的发展β内酰胺酶作为一种工具来监控条件Tetracycline-Riboswitch基因表达的甲烷八叠球菌属acetivorans

文摘

使用报告基因融合蛋白等细胞过程评估目标和监管建立了转录或翻译技术在古细菌,细菌,eukaryal遗传学。荧光蛋白或酶的显色底物营业额,β牛乳糖,对微观和筛选的目的尤为有用。然而,应用程序的方法是有限的使用严格厌氧生物由于对发色团分子氧的要求形成或颜色发展。我们已经开发了β内酰胺酶从大肠杆菌(编码bla)与显色底物nitrocefin记者系统可用在厌氧条件下的产甲烷archaeon甲烷八叠球菌属acetivorans。通过使用一个假定的鞭毛蛋白的信号肽m . acetivorans和不同分解代谢的推动者,我们可以证明增长substrate-dependent分泌β内酰胺酶,促进其使用在殖民地筛查琼脂板上。此外,一系列的融合组成的组成型启动子和序列编码合成的变体tetracycline-responsive riboswitch (tc-RS)是用来描述在翻译起始的影响m . acetivorans。一tc-RS tetracycline-dependent监管,“碳足迹”变异导致超过11倍bla表达式,它是由天然riboswitches监管的范围。因此,tc-RS融合代表第一只独联体活跃,factor-independent系统控制古生菌的基因表达。

1。介绍

产甲烷古菌,一个单元组严格厌氧古生菌,负责绝大多数的生物产生甲烷。甲烷生成过程,不仅是高度相关的以人类为中心的问题,诸如气候变化、可持续能源战略、废物处理、农业也在全球碳循环中扮演着重要的角色,因为它回收有机物厌氧好氧环境(1(其中和引用)。产甲烷菌转化为中间体的厌氧生物降解,如H₂+有限公司₂,甲酸,乙酸,甲基化化合物甲烷通过不同的重叠的途径,并通过化学渗透假说的夫妇这一过程节能机制(2,3]。在甲烷八叠球菌属物种,从甲基甲烷生成化合物,如甲醇或主要收入的转移甲基辅酶M (CoM)通过substrate-specific甲基转移酶(4)和随后的减少methyl-CoM甲烷(5]。

产甲烷菌包括古菌中为数不多的几个基因容易处理组(6),从而提供杰出的生物模型研究这种所谓的“第三的生命形式。“尽管进展为产甲烷菌的遗传操作(开发工具7- - - - - -9),许多强大的技术通常应用于细菌遗传学尚未适应这个群体。例如,使用颜色筛选突变体库β牛乳糖(lacZ基因产物)和基质模拟半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl -β-D-galactopyranoside)记者系统已经使用了几十年的细菌。在产甲烷菌,lacZ和uidA(编码β葡萄糖醛酸酶从大肠杆菌)也可以作为报告基因10,11]。然而,形成各自的显色乳沟产品(靛蓝染料)需要氧气的存在。因此,对于颜色的产甲烷突变体筛选固体媒体,殖民地必须暴露在氧气要求镀复制品或一定程度的宽容对氧(12,13]。避免暴露严格厌氧的要求甲烷八叠球菌属在空气中,我们报告在一个color-screenable报告基因系统活跃在氧气存在的情况下。

可控制的基因表达系统也强大的遗传工具。虽然多种这样的系统可供产甲烷古菌,其中大部分涉及内源性代谢促进剂的使用,因此改变培养条件(例如,开关的能量底物或氮源)需要实现感应或镇压感兴趣的基因的转录14- - - - - -17]。迄今为止唯一的例外是一个人工混合启动子的转录监管机构TetR TetR结合位点tetO,Tn的一部分10耐四环素(tc)编码系统大肠杆菌(18]。通过TetR结合位点插入强劲,持续表达mcrB启动子(mcrB_P的第一个基因)控制mcrBCDGA操纵子编码methyl-CoM还原酶m·巴氏细菌(19),这种混合启动子的控制下的基因表达tc-dependentm . acetivorans自然,这是tc-resistant [20.]。因此,要使用这个系统,实现tc-dependent基因调控TetR coexpressed。

