对甲烷生产Archaeum的计算模型

文摘

进展的一个完整的模型产甲烷archaeum甲烷八叠球菌属acetivorans据报道。我们粒度分布特征的细胞使用微分干涉对比显微镜,发现他们是椭圆形的意思是长度和宽度为2.9μm和2.3μm,分别种植在甲醇和醋酸生长在时小30%。我们使用了单分子拉(SiMPull)技术测量平均Mcr复杂和核糖体的拷贝数。甲烷生成途径的动力学模型基于生化研究和最近的几个相关的产甲烷菌代谢重构。在这个模型中,26个反应在甲烷生成途径耦合到一个细胞大规模生产酶浓度反应,更新。RNA表达数据(RNA-seq)测量细胞培养生长在乙酸和甲醇用于估计相对蛋白质消耗ATP生产每摩尔。模型捕获实验观察细胞生长在甲醇和甲烷生产速度是最敏感的methyl-coenzyme-M还原酶(Mcr)和methyl-tetrahydromethanopterin: coenzyme-M甲基转移酶(地铁)的蛋白质。草案提出了基于已知的转录调控网络的交互,我们打算与动力学模型,允许集成动态监管。

1。介绍

核糖体的分子签名rRNA进化被伍斯和他的同事使用建立生物的三个主要分组:古生菌,细菌和真核生物(1- - - - - -6]。虽然这三个领域的祖先或公共的起源仍然是一个有争议的问题,越来越多的大量的数据积累有关细胞RNA发展史和分子组成的在过去的几十年里继续支持部门之间的三个主要领域(7]。此外,比较分析序列的蛋白质和RNA参与翻译的存在提供了强有力的证据表明,高度发达的平移机械是一个细胞的出现的必要条件,因为我们知道他们(8,9]。分子签名的ribosome-idiosyncrasies rRNA [7)和/或r-proteins特点每个域的生活锁在进化趋异的时候,注定要成为分子化石。作为他的遗传退火理论伍斯假定,祖先的三个主要组生物发展成为一个日益复杂的细胞类型的数量。细胞的各种子系统“结晶”,也就是说,成为耐火材料与翻译装置横向基因转移可能结晶。

虽然rRNA发展史支持连接蛋白质序列的系统发育分析的基本基因在转化机械、横向基因转移的影响(LGT)在生物体在生命的三个领域中清楚地看到氨酰合成酶,指控tRNA模块化子系统,建立了遗传密码(10- - - - - -12]。

作为一个超越翻译和转录的信息处理系统,越来越多的LGT也延伸到其他的蜂窝网络。如果早期社会的细胞更像是现代细菌财团,细胞可能cross-fed不仅基因,而且新陈代谢。每个改善翻译增加了准确性会允许新的蛋白质出现,进而进一步发展了细胞内代谢途径。与代谢功能在本质上是模块化的,这些基因横向转移。很多情况下目前已知的细菌代谢基因发生在一个或几个古生菌,反之亦然,促使寻找签名的代谢网络独特的古菌(13- - - - - -16]。

许多理论早期的生活主张减少环境中厌氧生物可能是第一个进化(17]。古生菌的系统发育分析蛋白质的独特的和其主要子组导致假设methanogens-anaerobic古生物体的代谢能通过减少单一碳化合物在生命的早期演化methane-feature突出。产甲烷菌属于系统种类繁多的严格厌氧菌估计每年生产十亿吨的甲烷(18]。他们发现利基市场环境中包括浅和深热液喷口(19)、沼泽、稻田、土地填充(20.)、温泉和缺氧沉积物下海藻床(18]。

的Methanosarcineae新陈代谢是最多样化的产甲烷菌。只有m . acetivorans和其他古生菌属甲烷八叠球菌属使用所有四种已知产甲烷在不同生长条件下的代谢途径。而系统生物学研究长期使用大肠杆菌作为生物模型在理解蜂窝网络的响应各种环境条件的变化或基因淘汰赛,计算模型建立产烷生物的新陈代谢才刚刚开始的21,22]。部分基于我们自己的基因开关建模工作大肠杆菌在蛋白表达和异质性的影响大量的细菌的新陈代谢(23),我们在座的进展产烷生物的综合计算模型。这样做我们已经深刻地影响我们的协会与卡尔伍斯发表第一个产烷生物的基因组,Methanocaldococcus janaschii,极大地激发了我们的兴趣描述转化和代谢机制的产甲烷古菌(24]。

