m . smithii应变PS(写明ATCC 35061)是种植在125毫升瓶包含15毫升的MBC血清培养基补充与3 g / L甲酸,乙酸3 g / L,刚做好的和0.3毫升,厌氧,filter-sterilized 2.5% Na₂年代的解决方案。瓶子里剩下的体积(顶部空间)包含4:1 H的混合物₂和有限公司₂;顶部空间是补充日增长期间每隔1 - 2天在37°C。DNA从收获细胞颗粒使用试剂盒基因组DNA隔离设备(瓦伦西亚、钙、美国),与mutanolysin(1单位/ mg湿重细胞颗粒;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)添加到促进微生物溶菌作用。

m . smithii基因组DNA作为模板聚合酶链反应(PCR),而孤立 Lon-like-Ms(Msm_1754和WP_011954752)使用以下寡核苷酸引物:向前,5′gga ATT CGA AGA ACC AAA GCC GCT GAAC-3′和反向,5′ccc亚美大陆煤层气有限公司总部柠檬酸CCA 20 20 GTG颈- 3′。PCR产品被绑定到pET28a向量和测序之前转换成BL21 (DE3)。 大肠杆菌包含BL21 (DE3)细胞 pET28-Lon-like-Ms质粒是有文化的。当OD_600年达到0.7,异丙基- β- - - - - - d-thiogalactopyranoside (IPTG)添加到诱导蛋白表达。IPTG的存在的细胞培养4 h摇晃然后收获和resuspended裂解缓冲包含50毫米三(pH值8.0),300毫米氯化钠,2-mercaptoethanol 20毫米,20毫米咪唑。细胞悬液用,离心机,上层清液加载在Ni-NTA列。洗后列与裂解缓冲,Lon-like-Ms筛选了使用一个咪唑梯度(50 - 250毫米)。纯化朗分离10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和可视化。蛋白质浓度估计使用布拉德福德法和牛血清白蛋白(BSA)作为标准 15]。

使用fluorogenic肽肽乳沟活动化验glutaryl-Ala-Ala-Phe-4-methoxy - β-naphthylamide (Glt-AAF-MNA)和succinyl-Phe-Leu-Phe-4-methoxy - β-naphthylamide (Bachem、Bubendorf、瑞士)[ 16]。反应混合物由0.3毫米fluorogenic肽,MgCl 1或4毫米ATP, 10毫米₂,5 μ500年g Lon-like-Ms μL(50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值8.0)。混合物在37°C 6分钟,孵化和增加荧光(激发,350海里;发射,440海里)监控使用荧光谱仪(模型f - 2000;日立、日本东京)。

纯化蛋白的蛋白水解活性决心使用 α酪蛋白为底物。一个500 μL反应体积制备包含净化Lon-like-Ms microfuge管(5 μg), α酪蛋白(300 μg)溶解在50 mM Tris-HCl (pH值8.0),和其他表示大量的试剂。孵化后37°C 6分钟,反应停止通过添加50 μL 50%的三氯乙酸沉淀未反应的底物。离心去除沉淀后(12000 g, 10分钟),上层清液的酶产品量化使用紫外可见分光光度计波长280 nm(日本岛津公司、日本)。

atp酶活性被确定的化验 P 我 从ATP中解放出来。Lon-like-Ms (2.5 μg)与4毫米孵化MgCl ATP和10毫米₂100年 μL(50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值8.0)在37°C,持续15分钟。免费的 P 我 确定根据黑色和琼斯(描述的过程 17]。背景水平的水解酶(没有)减去在每个试验。

国家生物技术信息中心(NCBI) BLAST-P搜索Lon-like-Ms序列显示最显著的同源性(35 - 64%的身份) Paenibacillus, Desulfosporosinus, Thermoanaerobacterium, 芽孢杆菌, 梭状芽胞杆菌家庭。探索Lon-like-Ms之间的进化关系和其他带注释的经度,MEGA5程序被用来构建系统发育树从氨基酸序列数据先前研究的经度成员从洛娜(人类、酵母、 大肠杆菌)和LonB(一些极端微生物)亚科(图 1(一))。尽管引导值偏低,因为大量的序列,在远端分支允许我们更重要的引导值来推断这些蛋白质从类似的物种来自共同的祖先。此外,他们的位置在系统树图是独立的方法用于系统发育重建(数据未显示)。这些聚类结果表明,Lon-Ms蛋白酶坐落在同一个集群作为LonB从其他古生菌。然而,Lon-like-Ms蛋白酶及其同系物组成一个集群与洛娜和LonB截然不同。微生物在这个集群,包括 Paenibacillus, Desulfosporosinus, Thermoanaerobacterium, 芽孢杆菌, 梭状芽胞杆菌,严格或兼性厌氧。因此,这群朗蛋白酶是初步分配指定Lon-like蛋白酶。ClustalW序列比对( http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)还发现持续高身份(> 35%)在同一亚朗蛋白酶,与低(< 20%)的身份Lon-like-Ms及其同系物 Paenibacillus, Desulfosporosinus, Thermoanaerobacterium, 芽孢杆菌, 梭状芽胞杆菌洛娜的蛋白质和LonB亚科(补充表 1 在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2016/5759765)。详细的序列比对(图 1 (b))显示,Lon-like-Ms包含守恒的沃克,沃克B图案的氨基端Lon-like-Ms序列。有趣的是,Lon-like-Ms对应的氨基酸Tyr587高度保守的催化丝氨酸残基洛娜和LonB亚科。