Riboswitches RNA-based监管元素,控制大量的代谢基因中经常发现的细菌(UTR)基因5′端非翻译区相关配体的新陈代谢或运输他们回应。他们是由一个适配子域传感细胞代谢物的浓度和一个表现的平台,它读取适配子域名的绑定状态切换或关闭基因表达(21]。Riboswitches以前只预测信息角度对古生菌(22,23]。最近,一个fluoride-riboswitch证实了遗传分析Thermococcus kodakarensis(t . j . Santangelo个人通信)。合成riboswitches已经改造的条件控制基因表达在细菌和eukaryal系统(24]。类似于自然,他们认识到一个小分子配体通过一个适配子域高亲和力和特异性和控制基因的表达,他们居住在翻译起始,pre-mRNA拼接或信使rna的稳定性。从蛋白质的因素以及独立能力提高合成绑定域(寡核苷酸适配子)反对任何配体的选择(这一过程称为SELEX, (25,26])导致的普遍实现RNA-based监管者控制设计合成生物学领域的(24]。

的tc-binding适配子被雇佣为合成riboswitch在酵母基因表达的条件控制27]。它由三个螺旋P1-P3,拦截了单链区域。多个接触tc和核苷酸单链区域位于导致pM极其紧密的结合常数范围(28]。插入一个信使rna 5′UTR,适体干扰扫描核糖体,但只有当它的配体是绑定(29日]。进一步,当适体插入接近5′的内含子剪切位点干涉其配体的形式与剪切位点识别,转换基因表达(30.]。在这个例子中,最著名的规定得到完整的拼接时网站包括关闭阀杆内的适体。呼吸的干细胞没有配体允许拼接和稳定的适配子在配体结合阻止它,使拼接网站无法访问。在目前的研究中,我们采用了tc-RS作为合成riboswitch条件控制基因的表达m . acetivorans。通过将各距离tc-RS核糖体结合位点的下游基因,我们可以观察调节的动态范围。

2。材料和方法

2.1。菌株和生长条件

大肠杆菌生长在标准条件下(31日]。m . acetivorans菌株,列在表1是生长在高盐培养基(描述32]。甲醇(125毫米)或三甲胺(50毫米)作为经济增长的能源。固体培养基含有1.5% (w / v) Bacto琼脂(BD,海德堡)。选择的嘌呤霉素转乙酰酶基因(pac圣地亚哥)嘌呤霉素(CalBiochem CA)从无菌添加,厌氧股票的最终浓度2μ克毫升⁻¹。嘌呤模拟8-aza-2 6-diaminopurine(σ,圣路易斯,密苏里州)从无菌添加,厌氧股票的最终浓度20μ克毫升⁻¹选择对次黄嘌呤phosphoribosyl转移酶基因(成)。Tc或强力霉素(阿霉素)从无菌添加,厌氧股市在200年最终的浓度μ当tc-RS-dependent M(或显示)bla翻译评估。的增长m . acetivorans光度计的监测在578 nm (OD_578年)。

2.2。分子方法,质粒构建和转换

标准的分子方法被用于操纵的质粒DNA大肠杆菌(33]。使用的所有质粒,除了pWM321,当时m . acetivorans和表中列出1。自主复制(pWM321),或集成的染色体m . acetivorans,被选为嘌呤霉素。的质粒pMR56插入成轨迹的m . acetivorans(通过截短等位基因同源重组)是由取代生成的bla盒(用于选择氨苄青霉素的耐药性大肠杆菌)从pET28a pAMG48卡那霉素抗性的磁带(+)(Novagen)。的bla基因大肠杆菌编码在pBR322放大了PCR没有信号肽序列,克隆pMR56,导致pBlaN。在那里,bla基因的控制下mcrB_P(34]。一个变种bla之前是公认的信号肽编码序列的假定的吗m . acetivorans鞭毛蛋白MA3061也构造和指定pBlaNFSP。质粒pMG3由取代mcrB_P在pBlaNFSP会于长滩举行一个kb的序列前mtaC1(MA0456)编码的corrinoid蛋白质methanol-specific甲基转移酶MT1 [35,36]。获得质粒pP0145NFSP,mcrB_P在pBlaNFSP取代会于长滩举行一个kb的序列前mtmC1(MA0145)编码的corrinoid蛋白质monomethylamine-specific甲基转移酶MT1 [35]。pBlaN-prom被删除了mcrB_p获得一个向量β内酰胺酶表达作为一种消极的控制。启动子缺失,pBlaN消化BglII心好,钝化和religated。