我们有我们的研究关注m . acetivorans有几个原因。首先,生物体可以在三个类生长基质演示使用三个产甲烷途径:methylotrophic通路,在有机体生长在含有基质包括甲醇、甲基三,di -和mono-methylamine (TMA、DMA、MMA)和methylsulfides (DMS, MMS);acetoclastic通路,在有机体生长在乙酸;carboxidotrophic通路,其中一氧化碳氧化醋酸、甲酸和甲烷(25- - - - - -27]。第二,的基因组m . acetivorans已测序(25],而花费很大努力朝着确定甲烷生成的调节基因表达蛋白(28]。第三,基因组展览相当大的同源性两个研究属的成员甲烷八叠球菌属:m·巴氏细菌和m . mazei,因此,一个模型可能会很容易地修改为其他的工作。

开发一个模型archaeum需要描述的物理和生化性质。为此细胞的物理维度,包括它们的长度和宽度,测量。建模还需要评估单个细胞的核糖体蛋白质/复制数据;单分子下拉(SiMPull)技术(29日)——婚姻传统的下拉试验与单分子荧光显微镜用来测量意味着两个关键蛋白质的拷贝数。第一个蛋白测量γ亚基(McrG) methyl-coenzyme-M还原酶(Mcr)复杂的代表数量的Mcr复合物,而催化甲烷生成的甲烷生产步骤。第二,核糖体蛋白Rpl18p大亚基的核糖体是算作一个代理为核糖体的数目。甲烷生成途径的动力学模型能够代表增长对甲醇和醋酸开发使用RNA-seq从文献数据和动力学参数。该模型涵盖了可比的几个特性实验数据(30.,31日]。模型允许我们探测的敏感性进一步增长(和间接甲烷生产)每个蛋白质的拷贝数,指导进一步的实验研究。为了扩展模型来模拟在其他基质增长,我们编译所有实验的列表和假想的转录监管互动。这些交互将用于调节蛋白表达的函数增长衬底与动力学模型,我们可以结婚在未来。

2。实验和计算方法

2.1。菌株,媒体,和增长的条件

m . acetivoransC2A菌株(野生型,WWM 889::SNAP-mcrG,WWM890::rpl18p-SNAP)是生长在单细胞形态(48]在37^∘C在高盐(HS)中包含40毫米或125毫米甲醇乙酸(49]。处理和操纵的菌株进行了严格的厌氧条件下厌氧手套箱,使用无菌厌氧媒体和股票。固体介质板(商品中,1.5%琼脂)被用于选择提前要素的两个步骤:嘌呤霉素(国际研究产品,太前景,IL)在最后2µg /毫升的浓度是用来选择的菌株携带嘌呤霉素转乙酰酶(pac)和嘌呤类似物8-aza-2 6-dia-minopurine (8-ADP)(σ,圣路易斯,密苏里州)在最后20µg /毫升的浓度是用来选择的成基因(50- - - - - -52]。所有的盘子都在厌氧intrachamber孵化器孵化53]。标准方法在用于隔离和操纵的质粒DNA大肠杆菌。DNA纯化进行了使用适当的工具(OmegaBio-Tek诺GA)。增长是量化通过测量光密度在600 nm (罗伊,弥尔顿公司液体21分光光度计)和生成时间计算在指数增长。

2.2。遗传结构甲烷八叠球菌属Acetivorans

基因融合与拍照是由第一构建质粒基因附近的一个aphII盒两侧NheI限制网站。pJK1048A被用作模板制作感兴趣的糖基的融合基因,而pJK1047B用于n端融合。DNA寡核苷酸(IDT,爱荷华市,IA)与模板和感兴趣的基因同源性被用来放大SNAP-aphII结构。λ红方法被用来快速aphII构造集成到特定的N -或c端位置(54对卡那霉素抗性),选择。的mcrG和rpl18p基因进行粘粒中创建一个m . acetivorans粘粒以前图书馆建设中执行实验室(张和麦特卡尔夫得知未发表)。的aphII等位基因被切除的粘粒NheI限制消化,留下一个在坐标系快速融合基因的兴趣。野生型基因的副本问题取而代之的是提前标记版本使用同源重组,如前所述[51]。