酶域进行了进一步分析使用简单的模块化体系结构研究工具(智能)( http://smart.embl-heidelberg.de/)(图 1 (c))。结果显示,它们共享一个atp酶域和c端蛋白酶域。Lon-like-Ms包含另一个像LonB n端结构域。Lon-like-Ms和经度的跨膜区域 大肠杆菌(洛娜)和 t . kodakarensis(LonB)预测使用TMHMM v.2.0 ( http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TOPCONS ( http://topcons.cbr.su.se/)。相比之下,洛娜,LonB亚科包含两个跨膜螺旋的atp酶域。有趣的是,没有观察到跨膜图案Lon-like-Ms和其他的成员Lon-like亚科(补充图 1 )。

研究Lon-like-Ms的功能,我们首先表示编码基因在细菌的系统。通过PCR基因编码Lon-like-Ms放大 m . smithii基因组DNA。该基因片段是由大小在琼脂糖凝胶电泳验证subcloned进入 大肠杆菌表达载体pET28a。插入片段DNA测序证实了。 大肠杆菌改变了的 pET28a-Lon-like-Ms向量和培养,之后与蛋白表达诱导1毫米IPTG。细菌样本收集和分析了sds - page(图 2)。作为巷3表明,蛋白质分子量的乐队大约77 kDa,它匹配预测分子质量(77.4 kDa) Lon-like-Ms, IPTG诱导后检测。培养后, 大肠杆菌细胞被resuspended所需的缓冲和用。离心后,有效纯化了重组Lon-like-Ms Ni-NTA亲和色谱法,所表示的一个乐队在sds - page凝胶(图 2)。

的肽乳沟活动使用Glt-AAF-MNA Lon-like-Ms决心,经常被用作基质不同经度蛋白酶。当Lon-like-Ms孵化与Glt-AAF-MNA ATP和Mg的存在^{2 +}时间增加荧光,顺向fluorogenic肽的水解,观察(图 3(一个))。没有Mg Lon-like-Ms展出没有分裂活动^{2 +},无论存在与否的ATP。时观察到类似的结果 α酪蛋白是用作基质蛋白水解活性分析。的最佳pH值和温度ATP-independent Lon-like-Ms活动被发现是7.5和37°C(图 3 (b)),分别。在这些最优条件下,Lon-like-Ms表现出特定活动的34±8.7 MNA pmol / μ蛋白质的g / h对Glt-AAF-MNA 4毫米的存在ATP。

Lon-like-Ms展示肽酶和蛋白酶活性在不同核苷三磷酸腺苷和二价阳离子的存在,如表所示 1。ADP,经度的有效抑制剂 大肠杆菌也抑制了Lon-like-Ms的活动,尽管酶保留64%活动相对于水平检测ATP的存在。活动的存在nonhydrolyzable模拟的ATP, 5′腺苷imidodiphosphate (AMP-PNP),类似于观察ATP,观察的经度 大肠杆菌。增加ATP或AMP-PNP集中导致活动减少,达到减少一半在1毫米ATP或AMP-PNP(图 3 (c))。Lon-like-Ms来说,这些结果表明抑制通过核苷酸绑定是截然不同的经度 大肠杆菌,因为后者的活动增加,增加ATP浓度从10⁻⁴到10⁻²毫米。酶活性是严格依赖于二价阳离子的存在,比如毫克^{2 +}。有趣的是,锰^{2 +}表现类似于毫克^{2 +}代数余子式,Ca^{2 +}可以取代毫克^{2 +}到一个类似的程度。虽然效果低于毫克^{2 +}、镍^{2 +},或^{2 +}、有限公司^{2 +}也能够支持水解(表吗 1)。Lon-like-Ms-mediated水解率不同的核苷酸也测量(表 2)。活动被发现是严格依赖于二价阳离子,如毫克^{2 +}和其他二价阳离子(倪^{2 +}、钙^{2 +}、锰^{2 +}、有限公司^{2 +}52 - 105%的支持活动水平相对于观察Mg^{2 +}(表 2)。