三个tc-RS编码质粒pBlaN_tc-RS1、pBlaN_tc-RS3 pBlaN_tc-RS5通过交叉PCR过程(构造39]。在第一步中,两个不对称但重叠PCR片段生成。pBlaN被用作模板片段1编码mcrB_p没有核糖体结合位点(苏格兰皇家银行)和5′tc-RS结束。pSP64-tc-minimer [28)编码tc-aptamer用于一代的片段2包含tc-RS苏格兰皇家银行。在第二步中,片段退火的重叠区域,放大了PCR作为一个单独的片段,使用的引物PCR(底漆pBlaN_fwd,要么tc1_RBS_rev、tc2_RBS_rev或tc3_RBS_rev,看到网上的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/725610)。通过BglII片段被克隆,pBlaN心好。其他tc-RS编码质粒也通过交叉PCR构建过程。两个重叠的PCR片段生成序列两侧BglII,心好编码mcrB_P- - - - - -tc- - - - - -RS- - - - - -苏格兰皇家银行融合产生的前体构建(tc-RS2从tc-RS1 tc-RS4a从tc-RS3和tc-RS4/4b tc-RS4a),从而引入所需的核苷酸交流使用的引物(补充表S1)。

基因组DNA从m . acetivorans是孤立的使用修改后的鲸蜡trimethylammonium bromide-NaCl方法(40]。没有标记的染色体中插入m . acetivorans经杂交(南部41使用探针杂交的]bla基因。所有获得的DNA序列PCR(补充表S1)列出了引物测序证实了在阶跃恢复二极管(坏的小礼帽,德国)使用BigDye终结者循环测序协议(美国应用生物系统公司,培养)。大肠杆菌被电穿孔转化(42]。Liposome-mediated转变m . acetivorans进行了描述(38)、修改(43]markerless记者结构插入m . acetivorans基因组(12]。

2.3。报告基因产品活动

对于定性检测β内酰胺酶(Bla)活动文化,细胞溶解产物,或文化上层清液,nitrocefin(美国圣地亚哥CalBiochem)从厌氧无菌添加1毫米原液(准备根据制造商的指令)20μ在室温下M和孵化为10 ~ 30分钟。文化文化的上层清液是由离心20分钟1500×g和上层清液的转移到新的厌氧管。细胞沉淀溶解在去离子水(1/20的原始文化卷)10分钟和溶菌产物被带到原始文化与高盐介质的体积保持相同的蛋白质浓度在原始文化。Bla-dependent颜色开发/殖民地在琼脂板、nitrocefin股票从喷鼻剂容器分散到殖民地后板上m . acetivorans了(nitrocefin不稳定超过2 - 3 h HS中)。细胞没有宽松的可行性的治疗,因为殖民地可以多尝试。Bla量化的m . acetivorans在OD,细胞被离心收获_578年0.4 - -0.5和osmotically细胞溶解,添加分析缓冲区(100毫米磷酸钾缓冲,1毫米EDTA, pH值7.0)包含0.1μ克毫升⁻¹DNaseI。在冰上30分钟孵化后,溶解产物被re-centrifugation清除。50μL的清除溶解产物是添加到850年μL分析缓冲区和平衡5分钟前在室温下测定是100年开始增加μL 100年μM nitrocefin解决方案。nitrocefin水解的初始速率为300秒记录在486 nm和特定Bla活动计算nitrocefin摩尔消光系数(= 20500⁻¹厘米⁻¹)。被纠正的值减去那些获得应变上海步浪没有启动子(pBlaN-prom),生长在相同条件下tc-RS-carrying菌株。蛋白质浓度测定方法的布拉德福德(44)使用牛血清白蛋白作为标准。