2.3。从DIC显微镜细胞形态

细胞培养是成长为对数生长期0.6和1毫升的文化被和离心机在14000 g 5分钟。100年resuspended获得的细胞球μL h媒体没有刃天青,观察到的细胞被使用(DIC)微分干涉对比显微镜技术在蔡司LSM700共焦显微镜。

2.4。RNA-Seq分析

m . acetivoransC2A野生型改编为33代甲醇和醋酸。来自指数阶段的早期文化的总RNA分离(= 0.4)使用TRIzole (Carslbad表达载体,CA)和Zymo Direct-zol RNA MiniPrep工具包(Zymo研究、欧文、CA)。RNA样本贫化的16 s - 23 s rrna通过杂交补充生物素化的寡核苷酸和后续去除streptavidin-magnetic珠子(修改(55])。互补脱氧核糖核酸数据库建设,高通量测序的RNA是由罗伊·j·卡佛生物技术中心在伊利诺伊大学厄巴纳香槟。所有测量都是一式三份完成。凤冠[56]细菌RNA-seq分析软件被用来映射RNA读取的m . acetivorans基因组使用默认参数启用了详细的输出。每千碱基读取每百万读取(RPKM)值平均三个复制和用于后续分析。

2.5。SiMPull实验

单分子下拉或SiMPull技术(57),是用来确定意味着蛋白质数量的两种蛋白质m . acetivorans。短暂,SiMPull显微镜技术在荧光标记蛋白感兴趣的是“捕获”细胞溶解产物的固定化抗体连接到钝化的显微镜幻灯片。在这些实验中,遗传SNAP-tag系统(新英格兰生物学实验室(内),伊普斯维奇,MA)被用于标记或N -糖基的蛋白质研究(图1)。

标记突变体生长对数期和收获的0.6。细胞密度估计使用Petroff-Hausser计数室。一毫升细胞培养在14000 g离心5分钟获得细胞球,随后在100年re-suspending细胞时细胞溶解µL建议临时标签缓冲区:50 mM Tris-Hcl (pH值7.5);100毫米氯化钠;渐变20 0.1%;1毫米德勤(内)与1µg DNAse。细胞溶解产物当时孵化AlexaFluor 488(内)的最终浓度10µM在室温下一小时。为了消除自由染料,样本洗了三次临时标签缓冲区和集中使用10 K Amicon超离心过滤器。如前所述(执行SiMPull分析57]。

显微镜载玻片被涂上一层聚乙二醇(PEG)最大限度地减少非特异性生物分子吸附。表面掺杂有2 - 5% biotin-conjugated挂钩在幻灯片准备。诱饵招聘兔anti-SNAP抗体(内)被固定在表面先后流入NeutrAvidin(4µM)和生物素共轭antirabbit抗体(20 nM),如图3(一个)。

溶菌产物被冲走,推倒蛋白使用棱镜成像类型全内反射显微镜(TIRF)与励磁488海里。由此产生的图像(见图3 (b)使用自定义软件(如前所述)进行了分析29日),量化单点在显微镜的视野。一个单一的点可能对应多个荧光团的观察可以看出多个离散光漂白步骤(如Rpl18p的情况下,图9)表明结果是下界的实际数量的蛋白质。

2.6。动力学模型

RNA-seq表达数据m . acetivorans生长在甲醇和乙酸(59)提供足够的参数初步甲烷生成途径(表的动力学模型1)。模型包括反应methylotrophic, acetoclastic和电子传递途径如图4。额外的反应包括模拟生物量增长转化为ATP由甲烷生成的模型驱动的质子梯度成细胞团块。因为98%的碳进入甲烷生成的离开或(60],ATP被认为是一个很好的模拟发展的殖民地。一个模型示意图如图5。

