛋白酶域房颤LonB和乔丹LonB。然而,一些古菌含有洛娜和LonB蛋白酶等Methanosarcinaceae。一些细菌基因组包括大肠杆菌,Thermotoga maritima,霍乱弧菌编码洛娜LonB-like蛋白酶和蛋白酶。在一些古细菌或秀丽隐杆线虫一些Lon-like蛋白酶,不能明显特征属于洛娜或LonB亚科(还确认了7]。

Methanobrevibacter smithii在人类肠道生态系统是主要的archaeon [13]。这个有机体中发挥着重要作用的有效消化多糖(复合糖)通过使用细菌发酵的最终产品(14]。m . smithii可能会因此减少能源收集人类肥胖的治疗目标,和肠道微生物群落的宏基因组研究肥胖老鼠基因和精益的同胞已经表明,前者展览的一个增强的表示基因参与多糖降解,拥有更多的古生菌,拥有更大的能力来促进肥胖当移植到无菌接受者(13]。尽管它的重要性,对函数的经度m . smithii。两个基因(Msm_1569和Msm_1754)已经被注解为朗在基因组序列,编码的蛋白质可能扮演不同的角色。Msm_1569编码规范LonB蛋白酶(Lon-Ms)。在这项研究中,我们提供的第一个序列特征的描述Msm_1754 (Lon-like-Ms),之前报道的酒店大为不同经度蛋白酶。此外,我们表达和纯化Lon-like-Ms的可溶性重组形式大肠杆菌和生化分析其酶学性质。

2。材料和方法

2.1。蛋白表达和纯化

m . smithii应变PS(写明ATCC 35061)是种植在125毫升瓶包含15毫升的MBC血清培养基补充与3 g / L甲酸,乙酸3 g / L,刚做好的和0.3毫升,厌氧,filter-sterilized 2.5% Na₂年代的解决方案。瓶子里剩下的体积(顶部空间)包含4:1 H的混合物₂和有限公司₂;顶部空间是补充日增长期间每隔1 - 2天在37°C。DNA从收获细胞颗粒使用试剂盒基因组DNA隔离设备(瓦伦西亚、钙、美国),与mutanolysin(1单位/ mg湿重细胞颗粒;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)添加到促进微生物溶菌作用。

m . smithii基因组DNA作为模板聚合酶链反应(PCR),而孤立Lon-like-Ms(Msm_1754和WP_011954752)使用以下寡核苷酸引物:向前,5′gga ATT CGA AGA ACC AAA GCC GCT GAAC-3′和反向,5′ccc亚美大陆煤层气有限公司总部柠檬酸CCA 20 20 GTG颈- 3′。PCR产品被绑定到pET28a向量和测序之前转换成BL21 (DE3)。大肠杆菌包含BL21 (DE3)细胞pET28-Lon-like-Ms质粒是有文化的。当OD_600年达到0.7,异丙基-β- - - - - -D-thiogalactopyranoside (IPTG)添加到诱导蛋白表达。IPTG的存在的细胞培养4 h摇晃然后收获和resuspended裂解缓冲包含50毫米三(pH值8.0),300毫米氯化钠,2-mercaptoethanol 20毫米,20毫米咪唑。细胞悬液用,离心机,上层清液加载在Ni-NTA列。洗后列与裂解缓冲,Lon-like-Ms筛选了使用一个咪唑梯度(50 - 250毫米)。纯化朗分离10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和可视化。蛋白质浓度估计使用布拉德福德法和牛血清白蛋白(BSA)作为标准15]。

2.2。酶活性测定

使用fluorogenic肽肽乳沟活动化验glutaryl-Ala-Ala-Phe-4-methoxy -β-naphthylamide (Glt-AAF-MNA)和succinyl-Phe-Leu-Phe-4-methoxy -β-naphthylamide (Bachem、Bubendorf、瑞士)[16]。反应混合物由0.3毫米fluorogenic肽,MgCl 1或4毫米ATP, 10毫米₂,5μ500年g Lon-like-MsμL(50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值8.0)。混合物在37°C 6分钟,孵化和增加荧光(激发,350海里;发射,440海里)监控使用荧光谱仪(模型f - 2000;日立、日本东京)。

纯化蛋白的蛋白水解活性决心使用α酪蛋白为底物。一个500μL反应体积制备包含净化Lon-like-Ms microfuge管(5μg),α酪蛋白(300μg)溶解在50 mM Tris-HCl (pH值8.0),和其他表示大量的试剂。孵化后37°C 6分钟,反应停止通过添加50μL 50%的三氯乙酸沉淀未反应的底物。离心去除沉淀后(12000 g, 10分钟),上层清液的酶产品量化使用紫外可见分光光度计波长280 nm(日本岛津公司、日本)。

atp酶活性被确定的化验从ATP中解放出来。Lon-like-Ms (2.5μg)与4毫米孵化MgCl ATP和10毫米₂100年μL(50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值8.0)在37°C,持续15分钟。免费的确定根据黑色和琼斯(描述的过程17]。背景水平的水解酶(没有)减去在每个试验。