3所示。结果与讨论

3.1。合成和分泌活跃β内酰胺酶在m . acetivorans

建立在m . acetivorans显色记者颜色发展系统不需要氧气bla基因大肠杆菌被选中,是因为一个显色底物βnitrocefin内酰胺酶,是商用。的乳沟β内酰胺环,它经历了一个独特的颜色从黄色(在pH值为7.0 nm)红色(在pH值为7.0 nm)。此外,Bla周质的蛋白质大肠杆菌允许其潜在分泌细胞,促进其检测。为了避免干扰plasmid-borne选择标记用于克隆大肠杆菌与氨苄青霉素抗性分析盒式首次取代了卡那霉素抗性录音带。因此,矢量骨干不需要集成到后从染色体中删除m . acetivorans染色体。使用这个向量(pMR56)bla基因,缺乏其自然信号肽编码序列,提出了本构methanoarchaeal强的控制mcrB_P并放置到m . acetivorans染色体(图1(一))。作为外生的乳沟生色Bla基质,因此,颜色开发,需要细胞溶菌作用或Bla排泄bla变体编码的蛋白转位信号肽(从MA3061 pBlaNFSP)也被创建并放置到m . acetivorans染色体(图1(一))。两个菌株合成活性Bla就是明证nitrocefin乳沟细胞溶解产物化验时(图1 (b),“E”)。在应变合成Bla没有信号肽(pBlaN) nitrocefin乳沟是文化或文化上层清液,观察颜色在未经处理的开发文化和花中当Bla包含一个热点公认的信号肽(pBlaNFSP)。在一起,这些数据表明,(我)Bla活动m . acetivorans是足够稳定的高盐中允许视觉检测,(ii)的氨基酸序列使用((M) WNTFSKDEKGFTG)是一种功能性蛋白出口信号m . acetivorans,(iii) Bla大肠杆菌是改变了m . acetivorans细胞质膜的函数形式。颜色发展成为可见的孵化后10 ~ 30分钟。然而,长时间的潜伏期(> 3 h)导致平原温和的颜色开发中表示无生命的乳沟β内酰胺的nitrocefin(数据未显示),这可能是由于高度降低的条件中。此外,隔夜孵化导致完全丧失任何颜色表明nitrocefin水解在这漫长的孵化。因此,nitrocefin不能包括在中期间增长的有机体。

(一)

(b)

(一)
(b)

图1

β m . acetivorans 上海步浪 bla β fsp mcrB _P mcrB sps m . acetivorans bla 大肠杆菌 μ 的合成内酰胺酶在。(一)方案(基因编码内酰胺酶,缺乏信号肽的序列)融合插入到宿主染色体;:序列编码假定methanoarchaeal鞭毛蛋白信号肽;:methanoarchaeal启动子;苏格兰皇家银行(RBS):核糖体结合序列;:信号肽编码序列。(b)厌氧乳沟的nitrocefin文化(C),文化上层清液(S)和细胞溶解产物(E)菌株携带没有(pBlaN)或(pBlaNFSP)公认的热点信号肽序列的染色体,或者氨苄青霉素抗性磁带在自我复制的质粒(pWM321),分别;显示部分文化管孵化20分钟后在室温下的20倍M nitrocefin。

3.2。增长Substrate-Dependent合成β内酰胺酶在m . acetivorans

实现增长substrate-dependent记者合成m . acetivorans,强劲的本构mcrB_P前bla交换了mtaC1_P(pMG3),从而导致高表达的基因控制在甲醇的存在(19),mtmC1_P(p0145NFSP),这将导致methylamine-dependent表达的基因控制的。质粒被集成到m . acetivoransC2A Bla合成染色体检查和由此产生的菌株。甲醇(或methylamine-dependent合成和分泌Bla的确可以观察到液体文化两株(图2(一个))。当菌株都有在琼脂板包含的生长基质,只有殖民地的应变窝藏p0145NFSP明显规范bla表达式(图2 (b))。应变窝藏pMG3发达的颜色在这两种条件下(图2 (b)),这是由于在琼脂,一些能源存在,通过甲醇利用代谢途径(19导致甲醇利用机械的感应而生长在methylamine-containing琼脂板上。增长的电镀过程m . acetivoransagar-free表面,其中包括在硝化纤维过滤器和过滤的细胞孵化media-soaked滤纸上,已经建立(19),必须使用与pMG3获得殖民地不事生产Bla没有甲醇。目前,五反式行为因素,同行,MsrB MsrC,排列,MsrE,已知的规范表达基因编码三个methanol-specific MT1亚型MtaCB1, MtaCB2, MtaCB3转录起始的水平(45]。监管的methanol-specific MT1亚型也在转录后的级别(46),但所涉及的因素(s)是未知的。转录组分析证明substrate-dependent mono的监管,di和trimethylamine-specific MT1亚型m . mazeiGo1,Methanococcoides burtonii,m . acetivorans,Mtm (47- - - - - -49),但因素也并不清楚。因此,本文提供融合结构将合适的工具来识别影响因素甲醇——随机功能丧失和methylamine-dependent监管的诱变34]。因为mtaC1_P- - - - - -fsp- - - - - -bla融合(pMG3)表达在琼脂缺乏甲醇,其使用(至少在这些条件下)将被限制在确定突变体不表达bla已经失去了的,突变体(一)转录激活因子(s)mtaC1_P端依赖表达式。至于methylamine-dependent监管,正面和负面的效应物mtmC1_P表达式可以使用的寻求mtmC1_P- - - - - -fsp- - - - - -bla琼脂媒体融合(p0145NFsP)和标准。这样的努力正在进行中在我们的实验室报告,并将在别处。