在表的动力学模型1基于反应代谢模型iMB745(22]。反应是建模为一组耦合的微分方程(常微分方程)是解决确定性使用COPASI软件(61年]。17的26个甲烷生成反应速率数据被从文献[32- - - - - -38,40- - - - - -47布伦达数据库中的报道[62年]。其他9个参数是适合实验在细胞培养生长在125毫米甲醇(30.]。三种类型的反应机制用于模型的反应:不可逆的单分子Michaelis-Menten,不可逆双分子Michaelis-Menten和一阶。的情况下超过两个反应物,最重要的两个反应物被选为双分子反应和一个常数通量反应是补充说,将额外的反应物转换为产品在同一流量双分子反应的速率。在双分子的反应,和对底物被认为是相同的。当从文学、失踪参数逆向反应被认为是一样的,向前的反应(例如,Mtd,妇幼保健、功能处理量和手足口病/生产)。正向和反向的速率常数以Mer比率约为6.8。这个比例是假定Mtd,妇幼保健功能处理量和手足口病/ Fwd在同一个通路。因为地铁是近平衡(63年),我们假设的正向和反向利率是相同的。50年代的值⁻¹被选为这个反应。

最后,Rnf和Fpo被假定拥有类似利率Hdr蛋白也催化的运动同样数量的离子穿过细胞膜。模型中使用的建模和反应速率常数可以在表中找到1。

值为15.4克每摩尔的细胞质量的ATP (22,64年)是用于生物质表达式匹配的固定相的质量文化从实验OD计算_420年测量(31日]。细胞群反应的速率将匹配近似最大倍增时间8小时以增长对甲醇。在模型中生物量的积累会导致酶的积累;每克生物质,63%被认为是蛋白质(依照[22])的一些产甲烷催化酶,自己成长。RNA-seq实验的结果为产甲烷的化学计量提供估计每摩尔ATP酶。产甲烷蛋白质之间的线性关系,信使rna。我们确定蛋白质的相对质量 的系数的质量分数是th蛋白质计算(2)。的价值和蛋白质的分子量每摩尔,摩尔数的蛋白质ATP的决心;这些值在表提供2。我们有

1毫升容量的模型解决了最初的细胞群为0.1毫克,计算从光密度的增长30.,31日]。水的浓度和内部质子是假定为常数,因此他们对速率常数的影响是隐而不显式地建模。细胞外的浓度质子最初设置为7的生理pH值和质子ATP合酶反应中显式地建模。这减少了大部分的反应的复杂性,要么一个或两个底物Michaelis-Menten动力学。初始浓度的ATP、ADP和P_我将生理浓度的10 1和10毫米,分别47]。中间能量载体(玉米,CoM,铁氧还蛋白等)的初始浓度被认为是0.009毫米,这是计算测量值的474 nmol / g蛋白质测定辅酶F_420年在m·巴氏细菌生长在甲醇(65年]。

2.7。转录模式

转录调控的假定的模型构建使用实验数据和推断监管互动基于基因注释和与已知蛋白序列同源性监管其他古生菌。两个不同的模型开发:第一只涉及直接交互和第二个涉及间接和假想的交互。的直接交互模型是基于实验证据的实际约束力的激活/抑制因子启动子区域的差别导致了/对这些目标基因。此外,基因显示微分表达式和包含已知的启动子区域,包括直接的模型。间接交互模型包括交互在文献中报道在不同生长条件下,蛋白质差异表达或表达差异表达与监管者,但不存在相互作用的直接证据。力量直接和间接的相互作用模型从文学;当转录监管机构中,相互作用的强度是由过度规范化水平。一个完整的枚举的文献报告用于开发这些转录调控模型3.5。

3所示。结果与讨论

3.1。细胞特性

DIC甲醇和醋酸生长细胞的图像获取和分析,以量化他们的身体尺寸。见图7(一),DIC显微镜收益率增强对比度图像利用梯度的光学路径长度光束通过相邻点之间的照明样本。增强的对比是定向和出现强烈的剪切向量。没有对比发生垂直于剪切矢量,从而使细胞边界的界定困难。希尔伯特变换已经使用在过去与DIC显微镜,以援助在图像分割66年]。自定义Matlab脚本开发规范化和希尔伯特变换应用于DIC的图像。转换后的图像显示在细胞成像清晰的边界(图7 (b))。CellProfiler软件被用来识别单元边界(67年),测量细胞的尺寸。图6显示长度和宽度的分布从大约10000个细胞识别。观察到的平均长度和宽度是2.9µm和2.3µm甲醇种植细胞,而对于醋酸生长细胞µmµm 2.3和1.7,分别。假设细胞中椭球形状,体积的甲醇生长细胞将大约9 fl和醋酸,大约是4 fl。细胞意味着纵横比为1.27甲醇醋酸生长细胞和1.33细胞增长。