3所示。结果

3.1。序列分析的Lon-Like-Ms

国家生物技术信息中心(NCBI) BLAST-P搜索Lon-like-Ms序列显示最显著的同源性(35 - 64%的身份)Paenibacillus,Desulfosporosinus,Thermoanaerobacterium,芽孢杆菌,梭状芽胞杆菌家庭。探索Lon-like-Ms之间的进化关系和其他带注释的经度,MEGA5程序被用来构建系统发育树从氨基酸序列数据先前研究的经度成员从洛娜(人类、酵母、大肠杆菌)和LonB(一些极端微生物)亚科(图1(一))。尽管引导值偏低,因为大量的序列,在远端分支允许我们更重要的引导值来推断这些蛋白质从类似的物种来自共同的祖先。此外,他们的位置在系统树图是独立的方法用于系统发育重建(数据未显示)。这些聚类结果表明,Lon-Ms蛋白酶坐落在同一个集群作为LonB从其他古生菌。然而,Lon-like-Ms蛋白酶及其同系物组成一个集群与洛娜和LonB截然不同。微生物在这个集群,包括Paenibacillus,Desulfosporosinus,Thermoanaerobacterium,芽孢杆菌,梭状芽胞杆菌,严格或兼性厌氧。因此,这群朗蛋白酶是初步分配指定Lon-like蛋白酶。ClustalW序列比对(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)还发现持续高身份(> 35%)在同一亚朗蛋白酶,与低(< 20%)的身份Lon-like-Ms及其同系物Paenibacillus,Desulfosporosinus,Thermoanaerobacterium,芽孢杆菌,梭状芽胞杆菌洛娜的蛋白质和LonB亚科(补充表在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/5759765)。详细的序列比对(图1 (b))显示,Lon-like-Ms包含守恒的沃克,沃克B图案的氨基端Lon-like-Ms序列。有趣的是,Lon-like-Ms对应的氨基酸Tyr587高度保守的催化丝氨酸残基洛娜和LonB亚科。

酶域进行了进一步分析使用简单的模块化体系结构研究工具(智能)(http://smart.embl-heidelberg.de/)(图1 (c))。结果显示,它们共享一个atp酶域和c端蛋白酶域。Lon-like-Ms包含另一个像LonB n端结构域。Lon-like-Ms和经度的跨膜区域大肠杆菌(洛娜)和t . kodakarensis(LonB)预测使用TMHMM v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TOPCONS (http://topcons.cbr.su.se/)。相比之下,洛娜,LonB亚科包含两个跨膜螺旋的atp酶域。有趣的是,没有观察到跨膜图案Lon-like-Ms和其他的成员Lon-like亚科(补充图)。

3.2。Lon-Like-Ms表达和纯化

研究Lon-like-Ms的功能,我们首先表示编码基因在细菌的系统。通过PCR基因编码Lon-like-Ms放大m . smithii基因组DNA。该基因片段是由大小在琼脂糖凝胶电泳验证subcloned进入大肠杆菌表达载体pET28a。插入片段DNA测序证实了。大肠杆菌改变了的pET28a-Lon-like-Ms向量和培养,之后与蛋白表达诱导1毫米IPTG。细菌样本收集和分析了sds - page(图2)。作为巷3表明,蛋白质分子量的乐队大约77 kDa,它匹配预测分子质量(77.4 kDa) Lon-like-Ms, IPTG诱导后检测。培养后,大肠杆菌细胞被resuspended所需的缓冲和用。离心后,有效纯化了重组Lon-like-Ms Ni-NTA亲和色谱法,所表示的一个乐队在sds - page凝胶(图2)。

3.3。Lon-Like-Ms活动分析

的肽乳沟活动使用Glt-AAF-MNA Lon-like-Ms决心,经常被用作基质不同经度蛋白酶。当Lon-like-Ms孵化与Glt-AAF-MNA ATP和Mg的存在^{2 +}时间增加荧光,顺向fluorogenic肽的水解,观察(图3(一个))。没有Mg Lon-like-Ms展出没有分裂活动^{2 +},无论存在与否的ATP。时观察到类似的结果α酪蛋白是用作基质蛋白水解活性分析。的最佳pH值和温度ATP-independent Lon-like-Ms活动被发现是7.5和37°C(图3 (b)),分别。在这些最优条件下,Lon-like-Ms表现出特定活动的34±8.7 MNA pmol /μ蛋白质的g / h对Glt-AAF-MNA 4毫米的存在ATP。