(一)

(b)

(一)
(b)

图2

m . acetivorans mcrB _p fsp 上海步浪 mtaC1 _P fsp 上海步浪 mtmC1 _P fsp 上海步浪 增长substrate-dependent nitrocefin乳沟。文化的与pWM321转换(负控制)、pBlaNFSP(积极的控制,- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -),pMG3 (- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -)和pP0145NFSP (- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -)是生长在甲醇(M)或三甲胺(T)和化验Bla(见材料与方法)在液体培养(a)或琼脂板上裸奔和增长之后包含各自的衬底(b);显示部分文化管(a)和盘子(b) 20分钟后在室温下孵化nitrocefin的存在。

古生菌和细菌一样采用两种途径蛋白质易位,Sec和乙(双精氨酸主题)通路(50]。在前基板的展开过程中,后者把(至少部分)成熟的蛋白质。因为Bla大肠杆菌通过证交会是周质蛋白和分泌通路,我们标记从一个公认的鞭毛蛋白的氨基端信号肽编码在吗m . acetivorans基因组(MA3061),假设它将进行相应的途径,尽管有机体是不动的51]。在产甲烷球菌属物种,preflagellins的氨基端信号肽被分离的IV型prepilin肽酶则在膜易位(52,53]。因此,任何蛋白质容易受到Sec途径可以产生和分泌m . acetivorans(没有信号肽),这将极大地促进净化方面付出的努力。古生菌,这样一个系统蛋白质生产过剩加上分泌迄今为止只在hyperthermophilic建立Thermococcus kodakarensis(54]。

3.3。发展tc-Responsive Riboswitch条件基因表达m . acetivorans

监管的信使核糖核酸的翻译为古生菌天然riboswitches尚未报道。tc-RS,融合到一个群龙无首记者mRNA的嗜盐的archaeonHaloferax volcanii,完全抑制翻译即使在tc的缺席,这是作为证据,也形成了一个稳定的高盐细胞质的结构,生物(55]。测试是否可以使用tc-RS methanoarchaea作为一种手段来控制基因的表达独联体(图3(一个)),其编码序列插入mcrB_P的mcrB_P- - - - - -上海步浪融合(pBlaN),立即上游的苏格兰皇家银行(图3 (b),tc-RS1),构造上m . acetivorans染色体。Bla活动现在可以被用作衡量tc-dependent翻译的bla信使rna(表2)。控制相比没有tc-RS (pBlaN),bla信使核糖核酸的翻译没有tc增加了2.5倍,这并不少见,可能由于mRNA的增加稳定在一个结构化元素RNA 5′末端的细菌信使RNA (56]。在tc的存在,Bla活动降低了2.6倍,表明tc-bound适体干扰的翻译bla信使rna, sterical障碍可能的苏格兰皇家银行的认可。这类似于规定观察pre-mRNA拼接同样riboswitch [30.]。那里,旁边的适配子是插入5′拼接的网站。监管的拼接是强烈依赖于距离的适体拼接站点和关闭阀杆的稳定性。的最佳监管pre-mRNA拼接接头时获得的网站是完全集成在关闭阀杆(30.促使我们先后将苏格兰皇家银行前bla的关闭阀杆tc-RS,导致构造tc-RS2 tc-RS5 2, 3, 4,分别包括和6个核苷酸(图3 (b))。相应的配对碱基改变(图3 (b),在紫)。包括苏格兰皇家银行的关闭阀杆1,2,3核苷酸(tc-RS1、tc-RS2 tc-RS3)先后降低Bla活动(,和μ毫克⁻¹、职责;见表2)表明一般稍微降低了访问的核糖体结合位点。确凿的这个概念是苏格兰皇家银行的观察使用tc-RS5感动六核苷酸tc-RS的关闭阀杆,这几乎完全废除Bla活动(表2)。显然,核糖体RNA元素完全封锁了从这个结构。此外,构造tc-RS2和tc-RS3 tc-RS1相比并没有显示出一种改进的监管(1.8——2.7倍)。构建tc-RS4四核苷酸关闭阀杆内的苏格兰皇家银行是特殊的,因为它导致Bla活动相比增长了10倍mcrB_p(pBlaN)。这可能解释这个变异缺乏两个相邻CG碱基对P1出现在其他中心的关闭阀杆的结构导致不稳定(G (P1 =−4.4千卡/摩尔,表2)。尽管高Bla活动没有配体,存在tc显著降低Bla活动水平相比其他构造导致调节基因表达,“碳足迹”超过11倍。