3.2。SiMPull测量

SiMPull被用来测量意味着副本数量的两种蛋白质不可或缺的产甲烷菌的生长和生理。第一个是γ亚基的methyl-coenzyme M-reductase (Mcr)复杂。这个复杂的代谢网络中是一个关键,催化甲烷生成的最后一步产生甲烷。第二个是Rpl18p,核糖体,核糖体蛋白算作代理细胞的蛋白质生产机械。我们的n端插入临时标签mcrG基因和糖基的rpl18p基因(图1)。糖基的快速的融合Rpl18P暴露它的外面核糖体蛋白质使固定化anti-SNAP捕捉整个核糖体SiMPull试验(见图2)。使用这些校准曲线(图8),连同之前的估计细胞密度溶解从细胞计数实验,得到了复制Mcr的数量和每个细胞核糖体(表3)。Mcr数字定性同意最近的一项研究,Mcr成像在TEM免疫细胞化学技术(68年]。

3.3。RNA-Seq实验

核糖核酸测序实验为了阐明微分表达式的产甲烷酶在不同的生长基质。比较的比例mRNA表达methanol-grown细胞acetate-grown的细胞显示了良好的协议与定量逆转录酶聚合酶链反应的结果(qrtPCR)数据之前报道(69年]。

然而,有两个不符点。首先,Hdr,发现比acetate-grown methanol-grown细胞中高度表达的细胞,以前曾有报道称醋酸生长条件下更高度表达。这可能是由于实验噪声在这两种情况下的表达率接近1。其他的区别更加明显;ATP合酶的表达被发现3倍醋酸在我们的实验中,而之前报道的结果表明只有两倍的提高。尽管如此,产甲烷的表达蛋白质通常同意先前的报道(59,69年),重要的是,我们的实验是在一式三份,因此,提供了更大的信心在我们的结果除了一些误差估计的方法。

蛋白质的数量,计算使用的假设它们是线性比例从RNA-seq信使rna数量,从SiMPull与实验测量的比较。从[26),我们知道(1)对应于0.410.07毫克每毫升干燥质量文化发展有限公司承担63%的质量是蛋白质和蛋白质质量分数1.2% Mcr,得到3.10.5µg Mcr每毫升的文化或10.31.6皮摩尔/毫升的文化(Mcr = 300 kDa的分子量70年])。使用细胞密度每毫升5亿个细胞的文化1(数据未显示),我们获得约124002000份Mcr每个细胞生长在甲醇和大约6000细胞生长在公司估计由于大小差异。SiMPull测量甲醇Mcr的细胞生长范围从273到1320册/细胞(见表3)。

3.4。动力学模型

甲烷生成途径的动力学模型m . acetivoranssingle-reaction分辨率。增长模型适合细胞培养实验结果报道之前(30.在甲醇消耗速率和OD_420年随着时间的推移的细胞培养进行了研究。比较适合的模型,如图10,表明选择率参数捕获在10%甲醇的行为。文化的细胞群从OD计算_420年从[痕迹30.)使用的校准点0.41±0.07毫克/毫升OD_420年1.0。在最大增长速率,模型预测甲烷形成565 nmol /毫升×最小(模拟曲线的斜率图10)与372±69 nmol /毫升×分钟测量实验(31日]。模型正确地预测细胞的质量文化(10%以内),它抓住了3:1甲烷有限公司₂流出的比率是正确的氧化还原中间行为所必需的。使用化学计量学3.5质子ATP,作为其他生物(以一些实验71年),会使模型细胞群增长完全匹配实验。