Lon-like-Ms展示肽酶和蛋白酶活性在不同核苷三磷酸腺苷和二价阳离子的存在,如表所示1。ADP,经度的有效抑制剂大肠杆菌也抑制了Lon-like-Ms的活动,尽管酶保留64%活动相对于水平检测ATP的存在。活动的存在nonhydrolyzable模拟的ATP, 5′腺苷imidodiphosphate (AMP-PNP),类似于观察ATP,观察的经度大肠杆菌。增加ATP或AMP-PNP集中导致活动减少,达到减少一半在1毫米ATP或AMP-PNP(图3 (c))。Lon-like-Ms来说,这些结果表明抑制通过核苷酸绑定是截然不同的经度大肠杆菌,因为后者的活动增加,增加ATP浓度从10⁻⁴到10⁻²毫米。酶活性是严格依赖于二价阳离子的存在,比如毫克^{2 +}。有趣的是,锰^{2 +}表现类似于毫克^{2 +}代数余子式,Ca^{2 +}可以取代毫克^{2 +}到一个类似的程度。虽然效果低于毫克^{2 +}、镍^{2 +},或^{2 +}、有限公司^{2 +}也能够支持水解(表吗1)。Lon-like-Ms-mediated水解率不同的核苷酸也测量(表2)。活动被发现是严格依赖于二价阳离子,如毫克^{2 +}和其他二价阳离子(倪^{2 +}、钙^{2 +}、锰^{2 +}、有限公司^{2 +}52 - 105%的支持活动水平相对于观察Mg^{2 +}(表2)。

4所示。讨论和结论

据我们所知,Lon-like-Ms是第一个研究Lon-like archaeon从人类肠道蛋白酶表达。类似于其他洛娜从不同来源蛋白酶,Lon-like-Ms具有物种三域分类结构的n端结构域组成,atp酶域和蛋白酶域。尽管Lon-like-Ms表现出减少细菌和真核同行相似,这是列为AAA总科的一员和被发现拥有几个守恒的图案,比如nucleotide-binding沃克,沃克B (18]。两亚科朗蛋白酶,洛娜和LonB此前分类基于共识序列在蛋白酶蛋白水解网站域名(7]。一般来说,这两个亚科沃克与两个不同的主题一致序列在AAA领域和特定领域的组织特性在一个n端结构域是附加到AAA级模块的洛娜但不是LonB成员。后者成员只存在于古生菌,AAA领域拥有额外的集成membrane-spanning段锚定蛋白膜(8]。然而,这种蛋白水解就地分类方法排除这样一大群Lon-like蛋白酶许多革兰氏阴性细菌的基因组中编码(以及某些革兰氏阳性细菌和古生菌)包含LonB-like共识序列的蛋白水解网站但缺乏跨膜区域或检测到AAA共识主题(19]。尽管Lon-like-Ms包含一个atp酶域和蛋白水解领域,它表现出低序列相似性洛娜和LonB。Lon-like-Ms还缺少一个跨膜区域,因此不同于LonB古生菌蛋白酶。此外,洛娜和LonB使用丝氨酸作为一个活跃的网站因为丝氨酸的羟基可以作为亲核试剂进攻的羰基碳易裂开的衬底的肽键。在序列比对(图1 (b)),酪氨酸占据的位置在Lon-like-Ms丝氨酸。与羟基芳香族氨基酸酪氨酸,也可以是亲核试剂(如DNA拓扑异构酶)(20.]。Lon-like-Ms也可能使用其他丝氨酸在c终端活动网站因为催化域的折叠Lon-like-Ms还不清楚。综上所述,这些研究证明Lon-like-Ms及其同系物组成一个新家庭有别于洛娜和LonB家庭。

在ATP,朗劈开蛋白质基质在多个网站成小肽产品。在这个过程中,朗水解ATP,展开和/或把蛋白质基质蛋白水解活性部位,和催化肽键的乳沟。当Lon-mediated降解的动力学机制分析蛋白质基质,很难确定ATP的特定功能绑定和ATP水解在每个ATP酶循环,因为底物包含多个不同的网站所公认和/或裂解朗(2]。在这项研究中,我们进一步纯化和表征Lon-like-Ms解决这个生化问题。针对不同的核苷酸Lon-like-Ms展出活动。这种蛋白酶也表现出乳沟活动对fluorogenic肽的存在ATP和毫克^{2 +}。朗从大肠杆菌(21)展品最大效率当ATP必然和水解的毫克^{2 +}。然而,fluorogenic肽降解也发生在nonhydrolyzable AMP-PNP。出乎意料地,朗t . kodakarensis(8),t . acidophilum(9)表现出更高的肽乳沟活动缺乏ATP的ATP的存在。类似Lon-like蛋白质,TTC1975,栖热菌属酸奶被证明缺乏腺苷三磷酸酶活性,因此其蛋白水解活性并不是刺激的ATP (22]。这些结果表明,古Lon-like-Ms和细菌经度大肠杆菌对ATP依赖性是相似的。相反,通过核苷酸Lon-like-Ms绑定的抑制是截然不同的经度大肠杆菌。最后,古Lon-like-Ms不包含一个跨膜区域,与经度蛋白酶t . kodakarensis和t . acidophilum,因此Lon-like-Ms之间的序列的身份和其他蛋白质非常低。为了进一步阐明Lon-like-Ms的功能,我们正在进行实验的基质Lon-like-Ms通过构建突变株Lon-like-Ms将过表达。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突相关的出版。

作者的贡献

华贵的裴和严交流造成了同样的工作。

补充材料

引用

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