(一)

(b)

(一)
(b)

图3

bla 上海步浪 m . acetivorans mcrB _P mcrB tc-RS-regulated翻译信使rna。左:tc-RS编码方案融合插入到染色体;右:tc-RS变异分析研究(tc-RS1 tc-RS5);为简单起见,只有关闭阀杆P1和邻近的苏格兰皇家银行(绿色)显示,基地从前体结构所示紫色;:methanoarchaeal启动子。

基于tc-RS4,两个进一步的结构设计。tc-RS4a tc-RS4b,关闭阀杆被另一个细长的碱基对(tc-RS4a: GC, tc-RS4b: AU)。然而,伴随着减少额外的碱基对Bla活动不论其稳定性(和μ毫克⁻¹tc-RS4a和tc-RS4b职责)。监管在tc为2.6和2.0倍,分别构造tc-RS1-tc-RS3的范围。进一步稳定增加茎的长度9个碱基对导致进一步减少Bla合成和完全丧失tc-dependent监管(数据没有显示)。

所有tc-RS变体融合mcrB_P这里调查6导致tc-dependent表达bla。此外,Bla活动缺乏tc和tc-dependent监管动态范围的不同结构对所有参数测试(茎长度和稳定,苏格兰皇家银行对阀杆的位置,表2)。的数据表明,较低的稳定关闭阀杆(没有邻近的GC碱基对)和苏格兰皇家银行的部分包含到茎Bla来说都是有益的活动和监管。这里的变异测试tc-RS4显然具有最优特征导致的监管(近12倍),这是自然发生的范围之内riboswitches控制信使核糖核酸的翻译。

3.4。的tc-Responsive Riboswitch Ligand-Specific摄入量有关在活的有机体内

作为在活的有机体内监管tc-RS4变体是最高的配体的特异性和动态监管进一步评估。tc-RS高度特定的tc和缺乏羟基位置R₆β,导致阿霉素,减少适配子绑定两个数量级以上(0.8 nM tc和强力霉素118 nM) (28]。解决特异性细胞窝藏tc-RS4构造是生长在没有或200年的存在μ米阿霉素Bla活动之前评估。虽然存在tc在中导致ca。十二倍减少Bla活动,阿霉素没有影响Bla活动;在缺乏抗生素μ毫克⁻¹,在阿霉素的存在μ毫克⁻¹测定。这个观察是完全按照各自的离解常数tc-RS确定在体外。在使用的浓度(200μ阿霉素),形成ligand-stabilized适配子不发生由于较低的亲和力,因此bla翻译不是压抑。很可能观察到的效应是由于低效率的阿霉素的吸收m . acetivorans因为这种化合物有效地调和在活的有机体内除抑制的人工mcrB_P(tetO)/ TetR系统在这种生物20.]。

调查riboswitch监管的动力学,细胞窝藏tc-RS4融合是生长在之前的存在越来越多的tc Bla活动决心(图4)。显著减少Bla活动已经可以观察到7点μM tc。Half-maximal减少bla翻译是观察到ca。14μM tc和50之间μ米和100μM tc,最大的镇压翻译实现(图4)。这些数据符合所需的浓度在酵母完成镇压[27]。有趣的是,它也在同一范围的tc完全去抑制人工所需浓度mcrB_P(tetO)/ TetR系统在活的有机体内70年(ca。μ米)(20.]。

图4

bla m . acetivorans mcrB _p tc 卢比 上海步浪 用药剂量tc-RS4-mediated镇压信使核糖核酸的翻译。带着- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -- - - - - -构造染色体是种植在不同数量的tc的存在特定Bla活动评估。

4所示。结论

这项工作表明,β内酰胺酶一起nitrocefin可以使用甲烷八叠球菌属作为一个严格的厌氧条件下显色的记者。的bla基因可能是任何启动子融合允许方便的监测其表达式。分泌记者可能会进一步援助筛选目的,像识别反式活跃的突变,在稳固的媒体。进一步,建立完全独联体活跃tc-responsive riboswitch在甲烷八叠球菌属现在允许有条件的控制基因表达而不需要额外的因素,代表了第一个合成中描述riboswitch古生菌。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢威廉·w··梅特卡夫(质粒pAMG48乌尔班纳,美国)。这项工作是支持由德意志Forschungsgemeinschaft学士和核磁共振(通过579年SFB、SFB902和SU402/4-1)。

补充材料

引用

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