醋酸生长使用不同的甲烷生成途径和速率常数是一个很好的测试。使用RNA表达值acetate-grown细胞和蛋白质的动力学参数从甲醇获得健康,细胞生长的结果以及实验结果120毫米醋酸(31日),如图11获得的。细胞群进入固定相是正确的水平,但增长率是太高了。一氧化碳的模型预测显著增强,它应该转化为有限公司₂这一步会产生更多的电子用于驱动质子跨膜。甲烷产量确定269 nmol /毫升×分钟,小于甲烷生产甲醇的速度,但不少高于实验测量82±31 nmol /毫升×min (31日]。

这个模型代表了一个强大的工具,它能够被用于测试的敏感性细胞生长模型参数如酶复制数字和速率常数。此外,由于增长率可以被认为是一个代理的甲烷产生,了解其对酶的敏感性表达式从生物燃料的角度很有趣。的相对灵敏度,使用标准的计算表达式: 在哪里是可见的(例如,增长率)和参数(如酶拷贝数)。执行这个分析甲醇增长表明,细胞生长速率最敏感的Mcr的拷贝数,为了从最大到最小灵敏度,地铁的拷贝数,Rnf, Fpo, MtaCBA2, HdrDE Mer, MtaCBA1。这表明,增长率是最依赖的速率methyl-coenzyme M可以减少甲烷。这些结果还表明,增长率取决于物种的平衡在分支点,将基板有限公司₂通过地铁或甲烷的反应。这是符合这一事实acetoclastic通路中高度表达下调增长甲基基板,驱动通量,反应在相反的方向。此外,的速度跨膜质子泵和中间体再生(通过Hdr和Rnf)效果显著。最后,不足为奇的是,甲烷产量的强烈依赖于甲醇被带入的速度的增长表明甲烷生成途径依赖Mta蛋白质。

检查的敏感性增长率各种酶复制数字acetate-growth条件下产生不同的趋势,为了降低灵敏度,Mer, Mcr, HdrDE, Rnf和地铁。Mer的敏感性是直接由于反应可以转移远离甲烷通量生产有限公司₂生产。

正在进行的工作在这个模型旨在测试行为等生长基质有限公司MMA、DMA和MMS,作为生长基质的混合物。未来的工作完善参数估计为了更好地捕捉增长速度缺陷等不必要的甲烷生成基因的基因淘汰赛heterodisulfide还原酶是计划31日]。

3.5。转录调控模型

3.5.1。直接的相互作用

直接互动地图,如图12(一个),很大程度上是由塔塔结合蛋白(真沸点),在所有古菌是常见的。其他直接的相互作用在很大程度上被甲基转移酶、固氮作用的蛋白质,蛋白质氧化应激。三个着重结合蛋白(真沸点)被确定甲烷八叠球菌属种虫害和一个实验他们的角色在监管72年]。虽然TBP1需要增长,可能主要的转录监管机构,TBP2和TBP3是可有可无的。这两个不同规范对乙酸和甲醇增长约123个基因,和研究的作者得出结论,低能耗的优化两个转录因子蛋白表达基质(如醋酸)增长(72年]。这些交互图所示12(一个)。

第二种类型的直接交互regulators-those methyltransferases-act作为甲基的介质含有有机化合物进入甲烷生成途径。有单独的甲基转移酶底物,包括甲醇、三甲胺、二甲胺,monomethylamine, methylsulfide。因为甲基转移酶的一些最高度表达基因,它们严格监管保护细胞的能量平衡(28]。相当大的实验努力发现了八methyltransferease具体监管机构(Msr)。Msr的可以作为均downregulators。发现在同行和MsrB,两种蛋白质一致行动MtaCB1上调表达,和淘汰赛的可以防止表达(73年]。同样,淘汰赛排列或msrE将防止MtaCB2表达式73年]。排列和一定程度上的MsrE也抑制MtaCB3 [73年]。Msr的移植一个基因,而其它表达下调的基因;例如,MsrF提高methylsulfide甲基转移酶的表达mtsD所有生长基质除了甲醇,而MsrC增强的表达mtsF当所有三个主要74年,75年]。全套的交互图中可以看到12(一个)。

固氮监管是监管的第三组直接交互。两个广泛守恒的氮调控蛋白命名NrpRI和NrpRII已经研究了Methanosarcinales。在m . mazeiGo1他们发现调节23蛋白质共享一个相似的DNA序列的监管。总体的5%左右m . mazeiGo1基因调控在氮限制的条件下,83个基因在调节(76年]。另一项研究表明,一些在氮限制的条件下调节基因的特定蛋白质(甲胺77年]。然而,支持直接监管的83个基因Nrp监管机构没有建立,这些连接,而不是包含在间接的互动地图。镇压行动的方法被证明是NrpRI结合DNA和NrpRII交互直接与真沸点,阻止RNAP绑定(78年]。重要的是,同系物NrpRI和NrpRII已确定m . acetivorans氮限制与氮下差异表达足够的增长(79年),很可能这些高度保守的相同的氨基酸序列(92 - 94%)监管机构也有类似的功能。额外的两个小RNA (sRNA)分子,sRNA_154年和sRNA_159年其函数是未知,包括Nrp结合位点上游的起始密码子80年]。

最后一组强烈支持交互包括特定的蛋白质参与氧化应激的镇压。启动等人指出[81年],MsvR调节器是同源特征变异Methanothermobacter thermautotrophicus除了43基因msvR基因m . acetivorans包含两个绑定序列上游的TATA盒。他们的研究显示支持为半胱氨酸残基,可能是氧化在富氧的环境中,使二聚体结合位点被释放。

总的来说,直接的交互模型的总数是248,与10监管机构。已知的互动的优势,是由箭头在图的宽度表示12。

3.5.2。间接/虚拟交互

nitrogen-related监管的研究m . mazei(76年)导致了69年的识别差异表达的蛋白质至少三倍(76年,77年]。35岁的蛋白质,参与氮和能量代谢,7是交通系统基因,和10是潜在的监管机构。特别感兴趣的是upregulation的快艇和mtm基因用于甲胺降解生成能量或氨,后者必须从N合成₂在饥饿条件下。因为许多识别基因没有Nrp监管机构的结合位点上游开始的网站,他们很可能由另一个蛋白质。

的一个更令人兴奋的规定,在古生菌sRNA发现目标顺式和反式-编码mrna叫sRNA_162年(82年]。过度的sRNA_162年在m . mazei极大地调节许多甲胺处理蛋白质。工作还涉及一个ArsR家族转录因子作为监管中的中介组件(82年]。同源染色体序列身份高(> 90%)的sRNA和ArsR监管者(基因MA1531)存在m . acetivorans;因此,我们在假设包括相同的互动地图。

MreA (甲烷八叠球菌属调节器energy-converting代谢)最近被牵连的全球监管机构甲烷生成后观察到38倍高表达在醋酸比TMA或甲醇59]。比较研究的比例应变包含甲烷生成蛋白质编码基因敲除的野生型表明,MreA徒上调acetoclastic蛋白质表达下调methylotrophic通路(59),后者是由先前Msr蛋白的表达变化进行了讨论。因此,MreA可以作为甲醇和醋酸利用率之间切换。增加间接报道在报纸上的交互图允许MreA具有最大的假定的基因表达(图的势力范围12 (b))。

镉抗性研究在许多不同的古菌和细菌。一个众所周知的CadC调节器压制镉抗性基因。它是刺激通过Cd来解开^{2 +},Bi^{3 +}和铅^{2 +}(83年]。这是一个特别有趣的监管m . acetivorans生长在醋酸氯化镉的存在显示之间的两年期和5倍增加甲烷生产,可能归因于较高的醋酸激酶和碳酸酐酶,降低磷酸激酶(Pta) (84年]。此外,它已经表明,辅酶M水平大致比例增加到Cd^{2 +}浓度(85年]。的相同器官cadC基因,MA3940,可能调节两个镉流出MA3366和MA3632编码基因m . acetivorans。此外,证据之间存在一个公认的交互CadC或其中一个基因调节和消,家长会和碳酸酐酶。这些交互是前两个图所示12 (b)。

3.5.3。甲烷生成基因调控

简化的两个规则映射到只有那些直接的交互调节甲烷生成基因的表达产量图如图13。从这个图可以看出,两个监管机构(sRNA_162年和MreA)广泛交流与甲烷生成的基因。相关监管机构和甲烷生成蛋白质的跨多个基板(数据未显示)表明三大类别的规定:甲醇,醋酸和其他methyl-containing基质(MMA、DMA、TMA, MMS)。通常规定主题的行动体现两种模式之一,在许多不同的物种:全球监管机构激活/许多基因或压制激活一个或几个基因通过非常具体的互动(86年]。因此,一个可能的积极有效的方法调节代谢可能是有一些全球监管机构能够激活/抑制许多基因,其中一些可能反过来作为特定监管机构能够微调个体的基因表达。

有了这些知识,和假设MreA sRNA_162年监管机构互动的方式提出的文学,它可以假设两国监管机构监管的三个类可以覆盖。在这个假设MreA是一个全球监管机构,促进基质和醋酸甲酯之间切换。它主要通过关闭公司₂醋酸流出途径而打开利用途径。的Upregulation TMA、DMA和MMA利用蛋白质是通过特定的监管机构sRNA的表情_162年关掉MA1531表达,这可能是甲胺的抑制因子基因。

4所示。结论

我们已经表明,SiMPull可以作为一种方法来衡量蛋白质在厌氧生物的数量。这包括基因工程提前标记基因在染色体的基因编码的蛋白质的兴趣,McrG Rpl18p和核糖体蛋白质。使用这种技术我们可以估计单个细胞的蛋白复合物的指数增长阶段重要的数据建模。产甲烷途径与Mcr的独特地位,知识的拷贝数是很重要的代谢动力学建模。核糖体是已知分子拥挤的主要组件之一,其生成准确的数字是重要的在网上产甲烷菌的完整的细胞模型。

使用SiMPull和RNA-seq表达数据的单克隆细胞培养产甲烷菌生长在乙酸和甲醇,我们能够估计的蛋白质数量的甲烷生成途径。耦合产生的细胞群增长反应产甲烷反应,我们能够适应未知的速率常数为增长对甲醇的实验。将模型应用于醋酸增长,我们可以捕捉到正确的时间表使用醋酸和生产甲烷;然而,对数生长期的细胞群的增长率是太高了。

为了模型应用到更复杂的场景,尤其是时变生长基质条件下潜在的环境中,我们需要一个表达的蛋白质的调控机制。研究不同基质导致蛋白表达的相关性观察似乎有三个类型的增长:甲醇,醋酸,另一个甲基衬底(TMA、DMA、MMA和MMS)。对开发一个监管的目标模型,我们收集了已知的转录调控与假定的监管交互创建一个模式草案m . acetivorans。减少了条例草案地图交互与甲烷生成蛋白质编码基因,两个全球监管机构监管机构出现。MreA似乎acetoclastic通路和公司之间切换₂假设流出途径,因此作为acetoclastic增长和methylotrophic增长之间切换。sRNA_162年似乎打开利用所必需的主要基因的表达,因此,优化生物甲胺的增长。

这里的物理和化学性质和动力学模型报道补充代谢重构和构成重大进展一个完整的计算模型m . acetivorans。空间异质性,如造成大克劳德核糖体,是导致随机效应相似的细胞单克隆文化;因此,量化数量和分布是必要的。在甲烷生成发生在细胞膜,因为许多反应特性转化由于当地环境可能产生重大影响。更大的空间组织,如膜结合蛋白质复杂的位置和数量,可以由冷冻电子断层扫描。这样的数据可以使用这里开发的动力和监管模式构建详细完整的细胞反应扩散模型已经在前面创建类似[87年]。这样的模型可以研究生物个体的特性转化。最终,这些模型可以用于混合反应扩散主方程/通量平衡分析技术(88年)提供完整的代谢建模与空间效果由于细胞培养的组织。计算模型的效用是他们应该很容易扩展到另一个甲烷八叠球菌属spp。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢约翰·a·科尔帮助回顾本文以利亚罗伯茨的代码段细胞以及初始DIC测量。这项工作是支持的科学办公室(BER),美国能源部批准号DE-FG02-10ER6510,美国宇航局天体生物学研究所资助。NNA13AA91A (zl, PL)和DE-FG02-02ER15296 (WWM JRE, PRAK)国立卫生研究院(NIH)赠款AI083025 u - 19和GM065367 (TH和AJ)和国家科学基金会(NSF)物理前沿中心批准号phy - 0822613 (TH和zl)和分子生物物理学训练批准号小灵通5 T32 GM008276 (JRP)。

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